不同地方種群黃鱔暴露在亞硝酸鈉環(huán)境中對其免疫、抗氧化和肌肉生長能力的影響

陳 強(qiáng),呂巍巍,焦 陽,黃銀盈,袁 泉,黃偉偉,孫小琳,周文宗,趙云龍

(1.華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241； 2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生態(tài)環(huán)境研究所，上海 201403)

黃鱔(Monopterusalbus)屬輻鰭魚綱(Actinopterygii)、合鰓目(Synbranchiformes)、合鰓魚科(Synbranchidae)、黃鱔屬(Monopterus)，在東南亞到東亞各國均有分布.黃鱔肉質(zhì)鮮嫩，味道鮮美，是人們經(jīng)常食用的淡水魚類之一.隨著黃鱔的消費(fèi)市場擴(kuò)大，黃鱔的人工養(yǎng)殖產(chǎn)量不斷增加，但人工養(yǎng)殖的問題也日益顯現(xiàn)，作為種源黃鱔的遺傳多樣性的降低導(dǎo)致后代環(huán)境適應(yīng)能力下降[1]，同時(shí)人工養(yǎng)殖群體也會逃逸到自然環(huán)境中，使野外群體的環(huán)境適應(yīng)性降低[2-3].因此，加強(qiáng)種源建設(shè)，特別是優(yōu)質(zhì)種源的選育或研究十分必要.

亞硝酸鹽是一種廣泛存在于自然界水體中的含氮化合物，由需氧細(xì)菌和硝化過程有關(guān)的氨形成.在水體中，亞硝酸鹽是對水生動物有害的物質(zhì)之一.隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，高密度大規(guī)模集約化養(yǎng)殖模式的興起，由循環(huán)水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中硝化細(xì)菌活性的不平衡導(dǎo)致的水體中殘余的餌料和高含氮排泄物濃度過高會造成養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽濃度過高，有的可以達(dá)到50 mg/L以上[4].而自然水體中，某些水體的亞硝酸鹽濃度也可以達(dá)到0.5 mg/L[5]，在一些跨越農(nóng)業(yè)區(qū)域的夏季地表水體中，亞硝酸鹽濃度高達(dá)1 mg/L以上[6].亞硝酸鹽水平升高是觸發(fā)壓力反應(yīng)的潛在因素，甚至可能對水生生物的生存構(gòu)成重大威脅.

當(dāng)暴露在一定濃度的亞硝酸鹽環(huán)境中，水生動物生理狀態(tài)會出現(xiàn)多方面的變化.有研究表明高濃度的亞硝酸鹽會抑制免疫功能并改變免疫相關(guān)的酶活性[7]，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激是亞硝酸鹽的毒性機(jī)制之一[8].通常情況下生物體有一套完善的調(diào)節(jié)機(jī)制，通過抗氧化酶系統(tǒng)可防止氧化應(yīng)激.在正常的生理狀態(tài)下，活性氧(ROS)被超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等快速消除[9].同時(shí)，氧化應(yīng)激也可能與炎癥反應(yīng)的激活有關(guān).炎癥是免疫反應(yīng)的重要組成部分，主要是由細(xì)胞因子介導(dǎo)的[10].響應(yīng)亞硝酸鹽的促炎細(xì)胞因子水平升高，可能反映了亞硝酸鈉增強(qiáng)細(xì)胞過氧化損傷的能力.在壓力條件下，熱激蛋白(HSP)充當(dāng)分子伴侶來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，防止蛋白質(zhì)聚集并協(xié)助錯誤折疊的蛋白重新折疊.據(jù)報(bào)道，熱休克蛋白的表達(dá)是由環(huán)境壓力誘導(dǎo)的，包括熱應(yīng)激[11]、病原體感染[12]、重金屬暴露[13]和亞硝酸鹽暴露[9].黃鱔作為形態(tài)特異化的淡水魚類，鰓退化后僅靠皮膚、腸等進(jìn)行呼吸作用，高密度養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的亞硝酸鹽對其的影響目前尚不清楚.

