成都市54025例早產(chǎn)兒葡萄糖‐6‐磷酸脫氫酶缺乏癥篩查結(jié)果及分子遺傳學(xué)特征分析

姜舟 王梅 唐立 李曉麗 李春榮 程昕然

（電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦女兒童醫(yī)院/成都市婦女兒童中心醫(yī)院1.新生兒疾病篩查科；2.保健部；3.內(nèi)分泌遺傳代謝科，四川成都 611731）

葡萄糖 ‐6‐磷酸脫氫酶（glucose‐6‐phosphate dehydrogenase, G6PD）缺乏癥，是X染色體連鎖不完全顯性遺傳病。G6PD缺乏癥是新生兒高膽紅素血癥常見和重要的危險(xiǎn)因素，也是G6PD缺乏癥高發(fā)區(qū)新生兒膽紅素腦病的主要病因，且早產(chǎn)兒表現(xiàn)重于足月兒[1]。通過新生兒疾病篩查檢測(cè) G6PD 活性可早期發(fā)現(xiàn)、診斷和防治G6PD缺乏癥。目前成都地區(qū)G6PD篩查的流程對(duì)早產(chǎn)兒與足月兒完全相同，是否需要根據(jù)早產(chǎn)兒自身特點(diǎn)對(duì)現(xiàn)有的篩查流程進(jìn)行調(diào)整是下一步工作需要考慮的問題。本文擬通過回顧性研究成都市2015年1月1日至2019年12月31日進(jìn)行篩查的54 025例早產(chǎn)兒G6PD缺乏癥篩查情況，為成都市早產(chǎn)兒篩查工作改進(jìn)提供建議。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2015年1月1日至2019年12月31日成都市早產(chǎn)兒G6PD篩查結(jié)果。研究對(duì)象為在此期間成都市新生兒疾病篩查中心管轄范圍內(nèi)23個(gè)區(qū)市縣出生的所有活產(chǎn)早產(chǎn)兒，并進(jìn)行了新生兒疾病篩查者，共計(jì)54 025例。主要分析上述早產(chǎn)兒的G6PD篩查數(shù)據(jù)及可疑陽(yáng)性者的G6PD基因檢測(cè)結(jié)果。本研究征得新生兒監(jiān)護(hù)人的知情同意，均簽署新生兒疾病篩查知情同意書及基因檢測(cè)同意書。

1.2 標(biāo)本采集

按照2009年國(guó)家衛(wèi)生部頒布的《新生兒疾病篩查管理辦法》[2]，新生兒出生72 h后，在其足跟外側(cè)采血，滴于專用采血濾紙片（Whatman903TM，F(xiàn)H‐A‐01型，廣州豐華生物工程有限公司），正面滲透至背面，共采集4個(gè)血斑。將血片置于室內(nèi)水平位置自然通風(fēng)，避光、避免紫外線及臭氧影響，晾干后裝入塑料袋內(nèi)封口，置于2~8℃ 冰箱保存，每周 1次快遞到成都市新生兒疾病篩查中心行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.3 篩查及確診

1.3.1 篩查方法篩查試劑和儀器使用廣州豐華公司提供的G6PD 測(cè)定試劑盒（熒光分析法）及Auto TRFIA‐4，檢測(cè)G6PD酶活性。篩查切值男性：2.8 U/g Hb，女性：3.3 U/g Hb。初篩值低于以上水平即為初篩陽(yáng)性患兒，需通知患兒回篩查中心進(jìn)行確診。

1.3.2 確診方法以下任意1種方式均可確診：（1）G6PD酶活性測(cè)定法：試劑使用北京利德曼生化公司提供的酶法試劑盒，儀器為日立008AS全自動(dòng)生化分析儀?；純红o脈血G6PD酶活性值＜1 300 U/L即可確診G6PD缺乏癥。（2）基因診斷法確診：使用宏石SLAN‐96S全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)，廈門至善生物科技有限公司的G6PD基因突變檢測(cè)試劑盒（熒光PCR溶解曲線法）進(jìn)行檢測(cè)。該試劑盒包含9種我國(guó)最常見的致病性變異[1]。檢測(cè)到G6PD基因突變即可確診G6PD缺乏癥。對(duì)酶活性檢測(cè)陽(yáng)性而基因檢測(cè)陰性的患兒，進(jìn)行一代測(cè)序?qū)ふ矣袩o(wú)新的突變位點(diǎn)。

