金柑果實(shí)主要次生代謝產(chǎn)物含量及差異分析

郭鵬妹，秦艷，趙希娟,2,3,4*，焦必寧,2,3*

1(西南大學(xué)/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 柑桔研究所)，重慶，400712)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，重慶，400712)3(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，重慶，400712) 4(西南大學(xué) 園藝園林學(xué)院，重慶，400715)

金柑(Fortunella)，屬蕓香科(Rutaceae)柑橘亞科(Aurantioideae)柑橘族(Citreae)柑橘亞族(Citrinae)真正柑橘類植物(true citrus fruit trees)，原產(chǎn)于我國(guó)，在廣西融安、陽(yáng)朔，福建尤溪，湖南瀏陽(yáng)、藍(lán)山等地廣泛種植，包括山金柑(F.hindsiiSwingle)、羅浮(F.margaritaSwingle)、羅紋(F.japonicaSwingle)、長(zhǎng)葉金柑(F.polyandraTanaka)、金彈(F.crassifoliaSwingle)和長(zhǎng)壽金柑(F.obovataTanaka)等品種。其中，金彈、羅浮、羅紋和山金柑常用于鮮食和加工，長(zhǎng)壽金柑多用于盆景觀賞[1-3]。金柑果實(shí)味道香甜，皮肉可同食，含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、有機(jī)酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及類黃酮、酚酸等次生代謝產(chǎn)物[4-5]。金柑具有健胃理氣、止咳化痰的功效，果實(shí)提取物具有抗氧化、消炎、抗癌、抗菌等生理功能[6-10]。這些健康功能與次生代謝產(chǎn)物有著密切的聯(lián)系。

金柑雖為柑橘族植物，但是在類黃酮的種類和含量上與柚、橙、寬皮柑橘等柑橘具有明顯的差異[11-12]，除橙皮苷、野漆樹(shù)苷等常見(jiàn)類黃酮，金柑還含有獨(dú)特的類黃酮，如金柑苷、根皮素-3′，5′-二-C-葡萄糖苷等。LOU等[13]在未熟金柑的水提取物中鑒定出7種類黃酮，鄭潔[14]檢測(cè)了金柑果實(shí)中的9種類黃酮，但這些研究中涉及的類黃酮種類較少。此外，香豆素和生物堿也是柑橘中重要的次生代謝產(chǎn)物[15-17]，柚類黃皮層和白皮層中的香豆素，枳實(shí)、枳殼中的生物堿也常被研究鑒定[18]，不同種類金柑中香豆素、生物堿的篩查與研究卻不多。檸檬苦素和諾米林作為柑橘中2種重要的類檸檬苦素，也是影響柑橘苦味的重要物質(zhì)[19]，孟鵬[20]曾在研究中優(yōu)化了提取、純化和檢測(cè)檸檬苦素的方法。綜上所述，現(xiàn)階段對(duì)金柑中的次生代謝產(chǎn)物測(cè)定的種類和數(shù)量偏少，需要更全面與系統(tǒng)的研究。

為進(jìn)一步探索不同種類金柑的價(jià)值，本研究基于超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法(ultra-performance liquid chromatography tandem triple quaternary mass spectrometry, UPLC-QqQ-MS/MS)對(duì)金柑果實(shí)中次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行篩查和定量，次生代謝產(chǎn)物包括31種類黃酮，8種酚酸，3種類檸檬苦素，5種生物堿和19種香豆素。通過(guò)統(tǒng)計(jì)、聚類分析對(duì)6種金柑中的66種次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行綜合分析，研究不同種類金柑間次生代謝產(chǎn)物的差異，為金柑果實(shí)在食品加工、醫(yī)藥等領(lǐng)域的深入研究提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品材料

本研究中采用的金柑果實(shí)均于2019年12月上旬采摘自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘研究所國(guó)家柑橘種質(zhì)資源圃(29°83′N，106°43′E)。在長(zhǎng)勢(shì)相近的果樹(shù)的不同方位均勻地采摘成熟、大小適宜、無(wú)病蟲(chóng)害的金柑果實(shí)。采摘后的金柑果實(shí)用超純水清洗，擦干，制備鮮樣，密封避光存于 -20 ℃冰箱備用。樣品信息和圖片如表1和圖1所示。

表1 6種金柑果實(shí)信息Table 1 Information of six kumquat fruits

a- 溫州羅??；b- 融安金彈；c- 寧波羅紋；d- 金豆；e- 長(zhǎng)壽金柑；f- 金柑雜種圖1 六種金柑果實(shí)的樣品圖Fig.1 Pictures of six kumquat fruits