本文報(bào)道不同地方種群的黃鱔在暴露于亞硝酸鹽水體中體內(nèi)非特異性免疫能力與抗氧化能力的變化，檢測了肌肉中生肌調(diào)節(jié)因子相關(guān)的基因表達(dá)，以此來評估不同地方種群的黃鱔在應(yīng)對亞硝酸鹽的適應(yīng)能力，為人工選育抗壓性強(qiáng)的黃鱔品系提供基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖

從中國五大湖即鄱陽湖(PYH)、洞庭湖(DTH)、洪澤湖(HZH)、太湖(TH)和巢湖(CH)使用地籠和鱔籠進(jìn)行捕捉，傍晚將其放入湖邊水草茂盛處，第2天早上將捕捉到的黃鱔放入暫養(yǎng)箱，使用充氣泵進(jìn)行持續(xù)供氧，每個群體捕捉到50條后，通過汽車將活體運(yùn)輸?shù)饺A東師范大學(xué)生物站進(jìn)行為期2周的馴養(yǎng).實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，各個群體選擇規(guī)格接近，平均體重約為(15.57±1.56)g的個體，每個群體有4個平行塑料缸，每個塑料缸內(nèi)隨機(jī)放入9條黃鱔，使用黑色塑料袋和小型鱔巢作為遮蔽物.

在自然水體中亞硝酸鹽的濃度往往可達(dá)到1 mg/L左右[14]，因此本文選擇使用1 mg/L 的亞硝酸鹽濃度進(jìn)行21天暴露.養(yǎng)殖用水為除氯曝氣3天以上的自來水，每個塑料缸加入20 L配置好的1 mg/L的亞硝酸鈉溶液.每天傍晚6點(diǎn)飽食投喂，食物為蚯蚓與商業(yè)飼料的混合物，于第2天早上8點(diǎn)清除殘餌和死亡個體，并重新補(bǔ)足配置好的1 mg/L亞硝酸鈉溶液.在21天的養(yǎng)殖期間持續(xù)充氧，溶解氧濃度大于6.5 mg/L，水溫維持在(27±1)℃，pH 7.0±0.3.

1.2 樣品采集

每7天取樣一次，每組隨機(jī)取3條黃鱔.取樣前饑餓處理24 h，用MS-222麻醉.使用2.5 mL一次性塑料針頭抽取1 mL血淋巴，加入1 mL抗凝劑，4 ℃低溫高速離心機(jī)3 800 r/min轉(zhuǎn)下離心15 min，分離血漿與血細(xì)胞，放入-80 ℃超低溫冰箱儲存待測.將黃鱔置于冰浴中，用無菌鑷子和剪刀完整剪出肝和肌肉，將組織置于離心管中，液氮中速凍后保存于-80 ℃冰箱.

1.3 生化分析

測定肝組織中過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、脂質(zhì)過氧化物(LPO)、丙二醛(MDA)等氧化還原酶和氧化應(yīng)激指標(biāo)，采用蘇州科銘相關(guān)試劑盒進(jìn)行測定.樣品可溶性蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)法(蘇州科銘)進(jìn)行測定.

1.4 基因表達(dá)

使用高通量組織研磨儀將第21天的肝和肌肉組織磨碎成懸液，使用TRIzol試劑提取總RNA，用凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量，并用NanoDrop分光光度計(jì)測量總RNA濃度和OD260/OD280比值，比值在1.8～2.0最佳.使用帶有去基因組成分的NovoScript 1stStrand cDNA Synthesis試劑盒(Novoprotein)合成cDNA.使用NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus試劑盒進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，定量PCR檢測平臺為BIO-RAD CFX96TM實(shí)時(shí)系統(tǒng).基因特異性引物如表1所示，使用RPL17作為內(nèi)參基因.

表1 qPCR過程中使用的引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，使用單因素方差分析(ANOVA)，進(jìn)行Duncan’s檢驗(yàn)評估顯著關(guān)系,差異顯著表示為P<0.05.整個實(shí)驗(yàn)以年產(chǎn)量最高的江西省鄱陽湖(PYH)群體為對照組.

