靜電紡CA/PpIX多孔纖維膜的制備及其光動力性能

沈慧穎，呂子豪，莊粟裕，曹秀明，王清清，

(1 江南大學 生態(tài)紡織教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2 江蘇陽光股份有限公司，江蘇 無錫 214400)

近年來，抗生素在全球范圍的過度使用或濫用導致了具有多重耐藥性的“超級細菌”的出現(xiàn)和傳播，預防病原體感染已成為一個重要的醫(yī)學和社會問題，發(fā)展新型抗菌策略迫在眉睫[1-2]。光動力抗菌化學療法(photodynamic antimicrobial chemotherapy，PACT)就是一種用于預防微生物感染十分有前景的新型療法，可以用于包括細菌、病毒以及真菌在內的多種微生物的滅活[3]。與傳統(tǒng)抗菌方法相比，該療法具有廣譜抗菌的特點，且不會導致細菌產(chǎn)生抗性，生物毒性低[4]，具有良好的研究前景。PACT法的原理是光敏劑受光激發(fā)后，將能量傳遞給氧分子，使其生成具有細胞毒性的單線態(tài)氧(singlet oxygen，1O2)等活性氧物質(reactive oxygen species，ROS)來使微生物失活，化學機理包括Ⅰ型機制(自由基機制)和Ⅱ型機制(單線態(tài)氧機制)[5-6]。

針對細菌耐藥問題，本工作采用靜電紡絲法制備醋酸/原卟啉(CA/PpIX)復合多孔超細纖維膜，對纖維膜的形貌、光敏劑的分布、化學結構以及底物氧化性能進行了研究，并且評價了材料對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的光敏抗菌效果。最后，設計3種(KI，NaNO2，MgCl2)無機鹽溶液濃度梯度實驗，探究不同種類無機鹽溶液對CA/PpIX膜光敏抗菌效果的增強作用。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

二醋酸纖維素(CDA，MW= 200000，特性黏度Iv=1.45 dL /g)購自南通醋酸纖維有限公司；丙酮，分析純；二氯甲烷(DCM)，分析純；碘化鉀，分析純；氯化鎂，分析純；亞硝酸鈉，分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司；原卟啉(PpIX)，純度≥99.99%，優(yōu)級純；1，3-二苯基異苯并二吡喃(DPBF)，純度> 98%以及重水(D2O)購自上海維塔化學試劑有限公司；金黃色葡萄球菌(ATCC-6538)及大腸桿菌(8099)，購自上海協(xié)久生物科技有限公司。

1.2 靜電紡多孔CA/PpIX復合纖維的制備

將1.014 g醋片溶于50 mL裝有20 mL DCM/丙酮(體積比為8/2)混合溶液的錐形瓶中，配制成質量分數(shù)為4%的二醋酸纖維紡絲液，隨后置于磁力攪拌器上常溫攪拌6 h以上以形成均質溶液。同時制備3個上述紡絲液，待混合溶液攪拌均勻后，取其中兩個錐形瓶中分別加入質量為50.7,101.4 mg的PpIX，避光，接著置于磁力攪拌器上常溫攪拌24 h以上至溶質完全溶解，另一個錐形瓶不添加PpIX，從而得到CA為4%，PpIX為CA的0,5%,10%的紡絲液。

將配置的上述3種紡絲液倒入規(guī)格為20 mL且表面包覆錫紙的注射器中，安裝到微量注射泵上，在注射器針頭(外徑0.7 mm)接上高壓電源的正極，用覆有光滑鋁箔紙的滾筒作為接收裝置與負極相連。在高壓靜電場作用下，紡絲液所受電場力克服溶液表面張力后，噴射出帶電射流，隨著溶劑的揮發(fā)，固化為纖維隨機排布于收集裝置上[18]。靜電紡絲工藝參數(shù)為：室溫，避光，紡絲電壓19 kV，注射泵控制溶液流速2 mL/h，紡絲接收距離15 cm，滾筒的轉速600 r/min。分別紡得CA,CA/PpIX-5,CA/ PpIX-10纖維膜，紡絲結束后，卸下鋁箔紙，置于65 ℃的真空烘箱中干燥6～12 h備用。

1.3 復合纖維膜的單線態(tài)氧直接檢測

使用FL3-111 Horiba穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀檢測CA/PpIX膜光照條件下產(chǎn)生的單線態(tài)氧(1O2)。將3 cm×3 cm的CA/PpIX膜浸入裝有1.5 mL D2O的10 mL燒杯中，使用D2O的原因在于1O2在D2O (≈67 μs)中的壽命比在H2O (≈3.5 μs)中的更長，從而使磷光檢測更容易[11]。隨后，用LED燈(6 W)光照10 min，將溶液轉移到0.7 mL的石英比色皿中。最后，以氙燈(450 W)為激發(fā)源進行單線態(tài)氧檢測，激發(fā)波長為405 nm，帶通為8 nm，檢測到1O2的熒光發(fā)射，發(fā)射波長范圍1100～1400 nm，帶通為20 nm。