1.3.3 G6PD缺乏癥致病性變異分類標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)相關(guān)表型，將G6PD缺乏癥的致病性變異分為Ⅰ~Ⅳ類：Ⅰ類致病性變異導(dǎo)致酶活性嚴(yán)重缺乏（酶活性＜正常值下限10%）伴先天性非球形細(xì)胞溶血性貧血；Ⅱ類致病性變異導(dǎo)致酶活性嚴(yán)重缺乏（酶活性＜正常值下限10%）；Ⅲ類致病性變異導(dǎo)致酶活性輕中度缺乏（酶活性為正常值下限的10%~60%）；Ⅳ類致病性變異導(dǎo)致酶活性輕度降低或正常（酶活性為正常值下限的60%~150%）[1]。本中心酶活性正常值為男性≥2.8 U/g Hb，女性≥3.3 U/g Hb。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；采用Cochran‐Armitage趨勢(shì)檢驗(yàn)分析G6PD發(fā)病率與出生年份是否存在線性關(guān)系；多組基因突變位點(diǎn)致病性分類情況比較采用Kruskal‐WallisH檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步兩兩比較則采取Bonferroni法，調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.0167為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成都地區(qū)早產(chǎn)兒G6PD缺乏癥篩查結(jié)果

2015年1月1日至2019年12月31日成都市活產(chǎn)早產(chǎn)兒共計(jì)54 188例，進(jìn)行G6PD缺乏癥篩查54 025例，篩查率99.70%。檢出可疑陽(yáng)性患兒299例，初篩陽(yáng)性率為5.53‰（299/54 025），其中男262例，女37例。召回213例，召回率71.2%（213/299），其中男192例，女21例。確診G6PD缺乏癥患者192例，發(fā)病率為3.55‰（192/54 025），其中男178例，女14例，男女比例為12.7 : 1。21例復(fù)查結(jié)果正常，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值90.1%（192/213）。通過診斷性酶活性檢測(cè)法確診患兒112例，通過基因診斷法確診患兒80例。比較不同性別患兒采用不同檢測(cè)方法的確診符合率，發(fā)現(xiàn)女性患兒采用基因檢測(cè)法的確診符合率高于酶活性檢測(cè)法（P=0.016），但對(duì)于男性患兒而言無(wú)差異（P＞0.05）。見表1。

表1 不同性別不同檢測(cè)方法確診符合情況比較[%（n/N）]

2.2 早產(chǎn)兒G6PD缺乏癥發(fā)病情況

2015~2019年，成都市早產(chǎn)兒G6PD缺乏癥發(fā)病率為3.55‰（192/54 025），高于同期篩查的足月兒（篩查881 749例，確診2 682例，發(fā)病率3.04‰），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.362，P=0.037）。2015~2019年，每年早產(chǎn)兒G6PD缺乏癥的發(fā)病率分別為1.88‰（16/8 494）、3.75‰（45/12 004）、3.39‰（39/11 514）、3.50‰（38/10 847）、4.84‰（54/11 166）。采用Cochran‐Armitage趨勢(shì)檢驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)成都市早產(chǎn)兒G6PD缺乏癥發(fā)病率有逐年增高的趨勢(shì)（χ2=5.816，P=0.040）。

2.3 季節(jié)、胎齡和出生體重對(duì)G6PD缺乏癥初篩陽(yáng)性率的影響

夏季出生（6~8月）的早產(chǎn)兒初篩假陽(yáng)性率為19.4%（13/67），高于其他3個(gè)季節(jié)出生的早產(chǎn)兒（5.5%，8/146），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.513，P=0.004）；但夏季出生的早產(chǎn)兒G6PD缺乏癥發(fā)病率（4.07‰，54/13 283）與其他3個(gè)季節(jié)出生的早產(chǎn)兒發(fā)病率（3.39‰，138/40 742）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.117，P=0.291）。

對(duì)春、秋、冬季出生40 742例早產(chǎn)兒按出生胎齡不同分為胎齡＜32周組和胎齡≥32周組；按出生體重（birth weight, BW）不同分為BW＜2 500 g組和BW≥2 500 g組。比較其初篩假陽(yáng)性發(fā)生情況及確診情況可見：胎齡＜32周早產(chǎn)兒初篩假陽(yáng)性率為33.3%（3/9），高于胎齡≥32周早產(chǎn)兒（3.6%，5/137），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.208，P=0.002）；胎齡＜32周早產(chǎn)兒發(fā)病率為3.40‰（6/1 764），胎齡≥32周早產(chǎn)兒發(fā)病率為3.39‰（132/38 978），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.000，P=0.994）。BW＜2 500 g組初篩假陽(yáng)性率為12%（7/57），高于BW≥2 500 g組（1%，1/89），差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（χ2=6.336，P=0.012）；BW＜2 500 g組的發(fā)病率（2.70‰，50/18 550）低于BW≥2 500 g組（3.97‰，88/22 192），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.828，P=0.028）。胎齡＜32周且BW＜2 500 g組的初篩假陽(yáng)性率及發(fā)病率數(shù)據(jù)與胎齡＜32周組完全一致，故未再進(jìn)行胎齡聯(lián)合BW的分組比較。

