亞甲基藍對腦缺血再灌注大鼠血腦屏障的保護作用

程方圓，路 凱，劉 捷,白 寧，徐瑞芬，霍 苗，陳 方*

0 引言

缺血性腦卒中是一種極具破壞性的腦血管疾病，有很高的致殘率和死亡率[1]?，F階段，缺血性腦卒中治療原則是恢復缺血區(qū)的血液流通，但某些情況下，恢復血流反而導致更嚴重的損傷[2]。研究顯示，腦缺血再灌注主要損傷血腦屏障的完整性，增加細胞旁路的滲透率，導致氧化應激、炎癥反應的發(fā)生，最終造成神經元凋亡、腦水腫梗死、神經功能損傷，因此，改善血腦屏障完整性是缺血性腦卒中治療的關注重點[3-4]。

亞甲基藍主要應用于高鐵血紅蛋白血癥的治療，具有抗炎、抗氧化的特點[5]。近年來研究顯示，亞甲基藍對缺血性腦卒中具有保護作用，包括經Nrf2/HO-1信號通路，降低腦中自由基ROS表達水平[6]；抑制線粒體釋放細胞色素C,減少細胞凋亡，下調炎癥因子表達水平[7]，最終改善神經功能，減少腦梗死體積和腦水腫[8]。然而，迄今為止，亞甲基藍對血腦屏障的保護作用與機制鮮有報道。因此，本研究觀察亞甲基藍對腦缺血再灌注后血腦屏障通透性的影響，并探討其可能的機制。

1 實驗方法

1.1 藥物與儀器 亞甲基藍(M9140)：美國SIGMA公司；occuldin、claudin-5蛋白抗體：美國Abcam公司(ab128906)；脂質過氧化物(MDA)、抗氧化酶(SOD)、IL-6、IL-1β試劑盒：南京建成公司；伊文思藍(Evans Blue,EB)：美國SIGMA公司；頸動脈栓塞線栓：廣州佳靈生物有限公司；Western blot儀器：美國Bio-Rad公司；凝膠成像儀：南京天能公司。

1.2 動物分組與給藥 SPF級雄性SD大鼠60只，由西安交通大學實驗動物中心提供。SD大鼠按照隨機分配的原則分為5組，每組12只：假手術組，模型組，低劑量組(亞甲基藍1 mg/kg)，中劑量組(亞甲基藍2 mg/kg)，高劑量組(亞甲基藍4 mg/kg)。亞甲基藍組手術前1 d腹腔注射亞甲基藍，恢復灌注后再次腹腔注射亞甲基藍溶液，假手術組、模型組手術注射生理鹽水。

1.3 大鼠局灶腦缺血模型的建立 采用改良的Longa線栓法[9]建立大鼠缺血再灌注模型(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)，自頸外動脈殘端插入線栓并前進至頸內動脈中阻塞血液流通。缺血2 h后抽出線栓，縫合傷口，使血液流通再灌注24 h。假手術組打開頸動脈后立即縫合。

1.4 神經功能評分法 大鼠造模結束24 h后進行評分，評分標準：0分為無神經缺損癥狀，可直線行走；1分為左前肢彎曲，無法伸直；2分為不能直行，單向旋轉大圈；3分為單側傾倒，單向旋轉小圈；4分為不能行走或癱瘓[10]。

1.5 梗死面積計算 取完整大腦，冷凍0.5 h，將大腦切成2 mm×5 mm切片，2% TTC溶液浸沒切片表面，37 ℃條件下避光孵育0.5 h，相機拍攝，Image J量化統(tǒng)計梗死面積，與腦片量化面積對比，記為梗死面積百分比。

1.6 血腦屏障通透性評估 參考文獻[11]，動物處死前2 h腹腔注射2%EB溶液，劑量2 ml/kg。動物斬首后，完整取出大腦并精確稱重，在2.5 ml PBS溶液中勻漿后，加入2.5 ml三氯乙酸(60%)，3 000 r/min離心30 min，使用分光光度計在610 nm處測定伊文思藍的吸光度，對比標準曲線計算得出結果。

1.7 試劑盒檢測 取梗死側海馬組織，以w∶v=1∶9加入PBS溶液，研磨，靜置30 min后12 000 r/min離心30 min，吸取上清液。根據試劑盒說明書添加、孵育、棄去樣品與試液，使用酶標儀在試劑盒指定波長下掃描OD值，繪制標準曲線，計算出含量。

