姜黃素減緩老年小鼠的骨丟失

陳玉鳳,李 晶,張 東,曹 勇,趙祥龍,謝亦璘,陸繼紅,任一萍,喬之光,喬中東

(1.上海交通大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,上海 200240; 2.如新(中國(guó))日用品保健品有限公司 抗衰老科研中心,上海 201401; 3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院南院 骨科,上海 201112)

骨質(zhì)疏松癥是一種骨量丟失、骨骼強(qiáng)度下降,骨組織微結(jié)構(gòu)遭到破壞導(dǎo)致骨脆性增加從而引發(fā)骨折風(fēng)險(xiǎn)性提升的全身性骨骼系統(tǒng)疾病[1].骨質(zhì)疏松癥多見于絕經(jīng)后的婦女與老年男性，且在不同種族和族裔群體間存在差異性[2].隨著我國(guó)人口結(jié)構(gòu)的老齡化,可以預(yù)見骨質(zhì)疏松癥及骨折的患病率將顯著增加,會(huì)帶來巨大的健康威脅和經(jīng)濟(jì)損失[3].

姜黃素(Curcumin, CMN)是從姜黃屬植物根莖中提取的一種天然親脂小分子[4].姜黃素具有多種藥理作用: 抗腫瘤、抗炎、抗HIV、抗菌、抗氧化等[5],具有良好的臨床應(yīng)用潛力;文獻(xiàn)表明姜黃素可以防止卵巢切除引起的骨質(zhì)流失[6],并通過增加破骨細(xì)胞自噬來抑制破骨細(xì)胞的形成[7];Cheng等發(fā)現(xiàn)較高劑量的姜黃素可以治療糖基化引起的骨質(zhì)疏松癥[8].Riva等證實(shí)了給低骨量人服用含有姜黃素的口服劑可以增強(qiáng)小指和上頜骨的骨密度[9],有助于預(yù)防和減緩骨質(zhì)丟失.上述實(shí)驗(yàn)為姜黃素治療老齡化引起的骨質(zhì)疏松提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù).綜上所述,CMN是一種能夠能促進(jìn)骨骼形成,又能減少骨骼吸收的天然化合物[10].

雌激素缺乏是骨質(zhì)疏松發(fā)生的主要成因[11],現(xiàn)有研究表明細(xì)胞衰老是骨質(zhì)疏松的成因之一[12-13].小鼠所發(fā)生的與年齡相關(guān)的骨丟失,呈現(xiàn)出與人類極為相似的特征.文獻(xiàn)表明,小鼠3～6月齡相當(dāng)于人類青壯年(20～30歲),小鼠10～14月齡相當(dāng)于人類中年(38～47歲),小鼠18～24月齡相當(dāng)于人類老年(56～69歲)[14].此前,骨質(zhì)疏松相關(guān)研究大部分采用大鼠卵巢切除(Ovariectomy, OVX)模型,但OVX模型大鼠會(huì)存在突然和過早的卵巢激素的丟失,在細(xì)胞、組織、器官和系統(tǒng)水平上也改變了一些基本的衰老過程[15-17].基于有關(guān)CMN對(duì)雄性老年小鼠骨質(zhì)疏松影響的研究尚未見報(bào)道,因此,本研究采用老年雄性小鼠作為研究對(duì)象,觀察CMN是否在老年雄性小鼠中具有抗骨質(zhì)疏松的作用.

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物處理

從上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心處獲取6月齡C57BL/6(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,2015000531078)小鼠8只,18月齡小鼠16只.關(guān)于小鼠的任何實(shí)驗(yàn)均遵循上海交通大學(xué)倫理委員會(huì)頒布的相關(guān)規(guī)定.每只小鼠都在籠中飼養(yǎng),飲水和飲食不受限制,溫度濕度等生活條件都保持在一致的水平.小鼠在動(dòng)物房適應(yīng)1周后,開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn).年輕小鼠在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)處死取材.18月齡小鼠隨機(jī)挑選8只,在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)處死作為服用CMN等藥物前的對(duì)照;剩余8只18月齡小鼠作為實(shí)驗(yàn)組.用蒸餾水將阿拉伯膠配成質(zhì)量濃度5%水溶液作為溶劑,藥物的濃度是根據(jù)小鼠體重決定的.CMN用量是33.3 mg/kg.