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與試劑

甲酸(色譜純)，上海吉至生化科技有限公司。

本研究使用66種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，包括31種類黃酮、8種酚酸、3種類檸檬苦素、5種生物堿、19種香豆素。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度和供應(yīng)商信息如下：牡荊素鼠李糖苷(98.07%)、野漆樹(shù)苷(98.48%)、金合歡素(99.44%)、甜橙黃酮(98%)、川陳皮素(99.71%)、桔皮素(98.49%)、蘆丁(99.05%)、蕓香柚皮苷(99.38%)、柚皮苷(98.55%)、橙皮苷(97.06%)、新橙皮苷(98.76%)、香蜂草苷(99.3%)、枸橘苷(98.4%)、橙皮素(98.6%)、根皮素(98.9%)、原兒茶酸(98.12%)、對(duì)羥基苯甲酸(99.9%)、咖啡酸(99.28%)、香草酸(98.8%)、p-香豆酸(99.84%)、芥子酸(98%)、阿魏酸(99.95%)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；半齒澤蘭素-5-甲醚(95%)、異橙皮內(nèi)酯(98%)、歐前胡素(99%)、異歐前胡素(99%)，上海源葉生物技術(shù)有限公司；維采寧-2、斯皮諾素、地奧司明、新地奧司明、香葉木素、5，7，3′，4′-四甲氧基黃酮、3′，4′，5，5′，6，7-六甲氧基黃酮、蔓荊子黃素、5-降甲基蜜桔黃素、5-羥基-7，8，4′-三甲氧基黃酮、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、新圣草枸櫞苷、甲基橙皮苷、柚皮素、檸檬苦素、諾米林、甜菜堿、東莨菪亭、異補(bǔ)骨脂素，純度均大于98%，成都克洛瑪生物科技有限公司；黃柏酮、綠原酸、檸檬內(nèi)酯(98.2%)、香柑醇、花椒毒素、佛手柑內(nèi)酯，純度均大于98%，北京金諦澤浩科技有限公司；大麥芽堿(97.5%)、酪胺(98.5%)、橙皮內(nèi)酯水合物(90%)、橙皮油素(98.5%)、6′，7′-二羥基香檸檬亭(97.8%)、6′，7′-環(huán)氧香檸檬亭(95.1%)、甲醇、乙腈(色譜純)，Sigma-Aldrich (USA)；N-甲基酪胺(99.5%)、濱蒿內(nèi)酯(95%)、5-牻牛兒醇基-7-甲氧基香豆素(99.9%)、8-牻牛兒醇基補(bǔ)骨脂素(98.5%)、香檸檬素(96.9%)、補(bǔ)骨脂素(99.1%)，ChromaDex (USA)；章魚(yú)胺(99.3%)、傘形花內(nèi)酯(99%)，Dr.Ehrenstorfer GmbH (Germany)。所有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均使用甲醇配制，存于 -80 ℃冰箱。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合溶液(下文中簡(jiǎn)稱“混標(biāo)”)中所有酚酸類物質(zhì)的質(zhì)量濃度為400 μg/L，章魚(yú)胺的質(zhì)量濃度為1 000 μg/L，其他標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量濃度為100 μg/L。

1.3 儀器設(shè)備

KQ5200DE 超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q Advantage A10 超純水機(jī)，Millipore (USA)；3K15 高速冷凍離心機(jī)，Sigma-Aldrich (USA)；PB3002-S/FACT 分析天平，Mettler Toledo (Switzerland)；有機(jī)相針式濾器 (13 mm，0.22 mm)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；Acquity UPLC HSS T3色譜柱，Waters (USA)；Nexera X2 UPLC，Shimadzu (Japan)；QTrap?6500+，AB SCIEX (USA)。

1.4 UPLC-QqQ-MS/MS測(cè)定

1.4.1 次生代謝產(chǎn)物的提取

將5.0 g待測(cè)樣品置于離心管，加入15.0 mL甲醇后搖勻，超聲提取30 min(25 ℃，200 W)，10 000 r/min下離心5 min，取上清液移至50.0 mL容量瓶。上述提取和離心步驟重復(fù)1次，將2次提取的上清液合并，用甲醇定容至50.0 mL。上機(jī)前使用0.22 mm有機(jī)相針式濾器過(guò)濾提取液并將其置于進(jìn)樣小瓶。

1.4.2 UPLC-QqQ-MS/MS設(shè)備及條件

本研究測(cè)定次生代謝產(chǎn)物使用的設(shè)備為Shimadzu Nexera X2超高效液相色譜與SCIEX QTrap?6500+聯(lián)用。色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 mm，Waters)，色譜柱溫度為40 ℃，流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為1.0 μL，樣品室溫度為15 ℃，流動(dòng)相A為含有體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的純水,流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫程序如下：0～3 min：10%B～30%B;3～8 min：30%B～80%B;8～8.5 min：80%B～95%B;8.5～12 min：95%B～95%B;12～12.1 min：95%B～10%B;12～15 min：10%B～10%B。進(jìn)樣前后，使用500.0 μL 50%甲醇水沖洗進(jìn)樣針。

質(zhì)譜離子化模式為電噴霧離子源(turbo spray)，正離子模式(ESI+)和負(fù)離子模式(ESI-)，采集模式為程序多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(scheduled multiple reaction monitoring， sMRM)，離子源溫度500.0 ℃，氣簾氣(CUR)35.0 psi，霧化氣(GS1)50.0 psi，輔助氣(GS2)50.0 psi，噴霧電壓(IS)+5 500.0 V和-4 500.0 V。入口電壓(EP)和碰撞室出口電壓(CXP)為10.0 V和15.0 V?；衔锏腗RM參數(shù)，包括離子種類，前體離子，產(chǎn)物離子，去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)，定量MRM離子對(duì)等參照GUO等[21]和ZHAO等[22]的方法。

