陳皮揮發(fā)油組成分析及其單體的抗氧化性研究

余祥英,陳曉純,李玉婷,李琳

(東莞理工學(xué)院 食品營養(yǎng)健康工程與智能化加工研究中心 化學(xué)工程與能源技術(shù)學(xué)院,廣東 東莞,523808)

藥用陳皮(Citriretriculataepericarpium)標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)收載于《中國藥典》2015 年版一部,為蕓香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培變種的干燥成熟果皮,具有理氣健脾、燥濕化痰的功效,可分為廣陳皮和陳皮[1]。廣陳皮主產(chǎn)于廣東新會一帶,乃“廣東三寶”之首和“廣東十大中藥”之一。目前市場上的普通陳皮以湖北蜜桔陳皮和福建蘆柑陳皮為主。廣陳皮和普通陳皮在臨床和日常食用中均應(yīng)用十分廣泛。

揮發(fā)油是陳皮的主要成分之一,目前陳皮揮發(fā)油中分離鑒定的化合物多達160多種[2],包括單萜(烯)、倍半萜(烯)和含氧化合物(酸、酯、醛、酮類化合物),以單萜類和倍半萜類化合物為主。作為陳皮活性的重要來源,陳皮揮發(fā)油具有抗氧化和抗菌活性[3],且可延長水產(chǎn)品的保質(zhì)期[4-5]。但是目前有關(guān)揮發(fā)油活性的研究主要集中在混合物的抗氧化性研究方面,對其主要的抗氧化活性組分研究知之甚少。本文擬在分析廣陳皮和普通陳皮揮發(fā)油組分的基礎(chǔ)上,測試陳皮揮發(fā)油單體對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2, 2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS)陽離子自由基清除能力和還原能力,以探索陳皮揮發(fā)油中抗氧化性的關(guān)鍵組分,完善陳皮揮發(fā)油的抗氧化活性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陳皮樣品采自2019年新會茶枝柑和福建南平蘆柑果皮,自行晾曬制備。

無水硫酸鈉、無水乙醇(均為分析純),天津市大茂化學(xué)試劑廠；正己烷、甲醇(均為色譜純),MREDA；β-蒎烯、α-松油烯、p-傘花烴、D-檸檬烯、γ-萜品烯、萜品油烯、芳樟醇、4-萜烯醇、α-松油醇、癸醛、紫蘇醛、香芹酚、鄰甲氨基苯甲酸甲酯、DPPH、ABTS、K2S2O8、2,4,6-三吡啶基三嗪鹽酸溶液(2,4,6-Tri(2-pyridyl)-1,3,5-triazine,TPTZ)、L-抗壞血酸(維生素C,VC),阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Aglient 8890/7000D氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀,美國Agilent 公司；TECAN Spark?多功能微孔板檢測儀,瑞士Tecan公司；FW100高速萬能粉碎機,天津市泰斯特儀器有限公司；DF-101S集溫式恒溫加熱磁力攪拌器,德祥科技有限公司；FA2140電子分析天平,上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；KQ-400DE數(shù)控超聲波清洗器,昆山聲儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 陳皮揮發(fā)油的提取

采用2015版《中國藥典》揮發(fā)油測定法進行提取測定。具體步驟：準(zhǔn)確稱取適量陳皮,置于高速萬能粉碎機中粉碎,過40目篩,避光密封保存?zhèn)溆?。在電子天平上?zhǔn)確稱取15 g陳皮粉末,加入到250 mL圓底燒瓶中,按料液比1∶10 (g∶mL)加入150 mL水浸泡1 h,然后放入玻璃珠,振蕩混勻,連接揮發(fā)油測定器和回流冷凝管,置于油浴鍋中進行水蒸氣蒸餾提取,直至測定器油量不再增加(5 h),停止蒸餾。放置片刻,讀取揮發(fā)油量,并計算陳皮中揮發(fā)油的含量(mL/g 陳皮樣品量)。讀取揮發(fā)油量后收集上層揮發(fā)油,使用無水硫酸鈉干燥脫水,于4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 陳皮揮發(fā)油的組成分析

