三種小麥麩皮總黃酮的體外抗氧化活性

馮艷鈺,臧延青

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院,黑龍江 大慶,163000)

小麥麩皮是小麥面粉加工中的主要副產(chǎn)物,每年產(chǎn)量有3 000萬t以上,除了具有較高的纖維含量外,還含有黃酮類化合物、多酚等多種活性物質(zhì)[1]。但由于小麥麩皮口感差,不易食用,在加工中大多被作為飼料或被丟棄[2]。若能從中提取黃酮類化合物,則可以提高小麥副加值。

自然界中的黃酮類化合物大多是多羥基化合物,其溶解度與分子結(jié)構(gòu)及取代基的種類有關(guān)[3]。游離的黃酮類化合物一般難溶或不溶于水,易溶于甲醇、乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑中[4]。其中平面型分子結(jié)構(gòu)中存在交叉共軛體系,分子間排列緊密,引力較大,因而難溶于水,如黃酮醇、查爾酮類等。而非平面型分子分子間排列不緊密,可以引入較多的羥基,有利于增加親水性,因而水溶性相應(yīng)加大,如黃酮苷、二氫黃酮醇等[5]。目前常用的黃酮類化合物提取主要依據(jù)相似相溶性,按化合物結(jié)構(gòu)來選擇相似極性的溶劑進(jìn)行提取[6]。蕎麥麩皮中的黃酮類化合物大多為黃酮苷元及黃酮苷。此外,黃酮類化合物的羥基糖苷化后,水溶解度增加,易溶強(qiáng)極性溶劑[7],如水、甲醇、乙醇等,且結(jié)構(gòu)中引入的糖苷鏈越長,在水中的溶解度就越大[8]。

本文以河南地區(qū)種植提取的小麥(豫教5號、鄭麥7698、西農(nóng)979)麩皮為原料,采用不同有機(jī)溶劑(乙醇、甲醇、丙酮)分別提取小麥麩皮中的總黃酮,測定不同溶劑提取的小麥麩皮總黃酮含量,并考察小麥麩皮總黃酮類化合物的總還原力和自由基清除能力,以及對細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

3種小麥麩皮(豫教5號、鄭麥7698、西農(nóng)979)來源于河南??；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,安徽酷兒爾生物工程有限公司；無水乙醇、甲醇,遼寧泉瑞試劑有限公司；丙酮,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；DPPH,美國Sigma公司；2′,7′-dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA),上海碧云天生物技術(shù)有限公司；所有分離用有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純。

高速萬能粉碎機(jī),天津市秦斯特儀器有限公司；BN0283電子天平,上海民橋精密儀器有限公司；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋,江蘇省榮華儀器制造有限公司；TD4A臺式離心機(jī),長沙英泰儀器有限責(zé)任公司；V5 100型可見分光光度計(jì),上海元析儀器有限公司；DGG-9140B型電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；CytoFLEX流式細(xì)胞分析儀,美國Beckman Coulter公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原材料預(yù)處理

將3種小麥麩皮放入50 ℃干燥箱中,烘干12 h后收集。經(jīng)粉碎后的麥麩粉末過60目篩,稱重備用。

1.2.2 總黃酮提取工藝

1.2.2.1 乙醇對3種小麥麩皮總黃酮的提取工藝

按孟麗媛等[14]提取西蘭花多酚的工藝參數(shù)稍作修改,3個裝有60 mL 體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液的蒸餾瓶,依次向其中加入4 g不同品種的麥麩粉末,然后進(jìn)行冷凝回流,60 ℃提取2 h。將過濾后的濾液備用,濾渣按上述方法再提取1次,2次濾液合并,3 600 r/min下離心15 min,取上清液置于4 ℃冰箱中待用。將上清液放于大燒杯內(nèi),置于45 ℃水浴鍋中,揮發(fā)掉有機(jī)溶劑,待濾液顏色變深且黏稠后,從水浴鍋中取出,置于50 ℃干燥箱內(nèi)烘干至恒重,置于4 ℃冰箱中待用[15]。