1.4.3 方法學(xué)驗(yàn)證

每種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用至少5個(gè)適宜濃度的溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)每種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量及其MRM定量離子對(duì)所對(duì)應(yīng)的峰面積進(jìn)行線性擬合得到線性回歸方程，其線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99；日間差是采用連續(xù)3 d對(duì)同一標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定的實(shí)際濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，日內(nèi)差則是同一天對(duì)同一標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)3次進(jìn)樣測(cè)定的實(shí)際濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，各物質(zhì)的日內(nèi)差和日間差分別小于5.60%和5.80%；檢出限指信噪比≥3時(shí)對(duì)應(yīng)的物質(zhì)的濃度，定量限則為信噪比≥10時(shí)對(duì)應(yīng)的物質(zhì)的濃度，所有物質(zhì)的檢出限范圍為0.001～9.57 μg/L，定量限范圍為0.004～21.85 μg/L；本研究采用金柑雜種進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，將適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)品注入金柑雜種果實(shí)的提取液中，通過(guò)計(jì)算提取前后濃度差值與實(shí)際注入濃度的比值得到回收率，各物質(zhì)的回收率均在70%～120%。

1.5 數(shù)據(jù)采集與分析

LC-MS/MS操作和數(shù)據(jù)采集在Analyst?軟件(SCIEX)上進(jìn)行，使用軟件MultiQuant?(SCIEX)進(jìn)行定量。每種樣品均重復(fù)測(cè)定3次，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。使用Excel 2019、SPSS 22.0和Origin 2019b進(jìn)行分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 六種金柑果實(shí)中次生代謝產(chǎn)物的靶向篩查

采用UPLC-QqQ-MS/MS方法對(duì)6種金柑果實(shí)的甲醇提取物中的類黃酮、酚酸、類檸檬苦素、生物堿和香豆素進(jìn)行篩查，6種金柑中定量的次生代謝產(chǎn)物數(shù)量如表2所示，金柑雜種果實(shí)中物質(zhì)最為豐富，高達(dá)48種，相較之下，融安金彈和寧波羅紋的物質(zhì)較少，只有33種?；鞓?biāo)和6種金柑果實(shí)的甲醇提取物的總離子流圖如圖2所示，6種金柑的次生代謝產(chǎn)物的種類和含量具有明顯的不同。6種金柑中均定量了17種類黃酮、4種香豆素、1種酚酸、3種生物堿和2種類檸檬苦素，分別為：枸橘苷、香蜂草苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、新圣草枸櫞苷、川陳皮素、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、蘆丁、金合歡素、牡荊素鼠李糖苷、野漆樹(shù)苷、維采寧-2、新地奧司明、地奧司明、香葉木素、斯皮諾素、濱蒿內(nèi)酯、橙皮內(nèi)酯水合物、異橙皮內(nèi)酯、橙皮油素、芥子酸、酪胺、N-甲基酪胺、甜菜堿、檸檬苦素和諾米林。

表2 六種金柑果實(shí)中定量的次生代謝產(chǎn)物的數(shù)量Table 2 The number of secondary metabolites quantitated in six kumquat fruits

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合液中1-維采寧-2；2-斯皮諾素；3-牡荊素鼠李糖苷；4-野漆樹(shù)苷；5-地奧司明；6-新地奧司明；7-香葉木素；8-金合歡素；9-半齒澤蘭素-5-甲醚；10-5，7，3′，4′-四甲氧基黃酮；11-甜橙黃酮；12-3′，4′，5，5′，6，7-六甲氧基黃酮；13-蔓荊子黃素；14-川陳皮素；15-桔皮素；16-5-降甲基蜜桔黃素；17-5-羥基-7，8，4′-三甲氧基黃酮；18-香蒲新苷；19-蘆??；20-異鼠李素-3-O-新橙皮苷；21-新圣草枸櫞苷；22-蕓香柚皮苷；23-柚皮苷；24-橙皮苷；25-新橙皮苷；26-甲基橙皮苷；27-香蜂草苷；28-枸橘苷；29-柚皮素；30-橙皮素；31-根皮素；32-檸檬苦素；33-諾米林；34-黃柏酮；35-章魚(yú)胺；36-甜菜堿；37-N-甲基酪胺；38-大麥芽堿；39-酪胺；40-原兒茶酸；41-綠原酸；42-對(duì)羥基苯甲酸；43-咖啡酸；44-香草酸；45-p-香豆酸；46-芥子酸；47-阿魏酸；48-傘形花內(nèi)酯；49-橙皮內(nèi)酯水合物；50-濱蒿內(nèi)酯；51-檸檬內(nèi)酯；52-異橙皮內(nèi)酯；53-橙皮油素；54-東莨菪亭；55-5-牻牛兒醇基-7-甲氧基香豆素；56-香柑醇；57-補(bǔ)骨脂素；58-異補(bǔ)骨脂素；59-花椒毒素；60-佛手柑內(nèi)酯；61-6′，7′-二羥基香檸檬亭；62-歐前胡素；63-異歐前胡素；64-6′，7′-環(huán)氧香檸檬亭；65-8-牻牛兒醇基補(bǔ)骨脂素；66-香檸檬素圖2 混標(biāo)及6種金柑果實(shí)的甲醇提取物的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms from mixed standards and methanol extracts of six kumquat fruits