1.4 復合纖維膜的氧化性能

通過底物DPBF/甲醇溶液在光照條件下410 nm處的吸光度變化來判斷復合纖維膜的氧化能力。將CA，CA/PpIX-5，CA/PpIX-10纖維膜置于溫度為60 ℃的干燥箱中烘燥3 h并用直徑為1.4 cm的壓片機將其切成圓形。將圓形薄膜分別置于10 mL的裝有5 mL 74 μM DPBF/甲醇溶液的燒杯中，在激光筆(λ=532 nm，40 mW)的照射下，每隔1.5 min用UV-2600型紫外分光光度計記錄一次溶液的光譜及特征波長下(410 nm)的吸光度，并與相應的暗室樣品進行對照。

1.5 光動力抗菌性能評價

參考AATCC 100-2012《抗菌紡織品的評價方法》對CA,CA/PpIX-5,CA/PpIX-10纖維膜進行抗菌性能評價，選取革蘭氏陽性菌中的金黃色葡萄球菌(S.aureus)和革蘭氏陰性菌中的大腸桿菌(E.coli)兩種菌作為測試菌種。

將真空干燥后的纖維膜裁成若干個大小形狀一致、厚度均一的圓形試樣，并將其分別放入24孔板中。取0.1 mL濃度為1×108～3×108cfu/mL的菌液(PBS緩沖液)滴在24孔板中的樣品上，并將各組樣品分別置于光照(光強為65 mW/cm2，波長為420～780 nm)及暗室條件中培養(yǎng)30 min后，加入0.9 mL的PBS緩沖液。振蕩均勻后，分別取0．1 mL的原菌液(空白對照組)以及與試樣上的菌液，加入0.9 mL PBS緩沖液，在3 mL的離心管中依次等梯度稀釋106倍(每個樣品做3組平行實驗)。最后分別從每個離心管中取10 μL各稀釋梯度的溶液滴在TSA(S.aureus)或LA(E.coli)培養(yǎng)基平板上，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后記錄平板各列的菌落數(shù)，以與其等濃度的原菌液(沒有樣品膜的24孔板)為對照組計算細菌存活率與標準差，根據(jù)式(1)可以計算出抑菌率N，對CA,CA/PpIX-5,CA/PpIX-10纖維膜的抗菌效果進行評價。

(1)

式中：No為原菌液可計數(shù)列的菌落最大值；Ni為試樣抗菌后與原菌液對應梯度下的菌落值。

1.6 KI及無機鹽促進CA/PpIX膜光動力抗菌性能評價

與上述純纖維膜抗菌步驟操作不同的是，在探究不同濃度梯度的無機鹽溶液(0，10，25，50，100 mmol/L)對CA/PpIX-5,CA/PpIX-10膜介導的光動力抗菌效果增強實驗時，需分別在24孔板中的纖維膜上滴加100 μL的無機鹽溶液(KI或MgCl2或NaNO2)和100 μL含有107～108cfu/mL細菌的PBS溶液后搖勻，然后在氙燈下(光強為65 mW/cm2，波長為420～780 nm)光照30 min，同時對照組置于暗室30 min。光照結束后各加入0.8 mL PBS緩沖液進行稀釋，隨后的操作與上述抗菌方法相同。除此之外，僅含有純無機鹽溶液及加入CA纖維膜無機鹽溶液的24孔板也需進行相同條件的光照以作為光照組對照組。

1.7 其他表征

用SU1510型掃描電子顯微鏡觀察CA,CA/PpIX-5,CA/PpIX-10纖維膜的表面形貌；用TCS SP8型激光共聚焦掃描顯微鏡觀察PpIX在靜電紡多孔醋酸纖維上的分布情況(PpIX的熒光激發(fā)波長為405 nm，發(fā)射波長為632 nm)；用Nicolet IS10型傅里葉變換紅外光譜儀中的衰減全反射紅外光譜法(ATR-FTIR)對纖維膜進行測試分析(分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為16次，波數(shù)范圍為4000～800 cm-1)；用LABRAM HR-800型拉曼光譜儀進一步對PpIX粉末和纖維膜進行表征，判斷PpIX的負載情況(激發(fā)波長為514 nm，波數(shù)范圍1750～900 nm)。