1.2.2.2 甲醇對3種小麥麩皮總黃酮的提取工藝

取3個裝有60 mL 體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液的蒸餾瓶,依次向其加入4 g不同品種的麥麩粉末,實(shí)驗(yàn)步驟同1.2.2.1小節(jié)中的方法。

1.2.2.3 丙酮對3種小麥麩皮總黃酮的提取工藝

取3個裝有60 mL 體積分?jǐn)?shù)為80%的丙酮溶液的蒸餾瓶,依次向其加入4 g不同品種的麥麩粉末,實(shí)驗(yàn)步驟同1.2.2.1小節(jié)中的方法。

1.2.3 總黃酮得率計(jì)算

1.2.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按陜西苦菜葉總黃酮含量測定方法稍作修改,最后用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇定容,得到質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液[16]。選取6個潔凈干燥的10 mL容量瓶,分別向其中移取0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后按照羅俊等[17]的方法進(jìn)行測定，最后用30%乙醇定容,振蕩并靜置15 min后,于510 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)510 nm,繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 總黃酮的測定及得率的計(jì)算

用體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇溶液充分溶解0.01 g小麥麩皮總黃酮并定容至100 mL,取1.0 mL的黃酮樣液,選取6個潔凈干燥的10 mL容量瓶,分別向其中移取0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL上述所制的溶液。最后用體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇定容,振蕩并靜置15 min后,然后對吸光度進(jìn)行測定,通過公式(1)計(jì)算總黃酮得率:

(1)

式中：ρ,根據(jù)吸光度值計(jì)算出的溶液質(zhì)量濃度,mg/mL；D,溶液稀釋倍數(shù)；V,供試品溶液體積,mL；m,小麥麩皮取樣量,mg。

1.2.4 小麥麩皮總黃酮提取物體外抗氧化活性測定

配制質(zhì)量濃度為0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mg/mL的不同溶劑樣品提取液,最后用30%乙醇定容,振蕩并靜置15 min后,于700 nm處測定吸光度[18]。

1.2.4.2 小麥麩皮總黃酮對·OH的清除作用

以PAN[19]的實(shí)驗(yàn)參數(shù)為基礎(chǔ)稍作修改。取3支試管按照表1加入9 mmol/L的FeSO4,提取液和0.5%的H2O2等試劑,將其混合均勻后,在室溫條件下靜置10 min,接著都加入9 mmol/L的水楊酸-乙醇,將混勻后的溶液置于25 ℃下,水浴30 min,以蒸餾水作為空白對照,在510 nm處測定吸光度值,通過公式(2)計(jì)算·OH清除率：

(2)

式中：A1，測試液1(2.0 mL水楊酸-乙醇+2.0 mL FeSO4+2.0 mL SDF+2.0 mL H2O2)的吸光度值；A2，測試液2(2.0 mL FeSO4+2.0 mL SDF+2.0 mL H2O+2.0 mL H2O2)的吸光度值；A3，測試液3(2.0 mL水楊酸-乙醇+2.0 mL FeSO4+2.0 mL H2O+2.0 mL H2O2)的吸光度值。

1.2.4.3 小麥麩皮總黃酮對DPPH自由基的清除作用

2.3 siRNA能顯著抑制lncRNA ASB16-AS1的表達(dá) 因?yàn)閘ncRNA ASB16-AS1在先前的研究中已經(jīng)確定在腫瘤組高表達(dá)，并且與腫瘤分期分級顯著相關(guān)。因此本研究選擇使用siRNA抑制lncRNA ASB16-AS1的表達(dá)以觀測細(xì)胞功能改變。LN382細(xì)胞和U87MG細(xì)胞在轉(zhuǎn)染24～48 h后用qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示應(yīng)用抑制劑后lncRNA ASB16-AS1表達(dá)量明顯降低(見圖2A)。這說明本實(shí)驗(yàn)中所使用的siRNA能有效抑制lncRNA ASB16-AS1的表達(dá)。