2 結(jié) 果

2.1 亞硝酸鹽對黃鱔抗氧化系統(tǒng)的影響

2.1.1 對肝臟組織抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)的影響

肝臟中抗氧化酶酶活和抗氧化物質(zhì)含量如圖1所示.在暴露7 d后，PYH群體的SOD活性顯著高于其他群體(P<0.05)，而在暴露21 d后，各群體間無顯著差異(P>0.05).各群體的CAT活性除暴露14 d后的HZH群體外，其余群體在整個暴露實(shí)驗(yàn)中都無顯著差異(P>0.05).PYH、CH和TH群體的GSH含量表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢.PYH、CH群體的GSSG含量表現(xiàn)出隨時(shí)間的增加而持續(xù)下降，TH和DTH群體表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，HZH群體表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢.

圖1 在暴露21天過程中各野生黃鱔群體肝臟中抗氧化酶活性及抗氧化物質(zhì)含量Fig.1 Antioxidant enzyme activity and antioxidant substance content in the liver of each wild rice eel population during 21 days of exposure

2.1.2 對肝臟組織氧化應(yīng)激標(biāo)志含量的影響

組織氧化應(yīng)激標(biāo)志LPO和MDA水平變化如圖2所示.PYH群體的LPO呈時(shí)間依賴性下降，CH、TH、DTH群體呈先下降后上升的趨勢，在暴露21 d后，PYH群體的LPO含量顯著低于其他群體(P<0.05).PYH群體的MDA含量也呈時(shí)間依賴性下降，在暴露7 d和14 d時(shí)，除PYH群體外，其他群體間無顯著差異(P>0.05)，在暴露21 d后，各群體間無顯著差異(P>0.05).

圖2 在暴露21天過程中各野生黃鱔群體肝臟中氧化應(yīng)激標(biāo)志的含量Fig.2 The content of oxidative stress markers in the liver of each wild rice eel population during 21 days after exposure

2.2 亞硝酸鹽對黃鱔肝臟組織免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

在暴露21 d后，特異性免疫能力相關(guān)基因MHC-2A和非特異性免疫能力抗菌肽相關(guān)基因Hepcidin在肝組織中表達(dá)結(jié)果如圖3所示.與PYH相比，其他群體MHC-2A表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，而且除TH與HZH之間無顯著差異外(P>0.05)，各群體間存在顯著差異(P<0.05).Hepcidin的表達(dá)中，僅TH群體顯著高于PYH群體(P<0.05)，其余群體均顯著低于PYH群體(P<0.05).綜合來看，PYH群體和DTH群體的非特異性免疫能力在暴露于亞硝酸鹽后仍維持較高水平.

圖3 暴露21天后各野生黃鱔群體肝臟中免疫相關(guān)基因表達(dá)Fig.3 Expression of immune-related genes in the liver of each wild rice eel population after 21 days exposure

2.3 亞硝酸鹽對黃鱔肝臟組織炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響

在暴露21 d后，肝臟組織中炎癥相關(guān)的基因表達(dá)結(jié)果如圖4所示.與PYH群體相比，DTH群體的COX-1、5-PO和HSP的表達(dá)都顯著上升(P<0.05)，而DTH群體的COX-2表達(dá)與PYH群體無顯著差異(P>0.05).CH除COX-2顯著下降外(P<0.05)，其余基因表達(dá)與PYH群體無顯著差異(P>0.05).TH的COX-2和5-PO的表達(dá)均顯著高于PYH(P<0.05)，HSP與COX-1則顯著低于PYH(P<0.05).HZH與PYH相比，COX-1無顯著差異(P>0.05)，其余基因表達(dá)則顯著下降(P<0.05).

圖4 暴露21天后各野生黃鱔群體肝臟中炎癥相關(guān)基因的表達(dá)Fig.4 Expression of inflammation-related genes in the liver of each wild rice eel population after 21 days exposure

2.4 亞硝酸鹽對黃鱔肌肉生肌調(diào)節(jié)因子相關(guān)基因表達(dá)的影響

各群體肌肉中的生肌調(diào)節(jié)因子相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果如圖5所示.MYF5與MYOD1具有相似的變化趨勢，即CH、TH和HZH群體顯著高于PYH群體(P<0.05)，DTH群體與PYH群體在MYF5的表達(dá)上無顯著差異(P>0.05)，但在MYOD1表達(dá)時(shí)DTH群體顯著高于PYH群體(P<0.05).MRF4和MYOG的變化趨勢也較為一致，CH、TH、DTH和HZH群體都顯著高于PYH群體(P<0.05)，而各群體間的表達(dá)也存在差異(P<0.05).