2.4 成都地區(qū)早產(chǎn)兒G6PD缺乏癥基因突變分布情況及臨床表現(xiàn)

87例初篩陽(yáng)性患兒進(jìn)行基因檢測(cè)（男75例，女12例），其中80例檢出基因突變（男69例，女11例），7例未檢測(cè)出基因突變（男6例，女1例）。共檢出9種基因突變：c.1388G＞A、c.1376G＞T、c.1024C＞T、c.871G＞A、c.1360C＞T、c.392G＞T、c.487G＞A、c.95A＞G、c.517T＞C。未檢出復(fù)合雜合突變，女性患兒未檢出純合突變。檢出率最高的前3種基因突變類型為：c.1388G＞A 26例（32%），c.1376G＞T 21例（26%），c.1024C＞T 13例（16%），共占比75%（60/80）。對(duì)初篩陽(yáng)性而基因檢測(cè)陰性的7名患兒，進(jìn)行一代測(cè)序，均未發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)。

根據(jù)G6PD致病性變異分類標(biāo)準(zhǔn)，不同的基因位點(diǎn)在女性患兒中均表現(xiàn)為Ⅳ類致病性變異；在男性患兒中表現(xiàn)為不同的致病性變異分類，93%（64/69）的致病性變異為Ⅲ~Ⅳ類，酶活性表現(xiàn)為輕中度缺乏（表2）。對(duì)檢出率最高的前3位基因突變類型（c.1388G＞A、c.1376G＞T、c.1024C＞T）致病性分類情況進(jìn)行 Kruskal‐WallisH檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)三者對(duì)酶活性的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。進(jìn)一步兩兩比較，c.1024C＞T與 c.1376G＞T，c.1024C＞T 與 c.1388G＞A 的 致 病性分類情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0167），提示c.1376G＞T與c.1388G＞A對(duì)酶活性的影響大于c.1024C＞T對(duì)酶活性的影響。c.1376G＞T與c.1388G＞A的致病性分類情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.0167）。見表3。

對(duì)87例進(jìn)行基因診斷患兒進(jìn)行新生兒期病史詢問，5例患兒因黃疸程度重住院治療（1例為基因檢測(cè)陰性患兒，4例為基因檢測(cè)陽(yáng)性患兒），入院時(shí)血間接膽紅素為282~342 μmol/L（正常值范圍：＜21 μmol/L），其中2例（均為男性，基因檢測(cè)陽(yáng)性）收集到住院期間血紅蛋白數(shù)據(jù)，分別為148 g/L和135 g/L（正常值范圍：140~170 g/L），均住院5~7 d治愈出院。

表2 男性患兒不同基因突變類型對(duì)應(yīng)致病性變異分類情況 （例）

表3 檢出率最高的前3位基因突變類型致病性情況比較[例（%）]

3 討論

G6PD缺乏癥是由于紅細(xì)胞膜的G6PD缺陷，導(dǎo)致紅細(xì)胞戊糖磷酸途徑中谷胱甘肽還原酶的輔酶—還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸生成減少，使得維持紅細(xì)胞膜穩(wěn)定性的還原型谷胱甘肽生成減少而不能抵抗氧化損傷，它最終導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞并溶血的一種遺傳病[3]。它是人類最常見的遺傳性酶缺陷疾病之一，全球有數(shù)億人受到該病影響[4]。該病在我國(guó)各地的發(fā)病率不盡相同[5‐7]，總體呈現(xiàn)出南高北低的規(guī)律。四川地區(qū)G6PD缺乏癥的發(fā)病率為1.2‰[8]，屬于相對(duì)低發(fā)區(qū)域。但本次研究發(fā)現(xiàn)成都市早產(chǎn)兒人群的發(fā)病率為3.55‰，明顯高于四川地區(qū)總的發(fā)病率?？赡芘cG6PD對(duì)胚胎早期的生物合成具有不可或缺的作用有關(guān)[9]，通過影響有核細(xì)胞的病理生理過程，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、加速細(xì)胞衰老、增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)病毒感染的敏感性等損害胚胎發(fā)育。另外成都市作為四川省省會(huì)，人口流動(dòng)大也可使本地發(fā)病率出現(xiàn)增高趨勢(shì)。G6PD缺乏癥重在預(yù)防，新生兒疾病篩查是全世界公認(rèn)的早發(fā)現(xiàn)、早診斷該病的重要方式。與成都市新生兒疾病篩查的先天性甲狀腺功能減低癥和苯丙酮尿癥的發(fā)病率相比（前者為1/2 808，后者為1/22 397[10]），G6PD缺乏癥仍是本地高發(fā)病種之一，新生兒篩查意義重大。