參考ADHIKARI等[20]的實(shí)驗(yàn)參數(shù),取1.0 mL的黃酮樣液,選取6個潔凈干燥的10 mL容量瓶,分別向其中移取0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL上述所制的溶液。定容后,用移液管分別移取0.2 mL總黃酮提取液置于10 mL棕色比色管中,加人6 mL,0.06 mmol/L DPPH溶液,定容至10 mL,振蕩搖勻,將混勻后的溶液置于25 ℃條件下,水浴30 min。以蒸餾水作為空白對照,在510 nm處測定吸光度值,通過公式(3)計(jì)算DPPH自由基清除率：

(3)

式中：A1,總黃酮的DPPH自由基溶液反應(yīng)吸光度；A2,待測總黃酮吸光度；A3,未加總黃酮的DPPH自由基溶液反應(yīng)吸光度。

1.2.4.4 小麥麩皮總黃酮對人胃癌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的調(diào)控作用

指數(shù)生長期階段的胃癌細(xì)胞接種到直徑為3.5 cm培養(yǎng)皿中,于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一晝夜,每孔分別加入濃度梯度小麥麩皮總黃酮處理,收集細(xì)胞懸液到離心管內(nèi),離心后棄去上清液,加入1 mL PBS溶液,重懸細(xì)胞,加入DCFH-DA。恒溫水浴鍋中37 ℃閉光孵育20 min,置于流式管,通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡數(shù)量。DCFH-DA是一種通用的氧化應(yīng)激指示劑,具細(xì)胞膜滲透性,一旦進(jìn)入細(xì)胞后,會與細(xì)胞液中的酯酶水解生成2′,7′-二氯二氫熒光素并被氧化生成強(qiáng)熒光的2′,7′-二氯熒光素,因此可用此特性來檢測細(xì)胞氧化還原過程[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用SPDD軟件。組間的多重比較采用單因素方差分析和Tukey事后檢驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥麩皮提取物中總黃酮含量的測定

2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.428 9x+0.002 6(R2=0.999 5)。該結(jié)果表明蘆丁在0～0.5 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)吸光值與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.2 不同小麥麩皮的總黃酮含量

為了研究不同有機(jī)溶劑對小麥麩皮中總黃酮提取率的影響,采用乙醇、甲醇、丙酮分別提取小麥麩皮(豫教5號、鄭麥7 698、西農(nóng)979)中的總黃酮。結(jié)果如圖1所示,在3種溶劑中乙醇溶液的提取量最高,表明在乙醇溶液中溶出黃酮類物質(zhì)最多。且在3種小麥麩皮中,乙醇提取的鄭麥7 698總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.20 mg/g,這可能與不同品種的小麥麩皮總黃酮中各黃酮類化合物組分不同有關(guān)。研究表明,黃酮類化合物在植物體中通常與糖苷鍵結(jié)合成苷類[22],因而蕎麥麩皮中的黃酮類化合物大多為黃酮苷元及黃酮苷,易溶于強(qiáng)極性溶劑[23]。實(shí)驗(yàn)中所用的溶劑極性大小為甲醇>乙醇>丙酮,分子間作用力降低,極性相似相溶[24],因此植物的甲醇提取物中的極性成分應(yīng)該比乙醇提取率更高。但結(jié)果出現(xiàn)乙醇提取3種小麥麩皮的總黃酮提取率大于甲醇,可能是由于小麥麩皮中含酚羥基多的黃酮苷類數(shù)量較少[25-26],溶解于甲醇中的黃酮類化合物量降低,此外小麥麩皮總黃酮提取液中還存在一些含有葉綠素,胡蘿卜素等脂溶性色素,這類色素難溶于甲醇,易溶于乙醇[27]。

圖1 三種小麥麩皮不同溶劑提取物總黃酮含量Fig.1 Total flavonoid content of three wheat bran extracted by different solvents