鄭潔[14]在研究中檢測(cè)了15種金柑中9種類黃酮、4種酚酸和2種類檸檬苦素的含量，其中5種金柑品種與本研究一致，所檢測(cè)的5種類黃酮、4種酚酸和2種類檸檬苦素與本研究一致，而在鄭潔研究中未檢出的物質(zhì)，如寧波羅紋、溫州羅浮、融安金彈和長(zhǎng)壽金柑中的牡荊素鼠李糖苷、寧波羅紋中的諾米林等，本研究中均有檢出。OGAWA等[23]在研究中檢測(cè)了5種金柑果皮和汁胞中的橙皮油素，只有香港野生金柑中含有此物質(zhì)，其他金柑中均未檢出，而本研究的金柑果實(shí)中均檢出橙皮油素。這些研究中只對(duì)金柑中的某一種或某幾類物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定和比較，分析不夠全面，本研究共檢測(cè)了31種類黃酮，8種酚酸，3種類檸檬苦素，5種生物堿和19種香豆素，采用的UPLC-QqQ-MS/MS方法定量限低，檢測(cè)的物質(zhì)較多，更有利于對(duì)金柑中的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行全面、系統(tǒng)的分析。

2.2 金柑果實(shí)中類黃酮含量的差異

共測(cè)定了31種類黃酮，包括8種黃酮，9種多甲氧基黃酮，3種黃酮醇，10種黃烷酮和1種二氫查爾酮。6種金柑定量類黃酮的數(shù)量如表2所示，金柑雜種中類黃酮最多，其中多甲氧基黃酮顯著多于其他5種金柑，融安金彈、溫州羅浮和寧波羅紋中類黃酮較少。

6種金柑中定量的17種類黃酮中平均含量高于20 μg/g的物質(zhì)從高到低依次為杜荊素鼠李糖苷、金合歡素、維采寧-2、新橙皮苷、橙皮苷和枸橘苷。由圖3可知，6種金柑的類黃酮組成差異較大。

圖3 六種金柑果實(shí)中類黃酮的含量Fig.3 The contents of flavonoids in six kumquat fruits注：柱狀圖中物質(zhì)順序按箭頭所示方向排列；不同的小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

金柑雜種中的新橙皮苷含量最高(269.60±22.23) μg/g，牡荊素鼠李糖苷、維采寧-2、橙皮苷次之，含量均大于200.00 μg/g，只有根皮素未檢出；金豆中金合歡素含量最高為(294.27±18.08) μg/g，牡荊素鼠李糖苷、野漆樹(shù)苷、枸橘苷和維采寧-2次之，含量均大于10.00 μg/g，蕓香柚皮苷和甲基橙皮苷雖有檢出但含量低于定量限，無(wú)法定量；溫州羅浮中含量最高的為枸橘苷(61.55±1.76) μg/g，金合歡素、牡荊素鼠李糖苷、野漆樹(shù)苷、維采寧-2次之，含量均大于10.00 μg/g，甜橙黃酮、桔皮素、5-羥基-7，8，4′-三甲氧基黃酮、蕓香柚皮苷、甲基橙皮苷和橙皮素雖有檢出但含量低于定量限，無(wú)法定量；長(zhǎng)壽金柑中牡荊素鼠李糖苷含量最高為(108.37±6.30) μg/g，維采寧-2、枸橘苷、野漆樹(shù)苷和金合歡素次之，含量均大于2.00 μg/g，蕓香柚皮苷、甲基橙皮苷、柚皮素、甜橙黃酮、橙皮素和5-羥基-7，8，4′-三甲氧基黃酮也有檢出，但是含量低于定量限，無(wú)法準(zhǔn)確定量；融安金彈中含量最高的為牡荊素鼠李糖苷為(35.08±4.52) μg/g，枸橘苷、野漆樹(shù)苷、維采寧-2、金合歡素次之，含量均大于2.00 μg/g，甜橙黃酮、桔皮素、5-羥基-7，8，4′-三甲氧基黃酮、蕓香柚皮苷、甲基橙皮苷、橙皮素、柚皮素和5-降甲基蜜桔黃素也有檢出，但是含量低于定量限，無(wú)法準(zhǔn)確定量；寧波羅紋中牡荊素鼠李糖苷含量最高為(29.99±0.78) μg/g，其他含量大于2.00 μg/g的包括枸橘苷、維采寧-2、野漆樹(shù)苷和金合歡素，還檢出甜橙黃酮、5-羥基-7，8，4′-三甲氧基黃酮、蕓香柚皮苷、甲基橙皮苷、橙皮素和柚皮素，但含量低于定量限，無(wú)法定量。

從類黃酮的種類來(lái)看，大部分柑橘以黃烷酮為主，占比可達(dá)81%[11]，如橘、甜橙、檸檬中的橙皮苷，柚、酸橙中的柚皮苷含量都極為豐富[24-27]，本研究中金柑與橘、橙、柚等的類黃酮組成具有較大差異，6種金柑中黃酮含量占31種類黃酮總含量的比例最高，金豆、長(zhǎng)壽金柑、融安金彈、寧波羅紋、溫州羅浮和金柑雜種中黃酮含量的占比分別為91.20%、89.68%、72.67%、67.55%、64.31%和49.61%。此外，黃烷酮也是金柑中重要的類黃酮物質(zhì)，金柑雜種、溫州羅浮、寧波羅紋和融安金彈中的黃烷酮占比較高，分別為43.31%、35.44%、32.03%和26.84%，長(zhǎng)壽金柑和金豆中黃烷酮占比較低，為9.51%和8.53%。值得注意的是，在其他柑橘中含量較為豐富的柚皮苷、蕓香柚皮苷、橙皮素在6種金柑中含量較低，新橙皮苷和橙皮苷在金柑雜種中的含量較高，在其他金柑中含量較低，其他金柑中含量最高的黃烷酮為枸橘苷。金柑雜種中9種多甲氧基黃酮的含量占類黃酮總含量的比例為6.75%，而其他5種金柑中多甲氧基黃酮的含量極低，占比均低于0.02%。