將脫水后的揮發(fā)油加正己烷稀釋10倍,過0.22 μm微孔有機濾膜過濾,待GC-MS分析。GC-MS分析條件：Aglient HP-5MS 石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)；載氣為高純度氦氣(99.999%)；程序升溫條件為柱溫60 ℃,維持3 min,以1 ℃/min 升溫至80 ℃,維持3 min,再以5 ℃/min升溫至250 ℃,溶劑延遲3 min；進樣量1 μL；分流比為200∶1；電離方式為EI,電子能量70 eV,離子源溫度為230 ℃,四級桿溫度150 ℃,掃描范圍m/z：30～450。

樣品經(jīng)上述條件進行分析后,通過譜庫檢索和標(biāo)準(zhǔn)品圖譜比對鑒定揮發(fā)油組分,用面積歸一化法初步測定揮發(fā)油各組分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.3 陳皮揮發(fā)油和單體化合物的DPPH自由基清除能力測定

根據(jù)文獻測定陳皮揮發(fā)油和單體對DPPH自由基的清除活性并稍做修改[6]。首先用無水乙醇配制0.13 mmol/L 的DPPH自由基溶液,然后取100 μL不同濃度的樣品甲醇溶液,加入300 μL上述配制的DPPH自由基溶液,混合均勻,室溫避光放置1 h,于517 nm波長處測定其吸光度。按公式(1)計算DPPH自由基清除率：

(1)

式中:A0表示用甲醇代替樣品所測得的吸光度；A1表示樣品所測得的吸光度。

1.3.4 陳皮揮發(fā)油和單體化合物的ABTS陽離子自由基清除能力測定

根據(jù)文獻測定陳皮揮發(fā)油和單體對ABTS陽離子自由基的清除活性并稍做修改[6]。首先用蒸餾水配制7.4 mmol/L ABTS和2.6 mmol/L K2S2O8的儲備液,然后將ABTS和K2S2O8溶液等體積混合,室溫避光靜置12 h,用蒸餾水稀釋20倍后待用。取不同濃度的樣品甲醇溶液50 μL,加入1 mL 上述配制的ABTS工作液,混合均勻,室溫避光放置1 h,于734 nm處測定其吸光度。按公式(2)計算ABTS陽離子自由基清除率：

(2)

式中:A0表示用甲醇代替樣品所測得的吸光度；A1表示樣品所測得的吸光度。

1.3.5 陳皮揮發(fā)油和單體化合物的還原能力測定

根據(jù)文獻[7]測定陳皮揮發(fā)油和單體還原Fe3+的能力并稍做修改。首先用蒸餾水配制0.3 mol/L 醋酸緩沖溶液(pH 3.6)、10 mmol/L TPTZ溶液和 20 mmol/L FeCl3溶液,按體積比10∶1∶1配制鐵還原/抗氧化能力(ferric reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP)工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。分別取 0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L FeSO4各50 μL,加入1.45 mL FRAP工作液,混合均勻,37 ℃水浴30 min,以蒸餾水為參比,采用酶標(biāo)儀于593 nm處測定吸光度,然后以吸光度為縱坐標(biāo)和FeSO4濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為y=0.439 36x-0.001 04(R2=0.999 9)。分別取50 μL不同濃度的樣品甲醇溶液,以甲醇為參比,采用上述方法處理后測定其在593 nm處吸光度。樣品的抗氧化能力FRAP值以Fe2+(相當(dāng)于FeSO4)表示(mmol/L)。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS Statistics 20軟件對實驗結(jié)果進行差異顯著性分析,每組實驗均進行3次平行試驗,結(jié)果用mean±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 陳皮揮發(fā)油的提取和組成分析