2.2 小麥麩皮總黃酮提取物的總還原力

2.2.1 小麥麩皮總黃酮甲醇提取物的總還原力

研究表明,樣品的還原能力與其抗氧化活性之間有顯著的正相關(guān)性,還原力的高低可以反映抗氧化能力的強(qiáng)弱[28]。如圖2所示,以VC作陽性對照時,用甲醇溶劑分別提取3種小麥麩皮總黃酮，在0.3～1.5 mg/mL范圍內(nèi)吸光度隨小麥麩皮總黃酮質(zhì)量濃度的增加而增加。

圖2 甲醇提取的3種小麥麩皮總黃酮的總還原力Fig.2 Total reducing power of total flavonoids from three wheat brans extracted by methanol

在1.5 mg/mL時,甲醇提取的3種小麥麩皮總黃酮和Vc總還原力作用大小為：Vc>西農(nóng)979小麥麩皮>鄭麥7698小麥麩皮>豫教5號小麥麩皮,四者均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。其中西農(nóng)979小麥麩皮總黃酮與鄭麥7698小麥麩皮總還原力相近,其原因可能是西農(nóng)979小麥與鄭麥7698小麥屬于多穗型,而豫教5號屬于重穗型,不同穗型小麥的根系活力和生長對不同水氮耦合的響應(yīng)是不同的,氮素供應(yīng)增加能夠提高多穗型小麥植株中超氧化物歧化酶和酚過氧化物酶的活性[22]。

2.2.2 小麥麩皮總黃酮乙醇提取物的總還原力

如圖3所示,以VC作為陽性對照,3種小麥麩皮乙醇提取液在0.3～1.5 mg/mL范圍內(nèi),其吸光度與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。提取液質(zhì)量濃度在0.3和1.2 mg/mL時,豫教5號小麥麩皮中總黃酮的吸光度略大于鄭麥7698小麥麩皮；質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL時,乙醇提取的3種小麥麩皮總黃酮和Vc總還原力作用大小依次為：Vc>西農(nóng)979小麥麩皮>鄭麥7698小麥麩皮>豫教5號小麥麩皮,四者均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。小麥麩皮的總黃酮還原力大小會由于小麥種類、生長環(huán)境條件等的不同而有所差異。其中耐旱性品種的西農(nóng)979小麥麩皮的還原力較強(qiáng),可能與西農(nóng)979小麥具有較高的抗氧化和活性氧調(diào)控能力相關(guān)[22]。

圖3 三種小麥麩皮總黃酮乙醇提取物的總還原力Fig.3 Total reducing power of total flavonoids from three wheat brans extracted by ethanol

2.2.3 小麥麩皮總黃酮丙酮提取物的總還原力

如圖4所示,以Vc作為陽性對照,丙酮提取3種小麥麩皮總黃酮，質(zhì)量濃度在0.3～1.5 mg/mL范圍內(nèi),隨著質(zhì)量濃度的增加,3種小麥麩皮總黃酮的吸光度隨之增強(qiáng)。在1.5 mg/mL時,Vc的吸光度為2.281,鄭麥7698小麥麩皮中總黃酮的吸光度為0.593。在0.3～0.9 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),丙酮提取的3種小麥麩皮總黃酮和Vc總還原力作用大小為：Vc>西農(nóng)979小麥麩皮>鄭麥7698小麥麩皮>豫教5號小麥麩皮。在0.9～1.5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),丙酮提取的3種小麥麩皮總黃酮和Vc總還原力作用大小為：Vc>鄭麥7698小麥麩皮>西農(nóng)979小麥麩皮>豫教5號小麥麩皮,四者均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。由圖4可知,丙酮提取的西農(nóng)979小麥麩皮總黃酮與鄭麥7698小麥麩皮吸光度相近,與圖3、圖2結(jié)果不同的原因,可能是由于丙醇提取鄭麥7698小麥麩皮過程中溶出少量酚酸[23],造成測定差異。不同劑量下小麥麩皮總黃酮的還原力還與其丙酮提取過程中溶出的總酚酸含量存在正相關(guān),也可能是造成鄭麥7698小麥麩皮總黃酮還原力略高于西農(nóng)979小麥麩皮的誤差原因。

