白細(xì)胞介素-33對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響

楊笑瑞，李婭，程曉寒，朱琳，司彤彤，徐峰

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，河南 鄭州 450052)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種以黏膜和黏膜下炎癥為特征的特發(fā)性慢性腸病，由于病情惡化和緩解的交替出現(xiàn),其臨床病程不可預(yù)測(cè)[1-2]。一般認(rèn)為，遺傳、微生物和環(huán)境因素相互作用最終導(dǎo)致免疫和非免疫反應(yīng)，持續(xù)激活腸道黏膜，導(dǎo)致炎癥發(fā)生[3-5]。既往研究一致認(rèn)為，巨噬細(xì)胞極分化在UC的發(fā)展中起著重要作用。M1極化表型巨噬細(xì)胞為促炎細(xì)胞，而M2巨噬細(xì)胞為抗炎細(xì)胞，巨噬細(xì)胞的M2型極化被認(rèn)為是緩解各種炎癥反應(yīng)的有效方法之一[6]。白細(xì)胞介素-33(interleukin-33，IL-33)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的IL-1家族分子，是適應(yīng)性和先天免疫的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，ST2是其特異性的受體，IL-33通過(guò)作用于ST2來(lái)誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)[7]。有研究表明，IL-33在小鼠腸炎模型中表達(dá)水平升高，其在UC中的作用可能與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化相關(guān)[8]。本研究進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)IL-33對(duì)巨噬細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物表達(dá)的影響，初步探討其對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響，為今后研究IL-33在UC中的作用機(jī)制及尋求潛在作用靶點(diǎn)提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器C57BL/6J雄性SPF級(jí)小鼠[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0009]，8～10周齡，質(zhì)量21～30 g。IL-33、Anti-CD206、Anti-CD86、Anti-F4/80熒光抗體購(gòu)于上海康朗生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)儀購(gòu)于上海英拜生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1體外誘導(dǎo)M0型巨噬細(xì)胞 將C57BL/6J雄性SPF級(jí)小鼠脫頸處死后置于體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇中浸泡消毒。去皮剔肉后暴露股骨及脛骨，切除關(guān)節(jié)面，暴露骨髓腔，獲取小鼠骨髓來(lái)源單核細(xì)胞。后以巨噬細(xì)胞分化培養(yǎng)基[DMEM+體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)+ 50 μg·L-1巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)+體積分?jǐn)?shù)為1%的雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)]培養(yǎng)7 d。光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，以F4/80抗體鑒定巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成功的比率。

1.2.2分組培養(yǎng) 將上述誘導(dǎo)成功的M0型巨噬細(xì)胞根據(jù)孔序列隨機(jī)分為IL-33組和對(duì)照組。對(duì)照組置于普通培養(yǎng)基[DMEM、體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS、體積分?jǐn)?shù)為1%的雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)]中，IL-33組置于含IL-33培養(yǎng)基[DMEM、體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS、10 μg·L-1的IL-33、體積分?jǐn)?shù)為1%的雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)]中，孵育24 h。

1.2.3檢測(cè)兩組巨噬細(xì)胞M1/M2型表型及相關(guān)基因分子的表達(dá) 每組均以相同來(lái)源的未標(biāo)記單抗作為陰性對(duì)照，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD86(M1型巨噬細(xì)胞表型)、CD206(M2型巨噬細(xì)胞表型)的陽(yáng)性比率；通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和精氨酸酶-1(arginase-1，Arg-1)表達(dá)(TNF-α、Arg-1分別為M1、M2型特征性分子標(biāo)志物)。Arg-1上游引物序列為5’-TGCTCACACTGACATCAACACTCC-3’，下游引物序列為5’-TCTACGTCTCGC AAGCCAATGTAC-3’；TNF- α的上游引物序列為5’-TGCTCACACTGACATCAACACTCC-3’，下游引物序列為5’-TCTACGTCTCGCAAGCCAATGTAC-3’。引物序列從Primerbank查找得到。

2 結(jié)果

2.1 M0型巨噬細(xì)胞分化成功經(jīng)GM-CSF刺激后，細(xì)胞形成巨噬細(xì)胞集落。第4天時(shí)，細(xì)胞不規(guī)則，有集落生成，但不多。至第6天時(shí)，已有明顯的巨噬細(xì)胞集落形成，且細(xì)胞呈圓形或橢圓形，基本無(wú)偽足。與M0型巨噬細(xì)胞形態(tài)比較接近。為進(jìn)一步確認(rèn)，進(jìn)行F4/80(M0型表型)流式鑒定。流式檢測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)4/80陽(yáng)性細(xì)胞率為95.3%，說(shuō)明巨噬細(xì)胞M0型分化成功，見圖1。