2.1.1 陳皮揮發(fā)油的提取

對所采摘和制備的陳皮樣品(新會茶枝柑、福建南平蘆柑)采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油,其平均得率和揮發(fā)油顏色見表1。在提取過程中發(fā)現(xiàn),加NaCl并不能改善揮發(fā)油的提取,且陳皮粉碎后需要立即提取揮發(fā)油,否則嚴(yán)重影響揮發(fā)油提取率。由表1可知,新會陳皮的揮發(fā)油得率較高,為0.12 mL/g；福建產(chǎn)地陳皮的揮發(fā)油含量為0.07 mL/g。這與文獻報道的大多數(shù)陳皮的揮發(fā)油含量在0.03%～8.00%較為一致[8-10]。揮發(fā)油一般貯存于果皮油胞中,果皮中的油胞數(shù)量直接影響揮發(fā)油含量和顏色。前期調(diào)研顯示新會陳皮相比其他產(chǎn)地陳皮具有大量油胞是其特色之一。揮發(fā)油顏色的差異提示不同產(chǎn)地陳皮揮發(fā)油在組成上存在差異。

表1 不同產(chǎn)地陳皮揮發(fā)油平均得率Table 1 Yield of volatile oil in Citri retriculatae pericarpium from different samples

2.1.2 陳皮揮發(fā)油的組成分析

本文進一步對新會茶枝柑和福建蘆柑2種陳皮的揮發(fā)油進行 GC-MS 鑒定分析,譜圖如圖1所示,結(jié)合譜圖檢索和標(biāo)準(zhǔn)品比對共鑒定出23種揮發(fā)油成分,其面積歸一化分析結(jié)果見表2。

1-α-側(cè)柏烯；2-α-蒎烯；3-檜烯；4-β-蒎烯；5-β-月桂烯；6-α-松油烯；7-p-傘花烴；8-D-檸檬烯；9-γ-萜品烯；10-萜品油烯；11-芳樟醇；12-4-萜烯醇；13-α-松油醇；14-癸醛；15-紫蘇醛；16-香芹酚；17-鄰甲氨基苯甲酸甲酯；18-β-丁香烯；19-α-石竹烯；20-右旋大根香葉烯；21-金合歡烯；22-杜松烯；23-大根香葉烯B圖1 陳皮揮發(fā)油的GC-MS譜圖Fig.1 The GC-MS chromatogram of volatile oil in Citri retriculatae pericarpium from Xinhui and Fujian

表2 新會和福建陳皮揮發(fā)油的組成及其面積歸一化結(jié)果Table 2 Chemical composition and peak area normalization of volatile oil in Citri retriculatae pericarpium from Xinhui and Fujian

從表2可以看出,陳皮揮發(fā)油的主要成分是單萜烯(通式為C10H16)、倍半萜烯(通式為C15H24)和含氧化合物。陳皮揮發(fā)油中,單萜烯以D-檸檬烯和γ-萜品烯為主,還含有少量的α-側(cè)柏烯、α-蒎烯、檜烯、β-蒎烯、β-月桂烯、α-松油烯和萜品油烯,單萜烯分別占新會陳皮和福建陳皮揮發(fā)油總量的94.58%和92.08%。從表2和圖1也可以看出，新會陳皮揮發(fā)油較福建陳皮揮發(fā)油含有相對降低的D-檸檬烯和相對較高的γ-萜品烯,進一步計算D-檸檬烯/γ-萜品烯比值可以得出新會陳皮揮發(fā)油和福建陳皮揮發(fā)油中該比值分別為3.30和9.15,這與文獻報道基本一致[9-15]。新會陳皮揮發(fā)油中D-檸檬烯/γ-萜品烯比值在9以下,而非新會陳皮揮發(fā)油中D-檸檬烯/γ-萜品烯值在9以上,提示陳皮揮發(fā)油中的D-檸檬烯與γ-萜品烯的含量比值可作為新會陳皮的鑒定依據(jù)之一。陳皮揮發(fā)油中檢測到的倍半萜烯有金合歡烯、右旋大根香葉烯、杜松烯、石竹烯、丁香烯和大根香葉烯,倍半萜烯分別占新會陳皮和福建陳皮揮發(fā)油總量的0.93%和6.10%；從圖1也可以看出,福建陳皮揮發(fā)油較新會陳皮揮發(fā)油含有較多的倍半萜烯。