圖4 三種麥麩丙酮提取物的總還原力Fig.4 Total reducing power of total flavonoids from three wheat brans extracted by acetone

2.3 小麥麩皮總黃酮提取物對·OH的清除作用

2.3.1 小麥麩皮總黃酮甲醇提取物對·OH的清除作用

如圖5所示,3種小麥麩皮總黃酮甲醇提取物對·OH清除率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。質(zhì)量濃度為0.10～0.20 mg/mL時,西農(nóng)979小麥麩皮中總黃酮的·OH清除率略高于鄭麥7698。在0.25 mg/mL時,Vc、豫教5號、鄭麥7698、西農(nóng)979小麥麩皮中總黃酮的·OH清除率分別為93.58%、62.23%、71.49%和68.02%。

圖5 三種小麥麩皮總黃酮甲醇提取物對·OH的清除作用Fig.5 Scavenging effects of three wheat bran methanol extracts on hydroxyl radicals

由此可知，用甲醇提取的3種小麥麩皮總黃酮和Vc對·OH清除能力依次為：Vc>鄭麥7698小麥麩皮>西農(nóng)979小麥麩皮>豫教5號小麥麩皮,四者均呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。小麥麩皮總黃酮清除·OH能力的大小不僅與其中總黃酮的含量有關(guān),而且與小麥種類有關(guān)。雖然在不同質(zhì)量濃度條件下,7698小麥麩皮總黃酮清除·OH能力與西農(nóng)979小麥麩皮存在不同,但是,無論是鄭麥7698還是西安979,品種之間清除·OH能力差異較小。

2.3.2 小麥麩皮總黃酮乙醇提取物對·OH的清除作用

由圖6可知,在研究3種小麥麩皮總黃酮乙醇提取物對·OH清除率時,隨著提取物質(zhì)量濃度的增加,·OH清除率隨之增加。以Vc作為陽性對照,在0.20 mg/mL時,Vc、豫教5號、鄭麥7698、西農(nóng)979小麥麩皮中總黃酮的·OH清除率分別為90.08%、48.23%、61.10%和60.20%；在0.25 mg/mL時,Vc、豫教5號、鄭麥7698、西農(nóng)979小麥麩皮中總黃酮的清除率分別為94.89%、62.32%、72.04%和75.04%。由此可知,質(zhì)量濃度小于0.20 mg/mL時,采用乙醇提取的3種小麥麩皮中總黃酮和Vc對·OH清除能力依次為：Vc>鄭麥7698>西農(nóng)979>豫教5號小麥麩皮；在質(zhì)量濃度大于0.20 mg/mL時,采用乙醇提取的3種小麥麩皮總黃酮和Vc對·OH清除能力依次為：Vc>西農(nóng)979小麥麩皮>鄭麥7698小麥麩皮>豫教5號小麥麩皮,四者均呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。其中7698小麥麩皮與979小麥麩皮品種之間的·OH清除率差異較小,可能是由于品種相似的原因。

圖6 三種小麥麩皮總黃酮乙醇提取物對·OH的清除作用Fig.6 Scavenging effects of three wheat bran ethanol extracts on hydroxyl radicals

2.3.3 小麥麩皮總黃酮丙酮提取物對·OH的清除作用

由圖7可知,在0.05～0.25 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),3種小麥麩皮總黃酮的丙酮提取液對·OH清除率呈質(zhì)量濃度依賴性。在0.25 mg/mL時,Vc、豫教5號小麥麩皮、鄭麥7698小麥麩皮、西農(nóng)979小麥麩皮中總黃酮的·OH清除率分別為90.10%、58.48%、65.00%和64.57%。由此可知,丙酮提取的3種小麥麩皮中總黃酮和Vc對·OH清除能力依次為：Vc>鄭麥7698小麥麩皮>西農(nóng)979小麥麩皮>豫教5號小麥麩皮,四者均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系?？偟膩碚f,7698小麥麩皮與979小麥麩皮總黃酮對·OH的清除率近似,可能與2種小麥種類特征相似有關(guān)。