2.2 IL-33在體外可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到IL-33組巨噬細(xì)胞的CD206的陽(yáng)性率高于對(duì)照組，且CD86的陽(yáng)性率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。qRT-PCR檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞TNF-α及Arg-1的mRNA表達(dá)量，見圖3。IL-33體外刺激24 h后，TNF-α的表達(dá)較對(duì)照組減少，而Arg-1的表達(dá)較對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 M0型的流式鑒定

圖2 M1/M2表型的流式分析

與對(duì)照組相比，**P<0.05。

3 討論

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞在刺激下產(chǎn)生的具有生物活性的一類多肽或糖蛋白，是炎癥效應(yīng)細(xì)胞之間信息傳遞的中介，通過(guò)結(jié)合相應(yīng)受體來(lái)調(diào)控免疫應(yīng)答。目前的研究顯示細(xì)胞因子在UC的發(fā)病中起著雙重作用，包括促炎與抗炎作用[9]。其中發(fā)揮抗炎作用的細(xì)胞因子主要包括IL-4、IL-10、IL-13等，發(fā)揮促炎作用的細(xì)胞因子主要有IL-1、IL-6、IL-12、干擾素等，其中IL-1在多種細(xì)胞中均有表達(dá)，也是研究最多的一種細(xì)胞因子。巨噬細(xì)胞是協(xié)調(diào)宿主先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵的固有免疫細(xì)胞，作為免疫系統(tǒng)的控制開關(guān)，在細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)下，通過(guò)不同的激活水平和極化狀態(tài)來(lái)維持免疫穩(wěn)態(tài)[10]。巨噬細(xì)胞具有很強(qiáng)的異質(zhì)性和可塑性，在不同的微環(huán)境中可以極化為兩種不同的細(xì)胞亞群，包括經(jīng)典活化型(M1型)和替代活化型(M2型)。其中M1型極化主要由脂多糖或干擾素-γ誘導(dǎo)，其高表達(dá)IL-12，低表達(dá)IL-10和IL-4，在Th1型免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，巨噬細(xì)胞的M1型過(guò)度極化會(huì)導(dǎo)致免疫損傷；M2型極化主要由IL-4或TGF-β等細(xì)胞因子誘導(dǎo)，M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)IL-10，低表達(dá)IL-12，主要參與Th2型免疫反應(yīng)，同時(shí)可抑制Th1型免疫反應(yīng)，在免疫應(yīng)答中具有抑制炎癥反應(yīng)的功能[11]。由此可見，巨噬細(xì)胞在細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)下進(jìn)行M1/M2型極化，其極化的不同會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子的失調(diào)，反之又加劇了巨噬細(xì)胞的極化失衡，循環(huán)往復(fù)，這被認(rèn)為是UC發(fā)病的分子學(xué)基礎(chǔ)之一[12]。

IL-33是2003年在高內(nèi)皮細(xì)胞小靜脈中發(fā)現(xiàn)的新型IL-1家族細(xì)胞因子，通過(guò)與其受體ST2結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，在調(diào)節(jié)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用[13]。IL-33被認(rèn)為是一種同時(shí)具有促炎和抗炎雙重功能的細(xì)胞因子[14]。已有研究證實(shí)IL-33在UC患者及UC小鼠模型中存在異常表達(dá)[15]，但關(guān)于IL-33在UC中的作用究竟是致病性還是保護(hù)性仍未得到充分闡明，其在UC中的具體作用機(jī)制仍在探索之中。因此，本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-33對(duì)巨噬細(xì)胞相關(guān)分子標(biāo)志物表達(dá)的影響，初步探討其在UC炎癥反應(yīng)中的免疫調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IL-33可增加CD206+細(xì)胞比率及Arg-1的表達(dá)，并降低CD86+細(xì)胞比率及TNF-α的表達(dá)，提示IL-33在體外不僅能夠誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化，還能抑制M1型巨噬細(xì)胞活化，這一結(jié)果與Zhu等[16]的研究結(jié)果相吻合。M2型巨噬細(xì)胞主要參與Th2型免疫反應(yīng)，同時(shí)可以抑制Th1型免疫反應(yīng)，在免疫反應(yīng)中可起到抑制炎癥反應(yīng)的作用。由此可見，IL-33可通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向抗炎的M2型方向極化來(lái)下調(diào)促炎因子，抑制炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)上皮細(xì)胞損傷修復(fù)和黏膜愈合。推測(cè)IL-33可能通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2極化來(lái)改善腸道炎癥，以此緩解UC。其有望成為新的治療靶點(diǎn)，針對(duì)巨噬細(xì)胞極化對(duì)UC進(jìn)行疾病干預(yù)，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)IL-33在體外可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2型極化，推測(cè)可能與其緩解UC有一定的相關(guān)性，有望成為一種新的UC預(yù)后生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。有必要進(jìn)行更深入的研究，探討其在UC的不同發(fā)病階段和不同免疫狀態(tài)下的作用以及M2型巨噬細(xì)胞在UC中的具體調(diào)控機(jī)制，為UC的治療提供新的方向。