陳皮揮發(fā)油中檢測到的含氧化合物主要有醇類(芳樟醇、4-萜烯醇、α-松油醇)、醛類(癸醛、紫蘇醛)和酚類(香芹酚)化合物,其中鄰甲氨基苯甲酸甲酯作為檢測到的唯一一種含氮化合物僅在新會陳皮揮發(fā)油中有檢出,和文獻報道一致[12,16-17],可用于鑒定區(qū)分新會陳皮與其他產(chǎn)地陳皮。值得注意的是,除鄰甲氨基苯甲酸甲酯,香芹酚在本文中也僅在新會陳皮中檢出,文獻報道[18]香芹酚的同分異構(gòu)體百里香酚在福建陳皮(購自中藥店)中有檢出,而本文中未檢出,提示陳皮揮發(fā)油中酚類化合物的存在與陳皮的品種和產(chǎn)地均有關(guān),不是新會茶枝柑陳皮的特有化合物。

2.2 陳皮揮發(fā)油的抗氧化性

為進一步比較不同陳皮揮發(fā)油的抗氧化性,本文比較了新會茶枝柑和福建蘆柑陳皮揮發(fā)油的DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除率和還原能力。由圖2可以看出,新會和福建陳皮揮發(fā)油均具有DPPH、ABTS陽離子自由基清除能力和還原能力,且自由基清除能力和還原能力在測試質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有明顯的量效關(guān)系：隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增強,其中新會茶枝柑相比福建蘆柑陳皮具有較強的還

原Fe3+能力。在樣品質(zhì)量濃度為 100 mg/mL時,新會揮發(fā)油的還原能力為(3.299±0.025)mmol/L,而福建揮發(fā)油的還原能力僅為(1.706±0.025) mmol/L。但兩者自由基清除活性相當(dāng),在樣品質(zhì)量濃度為80 mg/mL時,2種陳皮揮發(fā)油的自由基清除活性接近,其DPPH、ABTS陽離子自由基清除活性最高分別達到87.78%、90.28%和87.70%、87.28%；在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(15～80 mg/mL),新會茶枝柑陳皮揮發(fā)油的DPPH自由基清除能力弱低于福建蘆柑陳皮,ABTS陽離子自由基清除能力與福建蘆柑陳皮相當(dāng)。通過線性回歸可計算出新會茶枝柑和福建蘆柑陳皮揮發(fā)油清除DPPH、ABTS陽離子自由基能力的IC50值分別為31.64、15.63 mg/mL和19.14、13.75 mg/mL。

2.3 陳皮揮發(fā)油單體化合物的抗氧化性

基于上述新會茶枝柑和福建蘆柑陳皮揮發(fā)油的組成和抗氧化性差異,本文進一步測試了揮發(fā)油單體的DPPH自由基清除率、ABTS陽離子自由基清除率和還原能力以初步探索陳皮揮發(fā)油中抗氧化性的關(guān)鍵組分。結(jié)合GC-MS測定結(jié)果和可購買得到的單體化合物,本文選擇測定了13種單體(β-蒎烯、α-松油烯、p-傘花烴、D-檸檬烯、γ-萜品烯、萜品油烯、芳樟醇、4-萜烯醇、α-松油醇、癸醛、紫蘇醛、香芹酚、鄰甲氨基苯甲酸甲酯)的抗氧化性。

a-DPPH自由基清除活性；b-ABTS陽離子自由基清除活性；c-還原能力圖2 新會和福建陳皮揮發(fā)油的抗氧化性Fig.2 Antioxidant activity of volatile oil in Citri retriculatae pericarpium from Xinhui and Fujian