1.8 Western blot檢測 取梗死側海馬組織，加入組織裂解液，冰塊上研磨，靜置后離心。取上清液測試BCA試劑盒，加入與上清液等量5×上樣緩沖液，沸水浴15 min變性蛋白。根據BCA試劑盒所測蛋白含量進行等量上樣。開始SDS凝膠電泳，結束后經PVDF膜轉膜，封閉2 h，4 ℃條件下孵育檢測蛋白抗體10 h。洗凈檢測蛋白抗體后室溫孵育對應鼠/兔源二抗2 h，洗凈二抗后使用顯影儀成像，Image J軟件對條帶進行量化分析。所有蛋白條帶灰度值與內參蛋白灰度值比較后進行歸一化處理。

1.9 數據處理 采用Graphpad prism 5軟件的單因素方差分析中one-way analysis of variance(ANOVA)和Tukey′s test 進行統(tǒng)計分析并作圖，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 亞甲基藍對I/R大鼠腦中梗死面積的影響 大鼠腦缺血再灌注損傷24 h后進行神經功能損傷評分，如圖1A所示，與假手術組相比，模型組大鼠神經功能損傷評分顯著升高(P<0.05)，高劑量亞甲基藍顯著改善了大鼠神經功能損傷(P<0.05)，而低、中劑量亞甲基藍并沒有顯著改善大鼠神經功能評分，提示亞甲基藍發(fā)揮療效存在劑量依賴性的現象。TTC染色用于顯示腦梗死面積，正常腦組織被染成紅色而梗死區(qū)域腦組織呈白色。如圖1B所示，大鼠I/R手術后24 h，缺血側大腦有顯著的梗死，與模型組相比，中、高劑量亞甲基藍治療顯著減少了大腦梗死面積，而低劑量亞甲基藍未能改善大鼠腦梗死面積。在神經行為學評分中，低劑量亞甲基藍治療效果低于高劑量亞甲基藍。提示I/R造模成功誘導大鼠出現與臨床缺血性腦卒中患者相似的神經功能損傷的癥狀，大腦部分區(qū)域發(fā)生水腫梗死，而亞甲基藍給藥能夠緩解這一癥狀且存在劑量依賴性。

圖1 亞甲基藍對腦缺血再灌注的保護作用

2.2 亞甲基藍對I/R大鼠血腦屏障完整性的影響 MCAO能夠損傷血腦屏障結構之間緊密性與完整性，導致血液循環(huán)中有害物質進入腦中造成神經損傷。我們通過皮下注射伊文思藍，檢測腦中伊文思藍含量，確定血腦屏障的完整性。如圖2所示，右腦作為未灌注損傷側大腦，檢測出伊文思藍濃度較低，且各組間沒有顯著性差異，提示完整的血腦屏障能夠減少血液循環(huán)中有害物質侵入。在灌注側大腦中，與假手術組相比，模型組中伊文思藍濃度顯著升高(P<0.05)，提示MACO損傷了大鼠血腦屏障的完整性。而亞甲基藍對血腦屏障有保護作用，與模型組相比，亞甲基藍中高劑量(2 mg/kg,4 mg/kg)治療顯著減少了缺血側大腦中伊文思藍含量(P<0.05)，且亞甲基藍低劑量(1 mg/kg)因未達到有效劑量無法保護血腦屏障完整性。

圖2 亞甲基藍對血腦屏障完整性的保護作用。

2.3 亞甲基藍對I/R大鼠腦中氧化應激水平的影響 與假手術組相比，模型組大鼠腦中SOD活性顯著降低，而MDA含量顯著升高(P<0.05)，提示腦缺血再灌注手術可誘發(fā)氧化應激反應；與模型組比較，亞甲基藍治療大鼠腦中 SOD活性顯著提升，MDA含量顯著降低(P<0.05)，提示亞甲基藍高劑量(4 mg/kg)可一定程度上抑制腦缺血再灌注引起的大鼠氧化應激反應。見圖3。