在以往的研究中，鄭潔[14]檢測(cè)了溫州羅浮、融安金彈、寧波羅紋、長(zhǎng)壽金柑和金柑雜種果實(shí)干樣中的橙皮苷、新橙皮苷、野漆樹(shù)苷、牡荊素鼠李糖苷和枸橘苷。研究發(fā)現(xiàn)金柑雜種中的枸橘苷含量顯著低于其他金柑，與本研究結(jié)果一致；溫州羅浮、融安金彈、寧波羅紋和長(zhǎng)壽金柑中未檢出牡荊素鼠李糖苷，而本研究在同種類的金柑果實(shí)鮮樣中均檢出牡荊素鼠李糖苷，含量均大于20.00 μg/g；野漆樹(shù)苷只在溫州羅浮、融安金彈和長(zhǎng)壽金柑中檢出，而本研究還在寧波羅紋和金柑雜種中準(zhǔn)確定量了野漆樹(shù)苷；5種金柑中新橙皮苷含量最高為(211.62～1 771.03) μg/g DW，本研究中除金柑雜種外，其他金柑中的新橙皮苷含量較低，均小于1.00 μg/g。WANG等[28]在四季橘果皮干樣中檢出了地奧司明、甜橙黃酮、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、蘆丁，本研究在所有金柑中也檢出這6種物質(zhì)，因樣品、檢測(cè)方法不同，含量具有一定的差異。KAWAII等[29]在研究中測(cè)定了羅紋、金彈和羅浮中的24種類黃酮，其中蕓香柚皮苷含量最高，而在本研究中羅紋、金彈和羅浮中雖檢出蕓香柚皮苷，但低于定量限無(wú)法準(zhǔn)確定量，樣品、提取方法和檢測(cè)方法的不同可能是造成這種差異的原因。維采寧-2、香蜂草苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、斯皮諾素和香葉木素是首次在金柑果實(shí)中檢出。相較于前人的研究，本研究采用的測(cè)定方法定量限更低，測(cè)定的物質(zhì)更多也更加準(zhǔn)確，更有利于全面分析金柑果實(shí)中的類黃酮組成。

2.3 金柑果實(shí)中酚酸含量的差異

研究共測(cè)定了8種酚酸，其中香草酸、對(duì)羥基苯甲酸和原兒茶酸屬于苯甲酸型(C6—C1)，p-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸屬于肉桂酸型(C6—C3)，綠原酸屬于簡(jiǎn)單酚酸聚合物。本研究提取的酚酸為游離態(tài)酚酸，這8種酚酸在6種金柑中均有檢出，但由于部分游離態(tài)酚酸在果實(shí)內(nèi)含量低于定量限，無(wú)法定量。

如圖4所示，6種金柑的酚酸組成有所不同：溫州羅浮、長(zhǎng)壽金柑、融安金彈和寧波羅紋中的酚酸都以芥子酸為主，含量分別為(12.61±0.33)、(1.59±0.052)、(0.28±0.006 8)和(0.23±0.010) μg/g，所占比例均在80%以上，金豆和金柑雜種中芥子酸的占比較低，分別為0.79%和6.89%；金豆中的酚酸以阿魏酸為主,為(9.67±0.18) μg/g，占所測(cè)酚酸總量的74.56%，其他5種金柑中阿魏酸的占比均在11.00%以下；金柑雜種以綠原酸為主為(2.19±0.34) μg/g，占比為89.86%，長(zhǎng)壽金柑中的綠原酸可以定量，占比為12.46%，其他金柑中綠原酸含量低于定量限，無(wú)法定量。溫州羅浮的酚酸總含量最高，與金豆差異不顯著，與其他金柑差異顯著；金柑雜種的酚酸總含量與長(zhǎng)壽金柑的差異不顯著，與其他4種金柑差異顯著；融安金彈和寧波羅紋的酚酸總含量較低，均在0.50 μg/g以下，且兩者差異顯著。

圖4 六種金柑果實(shí)中酚酸的含量Fig.4 The contents of phenolic acids in six kumquat fruits

在鄭潔[14]的研究中，溫州羅浮和長(zhǎng)壽金柑中芥子酸的含量最高，與本研究的結(jié)果一致;寧波羅紋和融安金彈中的酚酸以芥子酸和p-香豆酸為主，而本研究中只有金豆中的p-香豆酸可以被定量，含量為(1.25±0.017) μg/g，其他金柑果實(shí)中p-香豆酸可被檢出，但含量小于定量限，無(wú)法定量。造成差異的原因是提取方法不同，鄭潔提取的為結(jié)合態(tài)酚酸，而本研究提取的為游離態(tài)酚酸。WANG等[28]在四季橘果皮干樣中檢出綠原酸、阿魏酸、芥子酸、p-香豆酸和咖啡酸，其中綠原酸含量最高，這與本研究中金柑雜種的測(cè)定結(jié)果一致。