圖7 三種小麥麩皮總黃酮丙酮提取物對·OH的清除作用Fig.7 Scavenging effects of three wheat bran acetone extracts on hydroxyl radicals

2.4 小麥麩皮總黃酮提取物對DPPH自由基的清除作用

2.4.1 小麥麩皮總黃酮甲酮提取物對DPPH自由基的清除作用

由圖8可知,隨著樣品質(zhì)量濃度的增加,采用甲醇提取的3種小麥麩皮總黃酮對DPPH自由基的清除率也隨之增強(qiáng)。在0.6～1.2 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),鄭麥7698總黃酮的DPPH自由基清除率略高于另外2種小麥麩皮。低于0.6 mg/mL或是高于1.2 mg/mL時,甲醇提取的3種小麥麩皮總黃酮和Vc對DPPH自由基清除能力依次為：Vc>西農(nóng)979小麥麩皮>鄭麥7698小麥麩皮>豫教5號小麥麩皮,均成明顯的劑量依賴性與線性關(guān)系。

圖8 三種小麥麩皮總黃酮甲醇提取物對DPPH自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effects of three wheat bran methanol extracts on DPPH free radicals

2.4.2 小麥麩皮總黃酮乙醇提取物的DPPH自由基清除作用

由圖9可知,采用乙醇提取3種小麥麩皮總黃酮對DPPH自由基的清除率呈質(zhì)量濃度依賴性，并且同質(zhì)量濃度下,Vc的清除率明顯高于3種小麥麩皮總黃酮的清除率。在1.5 mg/mL時,Vc、豫教5號小麥麩皮、鄭麥7698小麥麩皮、西農(nóng)979小麥麩皮中總黃酮的DPPH自由基清除率分別為90.54%、52.34%、62.42%和68.72%。由此可知,用乙醇提取的3種小麥麩皮總黃酮和Vc對DPPH自由基清除能力依次為：Vc>西農(nóng)979小麥麩皮>鄭麥7698小麥麩皮>豫教5號小麥麩皮?？偟膩碚f,7698小麥麩皮與979小麥麩皮總黃酮對DPPH自由基清除率差異較小,這可能與相似種類小麥的遺傳特性存在差異有關(guān)。

圖9 三種小麥麩皮總黃酮乙醇提取物對DPPH自由基的清除作用Fig.9 Scavenging effects of three wheat bran ethanol extracts on DPPH free radicals

2.4.3 小麥麩皮總黃酮丙酮提取物的DPPH自由基清除作用

由圖10可知,3種小麥麩皮總黃酮丙酮提取液對DPPH自由基的清除率隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而增加。在0.3～0.9 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi),鄭麥7698小麥麩皮總黃酮的DPPH自由基清除率略低于另外2種。因此在該質(zhì)量濃度下,丙酮提取的3種小麥麩皮黃酮和Vc對DPPH自由基清除能力依次為：Vc>西農(nóng)979小麥麩皮>鄭麥7698小麥麩皮>豫教5號小麥麩皮。在0.9～1.5 mg/mL質(zhì)量濃度下,用丙酮提取的3種小麥麩皮總黃酮和Vc對DPPH自由基清除能力依次為：Vc>鄭麥7698小麥麩皮>西農(nóng)979小麥麩皮>豫教5號小麥麩皮。不同劑量下小麥麩皮總黃酮清除DPPH能力與其丙酮提取過程中溶出的少量總酚酸相關(guān),也可能是由于丙酮提取條件下鄭麥7698小麥麩皮溶出黃酮化合物結(jié)構(gòu)類型存在差異。