圖3 亞甲基藍對腦中氧化應激的影響

2.4 亞甲基藍對大鼠腦中炎癥反應的影響 如圖4所示，與假手術組相比，I/R造模導致腦中炎性細胞因子IL-6、IL-1β表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，亞甲基藍高劑量組(4 mg/kg)大鼠腦中炎性細胞因子水平顯著降低(P<0.05)。提示I/R導致大鼠腦中產生嚴重的炎癥反應，亞甲基藍能夠降低腦中炎癥反應的發(fā)生，且存在劑量依賴性，僅亞甲基藍高劑量(4 mg/kg)能夠顯著降低腦中炎癥反應發(fā)生。

圖4 亞甲基藍對腦中炎性相關因子的影響

2.5 亞甲基藍抑制內皮細胞緊密連結蛋白的降解 與假手術組相比，模型組大鼠腦中occludin與claudin-5表達顯著降低(P<0.05)。高劑量亞甲基藍干預治療后，與模型組相比，蛋白表達顯著升高(P<0.05)，見圖5。

圖5 亞甲基藍對occludin與claudin-5蛋白表達的影響

3 討論

血腦屏障是維持腦內微環(huán)境的穩(wěn)定、保證大腦正常功能的特殊屏障，是由微血管內皮細胞、星形細胞端足、周細胞和基板組成的一個緊密結構[12]。腦缺血再灌注會導致其緊密結構損傷，直接導致神經元所處生理環(huán)境改變，伴隨嚴重的炎癥反應與氧化應激，最終會引起突觸和神經元功能紊亂。因此，保護血腦屏障的緊密結構是腦缺血治療的重點[13]。

本研究利用I/R模型造成大鼠行為和認知功能損傷，研究結果顯示，模型組大鼠腦中存在嚴重的梗死現象，伴有行為學和神經功能損傷。亞甲基藍治療能夠顯著減少大鼠腦中梗死面積，改善大鼠的神經功能損傷。在血腦屏障完整性檢測中，相比于空白組與未缺血側大腦，缺血側腦中伊文思藍含量顯著升高，而亞甲基藍給藥組中，缺血側腦中伊文思藍含量顯著降低。這些結果表明，亞甲基藍可能作為一種治療策略，通過保護血腦屏障完整性來減輕缺血性卒中患者的腦損傷。

腦缺血再灌注過程中，活性氧自由基的過量產生，超過了腦組織和血管內皮緊密連接的內源性抗氧化能力，會導致神經元損傷。研究顯示，活性氧自由基能氧化細胞膜和基底膜上的不飽和脂肪酸，引起血管內皮細胞和基底膜損傷，從而破壞血腦屏障完整性[14]。SOD是人體重要的氧自由基清除劑，當氧自由基顯著增加時，其含量和活性顯著降低，而MDA 是主要脂質過氧化物，能使細胞的結構和功能發(fā)生破壞[15]。本研究中，急性缺血再灌注損傷后，亞甲基藍治療顯著提高了SOD活性，并降低了MDA升高。

神經系統(tǒng)中，炎癥介導了多種神經性疾病的發(fā)生和發(fā)展[16]。已有研究揭示，腦缺血再灌注可誘導NLRP3炎癥小體在神經元、小膠質細胞、血管內皮細胞中的活化，激活其下游IL-6、IL-1β等其他炎癥因子的表達，增加炎癥級聯(lián)反應，加重神經元的凋亡與腦水腫的程度，進而破壞血腦屏障完整性并導致腦缺血再灌注損傷進一步加重[17]。本研究中，腦缺血再灌注損傷后，大鼠腦中炎性細胞因子急劇增加，而亞甲基藍治療后，腦中炎癥因子IL-6與IL-1β的表達水平顯著降低。

血腦屏障是由內皮細胞緊密連接形成的代謝和物理屏障，血腦屏障的通透性很大程度上取決于內皮細胞之間的膜輔助蛋白，包括occludin及claudin-5蛋白的相互作用。有報道，頸動脈栓塞會引起內皮細胞中occuldin及claudin-5蛋白表達降低[18]。在本研究中，occludin和claudin-5在亞甲基藍治療組中顯著上調，這意味著亞甲基藍能夠通過上調緊密連接蛋白表達來保護血腦屏障免受缺血和灌注誘導的破壞。

綜上所述，亞甲基藍能夠通過緩解腦中氧化應激反應，減輕神經炎癥反應，發(fā)揮血腦屏障的保護作用，維持完整性，改善腦缺血再灌注損傷后神經功能損傷與大腦局部梗死，其機制可能與上調血腦屏障中緊密連接蛋白occludin與claudin-5表達相關。