2.4 金柑果實(shí)中香豆素含量的差異

研究共測(cè)定了8種普通香豆素和11種呋喃香豆素。每種金柑所含的香豆素種類和含量都不同。如圖5所示，從香豆素類物質(zhì)總含量來(lái)看，最高的是金豆,為(47.60±4.06) μg/g;金柑雜種和長(zhǎng)壽金柑的總含量均低于3.50 μg/g,且兩者差異不顯著;融安金彈、寧波羅紋和溫州羅浮的香豆素類物質(zhì)總含量均低于0.50 μg/g。從金柑品種來(lái)看，每種金柑的香豆素組成各有不同：溫州羅浮中的濱蒿內(nèi)酯含量最高為(0.058±0.007 2) μg/g，6′，7′-二羥基香檸檬亭和異歐前胡素也有檢出，5-牻牛兒醇基-7-甲氧基香豆素、花椒毒素、傘形花內(nèi)酯有檢出，但低于定量限，無(wú)法定量；融安金彈的橙皮油素含量最高，為(0.099±0.014) μg/g，6′，7′-二羥基香檸檬亭、花椒毒素和香柑醇也有檢出，5-牻牛兒醇基-7-甲氧基香豆素和異歐前胡素有檢出，但低于定量限，無(wú)法定量；寧波羅紋中的橙皮油素含量最高，為(0.076±0.009 9) μg/g，6′，7′-二羥基香檸檬亭和花椒毒素也有檢出，5-牻牛兒醇基-7-甲氧基香豆素含量低于定量限，無(wú)法定量；金豆含量最高的為橙皮油素(32.68±3.41) μg/g，花椒毒素、傘形花內(nèi)酯、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯和補(bǔ)骨脂素也有檢出，異補(bǔ)骨脂素含量低于定量限，無(wú)法定量；長(zhǎng)壽金柑中的6′，7′-二羥基香檸檬亭含量最高，為(0.63±0.18) μg/g，香檸檬素、6′，7′-環(huán)氧香檸檬亭、花椒毒素、香柑醇和異歐前胡素也有檢出，5-牻牛兒醇基-7-甲氧基香豆素含量低于定量限，無(wú)法定量；金柑雜種中濱蒿內(nèi)酯含量最高，為(2.19±0.17) μg/g，異歐前胡素、傘形花內(nèi)酯和6′，7′-二羥基香檸檬亭也有檢出，5-牻牛兒醇基-7-甲氧基香豆素和歐前胡素含量低于定量限，無(wú)法定量。

圖5 六種金柑果實(shí)中普通香豆素和呋喃香豆素的含量Fig.5 The contents of coumarins and furanocoumarins in six kumquat fruits注：金豆的香豆素含量對(duì)應(yīng)左軸，其他金柑的香豆素含量對(duì)應(yīng)右軸；柱狀圖中物質(zhì)順序按箭頭所示方向排列；檸檬內(nèi)酯、東莨菪亭、5-牻牛兒醇基-7-甲氧基香豆素、異補(bǔ)骨脂素和8-牻牛兒醇基補(bǔ)骨脂素在6種金柑中未檢出或低于定量限無(wú)法被準(zhǔn)確定量，故未統(tǒng)計(jì)在圖中

6種金柑中均檢出5種香豆素：濱蒿內(nèi)酯、歐前胡素、異橙皮內(nèi)酯、橙皮內(nèi)酯水合物和橙皮油素。濱蒿內(nèi)酯在金柑雜種中的含量較高，大于2.00 μg/g，占香豆素總含量的67.96%，其他金柑中其含量均低于0.10 μg/g。歐前胡素在金豆中含量最高，為(10.83±0.47) μg/g，占金豆中香豆素總含量的22.76%，而在其他5種金柑中含量均低于0.01 μg/g。異橙皮內(nèi)酯在6種金柑中含量范圍為2.56～22.79 ng/g，占比均小于3.00%。橙皮內(nèi)酯水合物在金豆中含量最低,為(6.87±0.52) ng/g，長(zhǎng)壽金柑中含量最高，為(144.63±5.20) ng/g。金豆、寧波羅紋、融安金彈、長(zhǎng)壽金柑、金柑雜種和溫州羅浮中的橙皮油素占香豆素總含量的比例分別為68.66%、35.25%、30.72%、22.81%、22.50%和12.84%。MERCOLINI等[30]在羅浮果實(shí)干樣中檢出橙皮油素和傘形花內(nèi)酯，OGAWA等[23]檢測(cè)了香港野生金柑、金彈、羅浮、Marumi金柑和Malayan金柑,橙皮油素只在香港野生金柑的果皮和汁胞中有檢出，含量為0.130和0.014 mg/g DW，本研究在6種金柑中均檢測(cè)到橙皮油素，與香港野生金柑同種的金豆中橙皮油素含量為(32.68±3.41) μg/g，顯著高于其他5種金柑，因此，本研究推測(cè)山金柑中的橙皮油素含量顯著高于其他金柑種類。以往的研究對(duì)柚果實(shí)中的香豆素測(cè)定較多，聶嘉琳等[15]測(cè)定了6種柚果實(shí)中11種香豆素的含量，而本研究首次測(cè)定了金柑果實(shí)中19種香豆素的含量，濱蒿內(nèi)酯、歐前胡素、異橙皮內(nèi)酯、橙皮內(nèi)酯水合物等均是首次在金柑中檢出。