圖5 暴露21天后各野生黃鱔群體肌肉中生肌調(diào)節(jié)因子相關(guān)的基因表達(dá)Fig.5 Gene expression of myogenic regulatory factors in the muscles of wild rice field eel populations after 21 days exposure

3 討 論

3.1 不同地方種群黃鱔免疫能力的比較

環(huán)境因子使魚類的免疫能力發(fā)生變化已經(jīng)被證明[17]，而亞硝酸鹽水平升高是觸發(fā)脅迫反應(yīng)的潛在因素，可能對水生生物的生存構(gòu)成重大威脅.Hepcidin是一種在肝臟合成的抗菌多肽[18]，在水生動物非特異性免疫中起重要作用，能夠直接抑制病原微生物.主要組織相容性復(fù)合體MHC-2A屬于體液免疫中的重要分子，在魚類激活機(jī)體免疫應(yīng)答中具有重要作用[19].本文的結(jié)果表明在亞硝酸鹽暴露后，非特異性免疫相關(guān)基因Hepcidin和體液免疫相關(guān)基因MHC-2A在變化上基本一致，而PYH群體和DTH群體的免疫能力相對更高，在逆環(huán)境中能夠更好地抵抗病原微生物的侵襲.亞硝酸鹽濃度的變化會導(dǎo)致水生動物的免疫功能發(fā)生變化，這表明水生動物具有一定的低濃度亞硝酸鹽適應(yīng)能力，但高濃度會導(dǎo)致免疫損傷[20].本文結(jié)果證明不同地理群體的黃鱔在免疫能力上具有差異性，與在中華鱉、紅鯉和團(tuán)頭魴中的研究發(fā)現(xiàn)一致[21-23].

在眾多炎癥介質(zhì)中，COX和5-LO被認(rèn)為是參與炎癥反應(yīng)的重要分子，而HSP在氧化應(yīng)激和炎癥中被誘導(dǎo)產(chǎn)生并維護(hù)細(xì)胞的正常功能.本文的結(jié)果中COX與5-PO表達(dá)的升高表明機(jī)體可能面臨較為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，而HSP在各群體中則與前兩者變化較為一致，因?yàn)镠SP是一個對亞硝酸鹽脅迫敏感的基因，會參與應(yīng)對炎癥反應(yīng)并調(diào)節(jié)適應(yīng)性反應(yīng)[24].這在相關(guān)的文獻(xiàn)中已證實(shí)，亞硝酸鹽暴露后破壞魚的抗氧化系統(tǒng)會誘導(dǎo)HSP表達(dá)，同時(shí)缺氧應(yīng)激會上調(diào)動物組織中的HSP水平[25].所以HSP的表達(dá)是炎癥與亞硝酸鹽共同導(dǎo)致的結(jié)果.綜合來看，TH和DTH群體可能面臨更為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，而PYH、CH和HZH群體則面臨較輕微的炎癥反應(yīng).

3.2 不同地方種群黃鱔抗氧化能力的比較

由于長期暴露于環(huán)境污染物，水生生物通常會遭受持續(xù)的氧化應(yīng)激.SOD是一種特異性清除超氧化物自由基并生成H2O2的胞質(zhì)酶.在本研究中，應(yīng)對1 mg/L的亞硝酸鈉的暴露時(shí)，黃鱔體內(nèi)的氧化應(yīng)激體系能夠正常工作，但隨著暴露時(shí)間的延長，SOD酶的活性下降，表明H2O2形成可能減少，也可能是SOD酶活性被環(huán)境中的亞硝酸鹽抑制[26].CAT是主要的抗氧化系統(tǒng)成分，主要起到催化H2O2分解為H2O，能緩解源自SOD活性的H2O2中毒.肝臟中的CAT活性與SOD活性變化一致，是因?yàn)橄啾扔赟OD在氧化應(yīng)激前期開始起作用，CAT具有滯后性，主要在在亞硝酸鹽脅迫的后期發(fā)揮作用[9].GSH與GSSG是細(xì)胞內(nèi)最重要的氧化還原對之一，對于清除細(xì)胞中的自由基具有重要作用.魚類體內(nèi)主要由谷胱甘肽還原酶調(diào)控GSSG轉(zhuǎn)變?yōu)镚SH，但在亞硝酸鹽脅迫下，谷胱甘肽還原酶表達(dá)和活性會顯著升高以響應(yīng)氧化應(yīng)激[27].在正常情況下，GSH濃度高于GSSG，但當(dāng)遭遇過量氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，GSSG濃度會高于GSH[27].本文的結(jié)果也表明肝臟GSSG濃度都高于GSH濃度，進(jìn)一步證明了各群體黃鱔處于氧化應(yīng)激狀態(tài).