由于初步預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)D-檸檬烯、α-松油醇、4-萜烯醇、癸醛和p-傘花烴以純品測試其自由基清除率時仍較低(自由基清除率<50%),故圖3和圖4未進一步開展這幾種化合物的量效關(guān)系研究,表3只顯示了這幾種化合物純品的自由基清除率,結(jié)合這幾類化合物在陳皮揮發(fā)油的含量可說明芳香烴類化合物與與醛醇類含氧化合物對陳皮揮發(fā)油的抗氧化性貢獻可忽略。值得注意的是,D-檸檬烯的ABTS陽離子自由清除率呈較大的負值,提示其具有較強的促進ABTS陽離子自由基生成能力,有待進一步研究。

由圖3和圖4可見,紫蘇醛、芳樟醇、4種單萜烯(α-松油烯、β-蒎烯、γ-萜品烯和萜品油烯)和香芹酚的DPPH自由基清除活性隨著質(zhì)量濃度的增加均增強；鄰甲氨基苯甲酸甲酯、3種單萜烯(α-松油烯、γ-萜品烯和萜品油烯)和香芹酚的ABTS陽離子自由基清除活性隨著質(zhì)量濃度的增加也呈增加趨勢。有趣的是,鄰甲氨基苯甲酸甲酯無顯著的DPPH自由基清除活性,但在1～10 mg/mL內(nèi)具有較強的ABTS陽離子自由清除活性,且呈量效關(guān)系,在10 mg/mL時清除率為68%。通過圖3進一步計算這些化合物的IC50值(見表3),得出DPPH自由基清除能力強弱排序為：香芹酚>萜品油烯>γ-萜品烯>α-松油烯>紫蘇醛>β-蒎烯>芳樟醇；ABTS陽離子自由基清除能力強弱排序為：香芹酚>α-松油烯>鄰甲氨基苯甲酸甲酯>萜品油烯>γ-萜品烯。

圖3 揮發(fā)油單體化合物的DPPH自由基清除能力Fig.3 DPPH radical scavenging activity of individual compounds in Citri retriculatae pericarpium volatile oil

圖4 揮發(fā)油單體化合物的ABTS陽離子自由基清除能力Fig.4 ABTS radical scavenging activity of individual compounds in Citri retriculatae pericarpium volatile oil

在所有分析的單萜烯(萜品油烯、γ-萜品烯、α-松油烯、β-蒎烯、D-檸檬烯)化合物中,D-檸檬烯作為陳皮揮發(fā)油中含量最高的成分具有最低的自由基清除活性,萜品油烯和α-松油烯分別呈現(xiàn)最高的DPPH自由區(qū)清除能力(IC50=14.68 mg/mL)和ABTS陽離子自由基清除能力(IC50=3.755 mg/mL)。不同單萜烯抗氧化性的差異提示單萜烯中雙鍵位置的差異對其抗氧化性影響較大,其構(gòu)效關(guān)系值得進一步探討。作為陳皮揮發(fā)油中含量最高的2種化合物D-檸檬烯和γ-萜品烯,目前已有文獻報道[19-20],γ-萜品烯具有顯著強于D-檸檬烯的DPPH自由基清除活性,且含γ-萜品烯越多的揮發(fā)油其DPPH自由基清除活性越強。結(jié)合3.2小節(jié)陳皮揮發(fā)油的組成含量可發(fā)現(xiàn),新會陳皮相比福建陳皮揮發(fā)油具有相對較高的γ-萜品烯,但并不具有相對較高的自由基清除活性,提示陳皮揮發(fā)油的抗氧化性不僅僅與γ-萜品烯含量有關(guān),還與其他化合物有關(guān)。作為僅在新會陳皮中檢出的酚類化合物香芹酚,其DPPH和ABTS陽離子自由基清除率在所有分析的化合物中活性最強,其IC50值分別低至0.638 7 mg/mL和0.081 88 mg/mL,其中ABTS陽離子自由基清除率與VC相當(dāng)。結(jié)合表2數(shù)據(jù)可看出,雖然香芹酚在陳皮揮發(fā)油中的含量很低(0.30%),但其強抗氧化性對陳皮揮發(fā)油的抗氧化性貢獻不可忽略。