2.5 金柑果實(shí)中類檸檬苦素含量的差異

本研究共測(cè)定了檸檬苦素、諾米林和黃柏酮3種類檸檬苦素，具體含量如表3所示。6種金柑的檸檬苦素含量均高于5.00 μg/g，金柑雜種中的檸檬苦素含量最高，為金豆中的16倍，且與其他5種金柑差異顯著，金豆中的檸檬苦素含量最低，與其他5種金柑差異顯著，融安金彈、寧波羅紋和長(zhǎng)壽金柑之間差異不顯著；長(zhǎng)壽金柑中諾米林的含量最高，是溫州羅浮的848倍，溫州羅浮中諾米林的含量最低，除寧波羅紋和金豆之間差異不顯著外，其他金柑之間差異均顯著；6種金柑中的黃柏酮含量較低且均在0.10 μg/g以下。

除枸櫞的果皮和果肉中諾米林含量大于檸檬苦素外[31]，大部分柑橘中的檸檬苦素含量均大于諾米林。孟鵬[20]測(cè)定了尤溪金柑、贛州臍橙、琯溪蜜柚和廣元柑橘干樣中檸檬苦素和諾米林的含量，除贛南臍橙外，其他3種樣品中檸檬苦素的含量均高于諾米林，本研究測(cè)定的6種金柑中類檸檬苦素的含量從高到低依次為：檸檬苦素、諾米林、黃柏酮，可以推測(cè)金柑全果中檸檬苦素和諾米林含量與柚、橘等中的規(guī)律一致：檸檬苦素>諾米林。

表3 六種金柑果實(shí)的類檸檬苦素組分及含量 單位：μg/g

2.6 金柑果實(shí)中生物堿含量的差異

研究共測(cè)定了5種生物堿，分別為章魚(yú)胺、甜菜堿、N-甲基酪胺、大麥芽堿和酪胺。6種金柑中均檢出這5種生物堿，其中甜菜堿、N-甲基酪胺、酪胺均被準(zhǔn)確定量，但在溫州羅浮、融安金彈、寧波羅紋和金豆中，章魚(yú)胺和大麥芽堿含量低于定量限，無(wú)法準(zhǔn)確定量。

如圖6所示，長(zhǎng)壽金柑中的生物堿含量最高，與其他5種金柑差異顯著；融安金彈、寧波羅紋和金柑雜種的生物堿總含量之間差異不顯著，與其他3種金柑差異顯著；金豆和溫州羅浮的生物堿總含量差異不顯著，與其他4種金柑差異顯著。金柑雜種中的主要生物堿為N-甲基酪胺、酪胺和章魚(yú)胺，占比分別為74.67%、13.56%和9.79%，甜菜堿和大麥芽堿的含量均低于0.20 μg/g；長(zhǎng)壽金柑中酪胺含量最高，占生物堿總含量的74.01%，N-甲基酪胺次之，占比為24.64%，章魚(yú)胺、甜菜堿和大麥芽堿的含量均在0.50 μg/g以下；融安金彈中的酪胺和N-甲基酪胺的含量分別為(8.61±1.14)和(3.71±0.34) μg/g,占比為68.30%和29.43%；寧波羅紋中酪胺和N-甲基酪胺的占比為72.22%和24.85%，含量分別為(8.57±0.83)和(2.95±0.22) μg/g；溫州羅浮中的酪胺、N-甲基酪胺占比分別為62.44%、32.98%。融安金彈、寧波羅紋、溫州羅浮中的甜菜堿的含量均低于0.50 μg/g；金豆中酪胺、N-甲基酪胺和甜菜堿的占比為61.79%、24.48%和13.73%，含量分別為(3.92±0.23)、(1.55±0.04)和(0.87±0.081) μg/g。綜上所述，金柑雜種含量最高的生物堿為N-甲基酪胺，其他5種金柑中含量最高的生物堿均為酪胺。ZHANG等[32]在研究中測(cè)定了寬皮柑橘和甜橙中生物堿的含量，結(jié)果表明，除辛弗林外，N-甲基酪胺是主要的生物堿，其次是章魚(yú)胺，金柑雜種是金柑與寬皮柑橘雜交所得，故與寬皮柑橘的生物堿組成相似，其他金柑與寬皮柑橘和橙類組成差異較大。

圖6 六種金柑果實(shí)中生物堿的含量Fig.6 The contents of alkaloids in six kumquat fruits

2.7 金柑果實(shí)中類黃酮、酚酸、生物堿、類檸檬苦素和香豆素5類物質(zhì)的比較與分析

對(duì)6種金柑果實(shí)中類黃酮、酚酸、生物堿、類檸檬苦素和香豆素類物質(zhì)的含量進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖7所示。

圖7 類黃酮、酚酸、類檸檬苦素、生物堿和香豆素在不同的金柑果實(shí)中的積累規(guī)律Fig.7 Accumulation patterns of flavonoids, phenolic acids, limonoids, alkaloids and coumarins in different kumquat fruits注：圖中物質(zhì)的含量進(jìn)行了歸一化處理。如圖例所示，物質(zhì)含量從紅到綠依次遞減

6種金柑的酚酸、類黃酮、生物堿、類檸檬苦素和香豆素類物質(zhì)的代謝具有多樣性，融安金彈和寧波羅紋的代謝積累模式相近，因此這2個(gè)品種在聚類分析中被歸為一類，這2種金柑依次與溫州羅浮、長(zhǎng)壽金柑、金豆和金柑雜種聚類之后組成更高的分類單元，后面4種金柑中的類黃酮、酚酸、生物堿、類檸檬苦素和香豆素的代謝積累模式之間差異較大。