LPO是氧化應(yīng)激條件下導(dǎo)致細(xì)胞功能喪失的主要因子，可能導(dǎo)致脂質(zhì)膜完整性的喪失和有毒醛的產(chǎn)生.丙二醛(MDA)是過氧化脂質(zhì)的分解產(chǎn)物之一，被廣泛用作脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物，其升高的水平可以反映肝臟對脂質(zhì)過氧化損傷的程度,這兩種物質(zhì)可以清楚地反映組織受氧化應(yīng)激損害的程度.亞硝酸鹽會誘導(dǎo)體內(nèi)的ROS過量產(chǎn)生[8]，從而破壞抗氧化系統(tǒng)的正常功能，結(jié)果表明LPO與MDA含量在暴露7 d和14 d時(shí)，各群體具有一致性的變化趨勢，表明抗氧化系統(tǒng)在黃鱔體內(nèi)的維持，但在21 d時(shí)逐漸下降，表明亞硝酸鹽誘導(dǎo)ROS過量產(chǎn)生后，抗氧化系統(tǒng)已經(jīng)逐漸修復(fù)體內(nèi)的氧化損傷，這也提示黃鱔可以較好地適應(yīng)1 mg/L的亞硝酸鹽壓力.綜合抗氧化系統(tǒng)表現(xiàn)與脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)物含量評估，可以發(fā)現(xiàn)在早期暴露中PYH群體和CH群體在抗氧化能力上較強(qiáng).

3.3 不同地方種群黃鱔肌肉分化生長能力的比較

黃鱔生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)家族包括MYF5、MYOD1、MYOD2、MYOG和MRF4，在肌肉細(xì)胞的增殖和分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用.魚類生肌調(diào)節(jié)因子可以分為兩大類，第一大類(MYF5和MYOD)為生肌決定因子，促使肌肉前體細(xì)胞分化成肌細(xì)胞；第二大類(MYOG和MRF4)為生肌調(diào)節(jié)因子，主要促進(jìn)成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)向終末骨骼肌肌纖維[28].在黃鱔體重14～27 g的階段，MYF5和MYOD1高表達(dá)，而MRF4和MYOG較為穩(wěn)定地低表達(dá)[29].這與本文選用(15.57±1.56) g的幼鱔結(jié)果較為一致，表明在幼魚成長為成魚的過程中，以肌纖維的增粗為主，主要是由MYOD和MYF5調(diào)控[30].值得注意地是，亞硝酸鹽會增加肌肉前體細(xì)胞的增殖和代謝活性[31]，但尚不清楚是否會對黃鱔產(chǎn)生同樣的效果.而在不同的群體當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)PYH群體的肌肉生長調(diào)控相比其他群體顯著不足，而CH群體在面臨環(huán)境壓力時(shí)具有更好的肌肉生長分化能力.

本文利用同一濃度的亞硝酸鈉暴露不同地方群體的黃鱔，通過檢測肝臟免疫能力和炎癥因子的基因表達(dá)水平，肝臟抗氧化系統(tǒng)中的相關(guān)指標(biāo)和肌肉調(diào)節(jié)因子的水平，發(fā)現(xiàn)不同地方種群的黃鱔在面對亞硝酸鹽暴露時(shí)，PYH群體和DTH群體的免疫能力相對較高，在逆環(huán)境中能夠更好的抵抗病原微生物的侵襲；PYH、CH和HZH群體則具有較低的炎癥反應(yīng)；在早期暴露中PYH群體和CH群體在抗氧化能力上較強(qiáng)；CH群體相對在面臨環(huán)境壓力時(shí)具有更好的肌肉生長分化能力.本文證明了不同地理群體的黃鱔在面對同一環(huán)境時(shí)生理功能存在差異，可為黃鱔的人工選育提供基礎(chǔ)資料.