對(duì)照組每天用含有5%的阿拉伯膠蒸餾水灌胃,3個(gè)月后處死取材;實(shí)驗(yàn)組根據(jù)小鼠體重每天用相同溶劑配置的CMN灌胃,3個(gè)月后處死取材.實(shí)驗(yàn)開始前及實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中每周測(cè)量?jī)纱涡∈篌w重.

1.2 小鼠脛骨微觀結(jié)構(gòu)測(cè)量

實(shí)驗(yàn)選用小鼠左右脛骨,利用顯微CT(SCANCO Medical AG,瑞士),設(shè)定其掃描分辨率為10 μm,電壓為70 kV,電流為200 μA,3維重建圖像為906×906像素矩陣.采集并分析以下微觀結(jié)構(gòu)參數(shù): 骨小梁數(shù)目(NTb)、骨體積分?jǐn)?shù)(VB/VT)、骨小梁厚度(dTb)、骨小梁間隙(dTb-Sp)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(ISM)等.

1.3 小鼠脛骨骨組織學(xué)觀察

將小鼠左右脛骨在質(zhì)量濃度4%的多聚甲醛/磷酸鹽緩沖鹽水(PFA/PBS)中固定24 h,用商品化EDTA脫鈣液對(duì)標(biāo)本進(jìn)行脫鈣處理,酒精梯度脫水,浸蠟-包埋-切片后,二甲苯脫蠟進(jìn)行蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin,HE)染色,在顯微鏡(Olympus BX51,瑞士)下觀察并采集圖像(20倍鏡與100倍鏡),每張切片選取3個(gè)視野觀察骨組織骨小梁結(jié)構(gòu)形態(tài),測(cè)量骨小梁面積百分?jǐn)?shù).

1.4 小鼠脛骨微觀成分的測(cè)量

將取得的脛骨用梯度酒精脫水,浸蠟包埋后,切得5 μm厚的薄片置于直徑為2.5 cm氟化鋇窗片上.使用二甲苯和無水乙醇脫蠟.利用傅里葉顯微成像紅外光譜儀(NicoletiN10 MX)測(cè)量脛骨微觀成分.掃描方式選擇面掃,光譜分辨率設(shè)定為8 cm-1,測(cè)量面積設(shè)置根據(jù)樣品大小框選范圍,步長(zhǎng)設(shè)置為30 μm.扣除氟化鋇作為背景對(duì)光譜的影響,每個(gè)標(biāo)本采集16個(gè)紅外光譜.使用NicoletiN10 MX自帶的OMNIC8.0軟件處理光譜,得到以下參數(shù): (1) 骨礦鹽和基質(zhì)比(mineral to matrix ratio),磷酸鹽峰(1 180～920 cm-1)下面積與氨基化合物 Ⅰ (1 720～1 585 cm-1)峰面積比值;(2) 結(jié)晶度(crystallinity),1 030 cm-1和1 020 cm-1處子峰高比值;(3) 膠原交聯(lián)比(collagen cross-link ratio),氨基化合物 Ⅰ 下1 660 cm-1和1 690 cm-1子峰高比值；(4) 碳酸鹽取代程度(degree of carbonate substitution),碳酸鹽條帶855～890 cm-1和磷酸鹽條帶920～1 180 cm-1峰面積比值[18-19].

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

本研究所有數(shù)據(jù)使用Prism6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.本實(shí)驗(yàn)所有研究均進(jìn)行至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù),數(shù)值結(jié)果均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SEM)形式表示,組間兩兩相比較采用LSD-t檢驗(yàn),比較相關(guān)參數(shù)的差異是否顯著.*(P<0.05)表示差異顯著,**(P<0.01)表示差異極顯著.

2 結(jié) 果

2.1 小鼠脛骨MicroCT顯示CMN能夠減緩老年小鼠松質(zhì)骨骨量丟失

由圖1中可以看出,與6月齡的雄性小鼠相比,18月齡老年雄性小鼠脛骨骨量顯著性下降,脛骨的松質(zhì)骨海綿狀結(jié)構(gòu)也愈發(fā)疏松,無藥物處理21月齡老年小鼠松質(zhì)骨骨量也明顯低于18月齡老年小鼠.圖2顯示: 18月齡老年小鼠的骨體積分?jǐn)?shù)(VB/VT)、骨小梁數(shù)目(NTb)和骨小梁厚度(dTb)3個(gè)參數(shù)明顯低于6月齡年輕小鼠的.隨著年齡的繼續(xù)增長(zhǎng),21月齡老年小鼠相較于18月齡老年小鼠，其骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)目顯著下降,但是骨小梁厚度變化不大.