長(zhǎng)壽金柑中的10種次生代謝產(chǎn)物的含量顯著高于其他5種金柑，包括N-甲基酪胺和酪胺2種生物堿，黃柏酮和諾米林2種類檸檬苦素，橙皮內(nèi)酯水合物和異橙皮內(nèi)酯2種香豆素，香柑醇、6′，7′-環(huán)氧香檸檬亭、6′，7′-二羥基香檸檬亭和香檸檬素4種呋喃香豆素；金豆中21種次生代謝產(chǎn)物的含量顯著高于其他5種金柑，包括斯皮諾素、香蜂草苷、柚皮素、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、野漆樹(shù)苷、香葉木素、金合歡素和根皮素8種類黃酮，香草酸、阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸、p-香豆酸、咖啡酸、原兒茶酸6種酚酸，傘形花內(nèi)酯、橙皮油素2種香豆素，花椒毒素、歐前胡素、補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯4種呋喃香豆素和甜菜堿1種生物堿；金柑雜種的27種次生代謝產(chǎn)物的含量顯著高于其他5種金柑，包括21種類黃酮、2種生物堿、1種酚酸、1種類檸檬苦素、1種香豆素和1種呋喃香豆素，這些物質(zhì)中包括了9種多甲氧基黃酮，分別為半齒澤蘭素-5-甲醚、3′，4′，5，5′，6，7-六甲氧基黃酮、5，7，3′，4′-四甲氧基黃酮、川陳皮素、甜橙黃酮、桔皮素、5-降甲基蜜桔黃素、5-羥基-7，8，4′-三甲氧基黃酮、蔓荊子黃素。

根據(jù)《中國(guó)果樹(shù)志·柑橘卷》中的描述，SWINGLE給予金彈種的地位，之后又認(rèn)為金彈是羅浮和羅紋的種間雜種，但是從形態(tài)特征、種子、過(guò)氧化物同工酶、GOT等位基因分析又很難證明這種說(shuō)法，故仍然承認(rèn)金彈種的地位[2]。王炯等[33]基于COS Marker構(gòu)建的UPGMA聚類樹(shù)中金彈和羅紋具有高度一致的遺傳組成，這2種金柑再與羅浮、金豆、四季橘聚類之后組成較高級(jí)的分類單元。

本研究和王炯等[33]的研究均顯示金彈和羅紋代謝積累模式和遺傳組成相似，故推測(cè)金彈與羅紋之間存在一定的關(guān)系。此外，本研究中長(zhǎng)壽金柑和金柑雜種均為金柑和柑橘屬的雜交，但代謝積累模式相差較大，其母本可能不同。綜上所述，以本研究所檢測(cè)的66種次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行對(duì)比，6種金柑中寧波羅紋和融安金彈代謝積累模式相近，溫州羅浮、金豆、金柑雜種和長(zhǎng)壽金柑差異較大，長(zhǎng)壽金柑的差異物質(zhì)主要為生物堿，金豆的差異物質(zhì)主要為類黃酮、酚酸和香豆素，而金柑雜種的差異物質(zhì)多為類黃酮。本研究推測(cè)金柑屬的金彈和羅紋之間代謝積累模式相近，羅浮、山金柑和長(zhǎng)壽金柑之間差異較大，不同種類的長(zhǎng)壽金柑因其母本不同也存在一定的差異。

3 結(jié)論

本研究采用UPLC-QqQ-MS/MS方法對(duì)6種金柑果實(shí)的酚酸、類黃酮、類檸檬苦素、生物堿和香豆素類物質(zhì)進(jìn)行靶向篩查和定量分析，得到了31種類黃酮、8種酚酸、3種類檸檬苦素、5種生物堿、19種香豆素的具體含量。金柑雜種中檢出物質(zhì)最多，溫州羅浮游離態(tài)酚酸總含量最高，長(zhǎng)壽金柑生物堿總含量最高，金豆的香豆素總含量最高，金柑雜種類黃酮總含量和類檸檬苦素總含量最高；6種金柑的31種類黃酮中，黃酮占比最高，黃烷酮次之，牡荊素鼠李糖苷、野漆樹(shù)苷和維采寧-2為6種金柑中含量較高的類黃酮；寧波羅紋、溫州羅浮、融安金彈和長(zhǎng)壽金柑中的酚酸都以芥子酸為主，金豆、金柑雜種則分別以阿魏酸、綠原酸為主；金柑中類檸檬苦素含量大小均為:檸檬苦素>諾米林>黃柏酮；本研究首次對(duì)不同金柑中的生物堿和香豆素進(jìn)行了定量分析，酪胺、N-甲基酪胺、甜菜堿、章魚(yú)胺、大麥芽堿、濱蒿內(nèi)酯、橙皮內(nèi)酯水合物、異橙皮內(nèi)酯等均有檢出，其中香豆素含量最高的是金豆中的橙皮油素，金柑雜種中含量最高的生物堿為N-甲基酪胺，其他5種金柑中含量最高的生物堿為酪胺。采用聚類分析對(duì)6類金柑中66種次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果表明，金柑屬的金彈和羅紋(融安金彈和寧波羅紋)代謝積累模式相近，羅浮(溫州羅浮)、山金柑(金豆)和長(zhǎng)壽金柑之間差異較大。本研究證實(shí)了金柑種間和種內(nèi)果實(shí)次生代謝產(chǎn)物具有差異性，研究結(jié)果為金柑果實(shí)在食品加工和鮮食提供參考，同時(shí)也為金柑果實(shí)在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。