本次研究發(fā)現(xiàn)夏季出生、胎齡＜32周及BW＜2 500 g可能造成初篩假陽(yáng)性率升高。這一結(jié)果與多位研究者的結(jié)論相符[8,11]。G6PD活性易受溫、濕度等環(huán)境因素影響，成都地區(qū)夏季高溫、高濕的環(huán)境可使血片在采集、存儲(chǔ)、運(yùn)輸?shù)冗^程中，降低 G6PD 活性而造成篩查結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性[12]。篩查機(jī)構(gòu)進(jìn)行血片采集和存儲(chǔ)時(shí)均按照《新生兒疾病篩查管理辦法》要求執(zhí)行，但運(yùn)輸環(huán)節(jié)管理辦法未做明文規(guī)定，故建議夏季在成都地區(qū)推廣冷鏈運(yùn)輸篩查標(biāo)本來(lái)減少假陽(yáng)性率的發(fā)生。胎齡更小，BW更低的早產(chǎn)兒，出現(xiàn)早產(chǎn)兒并發(fā)癥幾率更大，可能存在因其他病因造成G6PD酶活性繼發(fā)性異常，隨著原發(fā)疾病的好轉(zhuǎn)，G6PD酶活性也逐漸恢復(fù)正常。雖然因此造成這一群體的初篩假陽(yáng)性率有所增高，但這符合新生兒疾病篩查應(yīng)以高靈敏度為主的原則，且G6PD缺乏癥確診費(fèi)用低廉，如果因此提高這一群體的篩查切值可能造成假陰性漏診患兒，對(duì)患者家庭的傷害更大。

本次研究發(fā)現(xiàn)女性患兒基因檢測(cè)的確診符合率高于酶活性檢測(cè)法。原因是G6PD缺乏癥是一種X染色體連鎖不完全顯性的遺傳性疾病，其在男女之間的遺傳規(guī)律不同[13]。男性只有1條X染色體，只要該X染色體上有G6PD基因缺陷就會(huì)表現(xiàn)為G6PD酶活性顯著缺乏，易被酶活性檢測(cè)法檢出。而女性有2條X染色體，其上均存在G6PD等位基因，故只有純合子和雙重雜合子[14]的女性臨床表現(xiàn)為重度G6PD酶活性缺乏，可被酶活性檢測(cè)法檢出，雜合子僅表現(xiàn)為輕度G6PD酶活性缺乏，無(wú)法被檢出而造成漏篩。雖然總的來(lái)說女性雜合子病情程度輕，但也有病例發(fā)展為嚴(yán)重的急性溶血性貧血[4]。故應(yīng)盡量擴(kuò)大在女性早產(chǎn)兒中進(jìn)行基因檢測(cè)的范圍，提高女性雜合子的檢出率。

本次研究發(fā)現(xiàn)成都地區(qū)早產(chǎn)兒人群最常見的3種基因突變類型為：c.1388G＞A、c.1376G＞T和c.1024C＞T，共占75%。與國(guó)內(nèi)已報(bào)道的最常見的3種基因突變類型[1]（c.1388G＞A、c.1376G＞T和c.95A＞G）不同，c.95A＞G在成都地區(qū)并不常見。與寧夏回族[15]、廣西瑤族[16]的主要基因突變類型也不同；但與四川地區(qū)[8]地理位置比較接近的云南、貴州[17]報(bào)道一致。說明不同地區(qū)和民族的G6PD基因突變類型和發(fā)生頻率不盡相同，而同一地區(qū)人群致病基因分布情況相似。不同的基因突變類型可致G6PD酶活性不同程度缺乏[18‐19]，對(duì)應(yīng)不同的致病性變異分類。本次研究發(fā)現(xiàn)3種檢出率最高的基因突變對(duì)應(yīng)的致病性均比Minucci等[18]報(bào)道的基因突變庫(kù)中相應(yīng)基因突變的致病性要低，提示同樣的基因突變?cè)谠绠a(chǎn)兒群體表現(xiàn)為更高的G6PD酶活性，這與其他學(xué)者報(bào)道的孕周越小G6PD酶活性越高相符[8,20]。也可能與本次研究樣本數(shù)較小，研究對(duì)象地區(qū)差異有關(guān)，需收集更多早產(chǎn)兒樣本進(jìn)一步研究。

綜上所述，成都市早產(chǎn)兒G6PD篩查覆蓋率已達(dá)99%以上，該人群篩查的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值達(dá)到90%以上，可篩查出絕大部分早產(chǎn)兒G6PD患者，對(duì)于患兒的早期診斷和有效干預(yù)意義重大。可在夏季要求篩查機(jī)構(gòu)使用冷鏈運(yùn)輸標(biāo)本降低G6PD篩查的假陽(yáng)性率,并逐步擴(kuò)大女性早產(chǎn)兒基因檢測(cè)比例來(lái)使成都市早產(chǎn)兒G6PD篩查工作更加科學(xué)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。