2 結果與討論

2.1 形貌觀察

圖1是純CA膜、CA/PpIX-5以及CA/PpIX-10多孔醋酸纖維膜的掃描電鏡圖和激光共聚焦掃描顯微鏡圖。

圖1 CA(a)，CA/PpIX-5(b)和CA/PpIX-10(c)纖維膜的SEM圖像與CLSM圖像

從圖1(a-1)，(b-1)，(c-1)來看，負載原卟啉后的多孔醋酸纖維形貌并沒有發(fā)生顯著的改變。與傳統(tǒng)靜電紡醋酸納米纖維相比(纖維表面光滑、無孔，直徑約為500 nm[19])，多孔醋酸纖維的直徑更粗，為微米級(通過粒徑分布計算軟件測得平均直徑在2～3 μm)。這可能是由二氯甲烷快速揮發(fā)使得射流快速凝固，纖維未能得到足夠的牽伸而導致的[19]。從圖1的SEM照片中可以發(fā)現(xiàn)，纖維大多為多孔柱狀，含有少量的扁平帶狀，這是因為射流在拉伸固化時，溶劑的快速揮發(fā)使得射流表層先形成多孔結構，而射流內層的溶液形成濃度梯度差，同時表面溶劑的揮發(fā)速率遠大于內層溶劑的擴散速率，從而在大氣壓作用下坍塌形成扁平帶狀結構[20]。此外，沿纖維軸向分布的孔洞清晰可見且分布較為均勻，多為細長橢圓形，其大小深淺不一?？锥吹男纬墒怯捎贒CM(沸點39.8 ℃)的高揮發(fā)性，其在靜電紡絲過程中快速揮發(fā)，使得射流表面溫度急劇降低，引發(fā)熱致相分離，形成富溶質相和富溶劑相；此外溫度的下降使周圍環(huán)境中的水蒸氣液化為小水珠聚集在射流表面，CA和PpIX均不溶于水，聚合物在水珠周圍凝固。在兩者的共同作用下，富溶質相處形成纖維骨架，富溶劑相和水珠在紡絲過程中快速揮發(fā)，在纖維表面形成凹凸不平、大小不一的孔洞[19]。表面多孔的CA/PpIX纖維膜對細菌有良好的吸附效果，可使活性氧物種與細菌膜結構有效接觸，從而更好地發(fā)揮抗菌效果。

從圖1(a-3)可以觀察到，未添加原卟啉的純CA膜沒有表現(xiàn)出任何熒光效應。而CA/PpIX-5和CA/PpIX-10纖維膜則發(fā)出均勻的紅光，圖1(b-3)，(c-3)，表明PpIX均勻地分布在多孔醋酸纖維表面上，并未完全包埋在纖維內部，實現(xiàn)了良好的表面負載。雖然光敏劑含量CA/PpIX-5比CA/PpIX-10少50%，但從熒光效應圖上發(fā)現(xiàn)兩者的表面負載量相差不大?？赡苁且驗樯淞鞅韺尤軇]發(fā)的同時使得表層溶液的濃度隨之升高，而PpIX在濃度較高時極易發(fā)生聚集現(xiàn)象[21]，因此在射流表面發(fā)生了一定程度的聚集，而光可能無法穿透某些聚集體的內部，故只有表層的PpIX在激發(fā)波長下發(fā)出熒光。

2.2 化學結構分析

圖2為純CA，CA/PpIX-5，CA/PpIX-10纖維膜的紅外光譜圖以及共振拉曼光譜。

圖2 CA，CA/PpIX-5，CA/PpIX-10纖維膜的ATR-FTIR光譜(a)和拉曼光譜(b)Fig.2 ATR-FTIR spectra (a) and Raman spectra (b) of CA, CA/PpIX-5 and CA/PpIX-10 fibrous membranes

2.3 單線態(tài)氧的直接檢測及底物氧化

圖3是CA,CA/PpIX膜的瞬態(tài)熒光光譜及DPBF溶液紫外吸收光譜。原卟啉PpIX經(jīng)光照后可產(chǎn)生在單線態(tài)氧(1O2)，當1O2回到基態(tài)時，可輻射能量發(fā)光。利用瞬態(tài)光譜技術可以觀察到單線態(tài)氧在1270 nm發(fā)光[6]。圖3(a)是CA及CA/PpIX膜的瞬態(tài)熒光光譜，1270 nm處出現(xiàn)特征峰證明CA/PpIX在光照條件下確實產(chǎn)生了1O2[24]。