表3 揮發(fā)油單體化合物的自由基清除活性Table 3 Radical scavenging activity of individual compounds in Citri retriculatae pericarpium volatile oil

圖5顯示了7種單體化合物(紫蘇醛、β-蒎烯、萜品油烯、γ-萜品烯、鄰甲氨基苯甲酸甲酯、α-松油烯、香芹酚)在一定濃度范圍內(nèi)的還原能力。其他6種單體化合物(p-傘花烴、D-檸檬烯、芳樟醇、4-萜烯醇、α-松油醇和癸醛)以純品測試其還原能力時其FRAP值基本都為零,故未進一步測試。由圖5中各圖的橫縱坐標(biāo)可知,在所測試的單體化合物中,單體化合物的還原能力均隨濃度增加而增強,但濃度范圍有所差異；香芹酚具有最強還原能力,其FRAP值在同濃度下弱低于陽性對照VC,與VC具有可比性；鄰甲氨基苯甲酸甲酯的還原能力其次；接下來是單萜烯,不同單萜烯的還原能力順序有：α-松油烯>萜品油烯>γ-萜品烯>β-蒎烯。結(jié)合3.2節(jié)陳皮揮發(fā)油的組成含量(香芹酚和鄰甲氨基苯甲酸甲酯僅在新會陳皮揮發(fā)油中檢出,單萜烯(α-松油烯、萜品油烯、γ-萜品烯和β-蒎烯)在新會陳皮揮發(fā)油中的相對含量均高于福建陳皮揮發(fā)油)可推測,新會陳皮相比福建陳皮揮發(fā)油具有相對較高的還原能力可能與新會陳皮揮發(fā)油中含有一定量的香芹酚、鄰甲氨基苯甲酸甲酯,以及含有相對含量較高的還原能力較強的單萜烯類化合物有關(guān)。

圖5 陳皮揮發(fā)油單體化合物的還原能力Fig.5 Ferric reducing/antioxidant activity of individual compounds in Citri retriculatae pericarpium volatile oil

3 結(jié)論

本文利用水蒸氣蒸餾法提取新會茶枝柑和福建南平蘆柑陳皮中的揮發(fā)油,并對其組分進行GC-MS分析,共鑒定出23種成分,單萜烯類含量最多,主要成分為D-檸檬烯,其次是γ-萜品烯；新會茶枝柑陳皮揮發(fā)油相比福建南平蘆柑陳皮揮發(fā)油具有相對較低的D-檸檬烯/γ-萜品烯值,福建陳皮揮發(fā)油相比福建陳皮揮發(fā)油具有相對較高含量的倍半萜烯,同時鄰甲氨基苯甲酸甲酯和香芹酚僅在新會陳皮揮發(fā)油中檢出?？寡趸詼y定結(jié)果顯示新會茶枝柑陳皮揮發(fā)油相比福建蘆柑陳皮揮發(fā)油具有相當(dāng)?shù)淖杂苫宄芰洼^強的還原能力；單體中香芹酚的抗氧化性最高,弱低于陽性對照VC,單萜烯(萜品油烯、γ-萜品烯和α-松油烯)抗氧化性其次,D-檸檬烯與醛醇類含氧化合物的抗氧化性較低,鄰甲氨基苯甲酸甲酯無顯著的DPPH自由基清除活性,但具有較強的ABTS陽離子自由清除活性和還原能力。結(jié)合陳皮揮發(fā)油組成和其單體化合物的抗氧化性測試表明單萜烯(萜品油烯、γ-萜品烯和α-松油烯)、香芹酚和鄰甲氨基苯甲酸甲酯對揮發(fā)油的抗氧化性貢獻較大,醛類和醇類含氧化合物對揮發(fā)油的抗氧化性可忽略。此外,單萜烯中雙鍵位置的差異對其抗氧化性影響較大,其構(gòu)效關(guān)系值得進一步探討,同時單萜烯和酚類化合物的抗氧化性是否存在相互影響也值得進一步探討。