圖10 三種小麥麩皮總黃酮丙酮提取物對DPPH自由基的清除作用Fig.10 Scavenging effects of three wheat bran acetone extracts on DPPH free radicals

2.5 小麥麩皮總黃酮乙醇提取物對人胃癌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的調(diào)控

活性氧是含有氧原子并且氧化或還原能力很強(qiáng)的數(shù)十種物質(zhì)的總稱,其中有代表性的為超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧脂基和一氧化氮等,它們屬自由基,另外一些活性氧例如過氧化氫、脂過氧化物、次氯酸和過氧亞硝酸等是普通分子[30]。通過前面結(jié)果可知,3種不同的有機(jī)溶劑對小麥麩皮的總黃酮提取能力順序?yàn)椋阂掖?甲醇>丙酮。且各項(xiàng)能力測定結(jié)果均反映采用乙醇提取的總黃酮的總還原力和清除·OH能力最強(qiáng)。為了進(jìn)一步探究乙醇溶劑對不同品種小麥麩皮中黃酮類物質(zhì)對細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響,用濃度梯度的小麥麩皮總黃酮孵育人胃癌AGS細(xì)胞24 h。DCFH-DA是一種非標(biāo)記性的氧化敏感的熒光探針,在自然環(huán)境下不產(chǎn)熒光,但在進(jìn)入細(xì)胞膜后會在細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解生成DCFH,生成的探針DCFH不能自由通過細(xì)胞膜被裝載到細(xì)胞內(nèi)。因此,利用非標(biāo)記性的DCFH-DA探針和流式細(xì)胞術(shù)可有效監(jiān)測小麥麩皮總黃酮對AGS細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響。如圖11所示,用乙醇提取的3種小麥麩皮總黃酮處理細(xì)胞后,特征峰隨質(zhì)量濃度向左移動,通過定量分析發(fā)現(xiàn)，3種小麥麩皮均使細(xì)胞內(nèi)活性氧水平下降,呈質(zhì)量濃度梯度依賴性,且西農(nóng)979使細(xì)胞內(nèi)活性氧水平下降作用明顯強(qiáng)于鄭麥7698和西農(nóng)979。3種小麥麩皮總黃酮乙醇提取物誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平下降與其抗氧化活性有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究采用不同有機(jī)溶劑(乙醇、甲醇、丙酮)分別提取小麥麩皮(豫教5號、鄭麥7698、西農(nóng)979)中的總黃酮。3種有機(jī)溶劑提取總黃酮的能力順序?yàn)椋阂掖?甲醇>丙酮。從體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合來看,3種小麥麩皮的總黃酮均有抗氧化活性,乙醇提取物的總還原力和清除·OH的能力比其他兩者要高,而甲醇提取物清除DPPH自由基的能力略大于乙醇,但總的來說乙醇提取的西農(nóng)979小麥麩皮的總黃酮的抗氧化能力最好。乙醇提取物總還原力依次為：西農(nóng)979小麥麩皮>鄭麥7698小麥麩皮>豫教5號小麥麩皮；乙醇提取物對·OH清除能力依次為：鄭麥7698小麥麩皮>西農(nóng)979小麥麩皮>豫教5號小麥麩皮；乙醇提取物清除DPPH自由基能力依次為：西農(nóng)979小麥麩皮>鄭麥7698小麥麩皮>豫教5號小麥麩皮。各項(xiàng)能力測定結(jié)果均反映乙醇提取物的總黃酮的總還原力和清除羥基自由基的能力最強(qiáng)。乙醇提取的3種小麥麩皮總黃酮能夠有效誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平下降,能力依次為：西農(nóng)979小麥麩皮>鄭麥7698小麥麩皮>豫教5號小麥麩皮。研究結(jié)果為西農(nóng)979小麥麩皮中總黃酮在抗氧化劑的開發(fā)提供了參考。

圖11 三種小麥麩皮總黃酮乙醇提取物對細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響Fig.11 The effects of reactive oxygen species on three wheat bran acetone extracts-induced gastric cancer cells