DPBF是一種熒光分子，對單線態(tài)氧(1O2)具有高度特異性反應，它可以與1O2發(fā)生Diels-Alder型加成反應生成內過氧化物，將其氧化成二苯甲?；?BPO)[25]，使DPBF熒光強度降低。圖3(b)是CA/PpIX-10纖維膜在持續(xù)光照條件下，溶液紫外吸收變化的光譜圖。在1O2的氧化作用下，隨著光照時間的延長，熒光色的DPBF逐漸被氧化成無色的BPO，溶液顏色逐漸變淺，在410 nm處的吸光度隨之下降。圖3(c)，(d)是純CA膜、CA/PpIX-5以及CA/PpIX-10纖維膜410 nm處吸光度隨時間的變化圖。經(jīng)激光照射后，純CA膜和DPBF沒有發(fā)生氧化反應，溶液410 nm處的吸光度幾乎沒有變化，而CA/PpIX-5及CA/PpIX-10纖維膜的吸光度顯著下降，且隨時間成線性變化，說明其具有良好的光動力氧化性能。然而，盡管CA/PpIX-10負載了更多的光敏劑，但其光敏活性在一定程度上受到PpIX團聚的影響，故其有效負載量較低[21]，單線態(tài)氧產(chǎn)率較CA/PpIX-5稍低。另外，如圖3(d)所示，正如預期，對照組的DPBF均未被氧化，溶液410 nm處的吸光度基本沒有發(fā)生變化。

圖3 CA，CA/PpIX纖維膜的瞬態(tài)熒光光譜(a)、CA/PpIX-10膜的DPBF溶液紫外吸收光譜(b)和410 nm處不同質量分數(shù)CA/PpIX膜的DPBF溶液紫外吸收曲線(c)以及對照組(d)的DPBF溶液紫外吸收曲線Fig.3 Transient state fluorescence spectrum (a), UV-Vis absorption spectra of KI solution photooxidized by CA/PpIX-10 (b),UV-Vis absorbance of DPBF solution at 410 nm photooxidized by different proportions of CA/PpIX membranes (c) and control group (d)

2.4 抗菌及無機鹽增強抗菌實驗

圖4為CA膜、CA/PpIX膜及膜添加無機鹽后對金黃色葡萄球菌(S.aureus)和大腸桿菌(E.coli)的抗菌效果圖。

圖4 CA，CA/PpIX-5和CA/PpIX-10膜對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的抗菌效果圖(a)、膜在KI溶液作用下的抗菌效果圖(b)及CA/PpIX-5膜在3種無機鹽作用下對金黃色葡萄球菌(c)和大腸桿菌(d)的抗菌效果圖Fig.4 Antibacterial effect of CA/PpIX-5 and CA/PpIX-10 against S.aureus and E.coli. (a),under the influence of KI solution (b),under the action of three inorganic salts against S. aureus(c) and E.coli(d)

1O2+ I-+ H+→IOOH +I-→

(2)

(3)

通過對比3種無機鹽溶液對CA/PpIX-5膜介導的光動力抗菌的增強作用發(fā)現(xiàn)，如圖4(c)，(d)所示，鹵化物對光動力效應的增強效果要強于亞硝酸鹽。其原因可能在于光敏劑激發(fā)機理與無機鹽的氧化機理之間的關系。研究表明，由原卟啉介導的細胞殺傷作用主要是1O2引起光損傷的結果(Ⅱ型機制)[21]，而NaNO2的氧化機理主要歸因于Ⅰ型機制產(chǎn)生的超氧化物與二氧化氮反應形成過氧亞硝酸鹽[29]；鹵化物陰離子的氧化機理在于與Ⅱ型光化學過程中的1O2反應，繼而產(chǎn)生抗菌物質。

3 結論

(1)通過靜電紡絲法成功制備了負載原卟啉PpIX的多孔醋酸超細纖維，光敏劑PpIX均勻分布在纖維表面，且復合CA/PpIX纖維實現(xiàn)了表面造孔，纖維直徑為微米級，沿纖維軸向分布著大小深淺不一的微米級孔洞，具有良好的表面形貌及纖維結構。

(2)含PpIX的多孔醋酸纖維膜在光照條件下可產(chǎn)生1O2，具有光動力氧化性能，能夠介導革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性大腸桿菌的光動力失活。由于PpIX為中性光敏劑且在濃度高時易發(fā)生聚集現(xiàn)象，故CA/PpIX-5的單線態(tài)氧產(chǎn)率高于CA/PpIX-10，且CA/PpIX纖維膜抗金黃色葡萄球菌的效果整體上明顯優(yōu)于抗大腸桿菌。

(3)KI,MgCl2,NaNO2溶液對CA/PpIX介導的光動力抗菌均具有一定的增強作用，其中KI溶液的增強作用最明顯，100 mmol/L的KI溶液可將復合纖維膜對兩種模式菌的抗菌效率均提升至99.9999%，其機理涉及分子碘的原位光生，將來可能會廣泛應用于臨床治療。