圖1 小鼠脛骨MicroCT掃描結(jié)果Fig.1 The result of MicroCT scanning of tibia in mice

由圖2可知,18月齡老年小鼠的骨小梁間隔(dTb-Sp)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(ISM)明顯大于6月齡年輕小鼠的,更加接近3,其結(jié)果存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.這說明18月齡老年小鼠發(fā)生了明顯的骨質(zhì)疏松,本研究選取的老年小鼠的骨質(zhì)疏松模型是可行的.無藥物處理的21月齡老年小鼠與18月齡老年小鼠的骨小梁間隙也存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但是它們的結(jié)構(gòu)模型指數(shù)相差不大.CMN處理后,老年雄性小鼠骨量尤其是松質(zhì)骨骨量有明顯的提升,脛骨松質(zhì)骨海綿狀結(jié)構(gòu)疏松狀況有所改善.老年小鼠的骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)目和骨小梁厚度有明顯的提升(P<0.05)，其骨小梁間隙與結(jié)構(gòu)模型指數(shù)則有所降低,但后者不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

圖2 脛骨脛骨顯微結(jié)構(gòu)參數(shù)Fig.2 Microstructural parameters of tibia in mice

2.2 小鼠脛骨組織學(xué)顯示CMN能夠有效阻止老年小鼠脛骨骨小梁數(shù)目減少

由圖3可知: 6月齡雄性小鼠骨小梁排列整齊而緊密,連續(xù)性較好,寬度均勻,且骨小梁間隙較小,骨小梁數(shù)目較多;而18月齡老年小鼠組骨量明顯下降,骨小梁變細(xì)、數(shù)目減少且骨小梁之間連續(xù)性較差、游離斷端增多、骨小梁間隙增大;到了21月齡,小鼠骨小梁數(shù)目進(jìn)一步降低,間隙進(jìn)一步加大.6月齡小鼠相對(duì)于髓腔的骨小梁面積百分?jǐn)?shù)為50.42%±0.41%,顯著高于18月齡老年小鼠(39.23%±2.07%,N=3)(P=0.002 8<0.01),21月齡小鼠骨小梁面積百分?jǐn)?shù)(28.67%±1.19%)也明顯低于18月齡小鼠(P=0.011 4<0.05).這個(gè)可以進(jìn)一步說明年輕小鼠的骨量?jī)?yōu)于老年小鼠,而老年小鼠隨著年齡增長(zhǎng)骨量會(huì)進(jìn)一步丟失.這一結(jié)果與MicroCT結(jié)果一致,進(jìn)一步從組織學(xué)角度闡述了老年小鼠伴隨著年齡增大會(huì)存在相關(guān)性的骨丟失.

圖3 小鼠脛骨組織學(xué)結(jié)果Fig.3 Histological results of tibia in mice

CMN灌胃老年小鼠3個(gè)月后,與對(duì)照組相比,骨小梁面積百分?jǐn)?shù)由28.67%±1.19%增加到32.90%±0.90%(P=0.046 8<0.05),且間隙有所減小,斷裂和散亂程度有所降低.

2.3 CMN可以通過改變老年小鼠脛骨微觀成分增強(qiáng)骨強(qiáng)度

傅里葉顯微紅外結(jié)果顯示,18月齡老年小鼠礦物質(zhì)基質(zhì)的比值(P=0.004 3)與碳酸鹽取代程度較6月齡小鼠顯著降低(P=0.018 4),而膠原交聯(lián)比(P=0.001 1)和結(jié)晶度顯著增加(P=0.009 2).21月齡老年小鼠與18月齡老年小鼠相比,也存在著同樣的趨勢(shì)(圖4).這從微觀成分角度揭示了骨質(zhì)疏松發(fā)生時(shí),骨組織微觀成分的改變,解釋了骨強(qiáng)度下降骨脆性增加的部分成因.由圖4中可以發(fā)現(xiàn),與未處理的21月齡老年小鼠相比,實(shí)驗(yàn)組老年小鼠礦物質(zhì)基質(zhì)比和碳酸鹽取代程度有所增加,膠原交聯(lián)比和結(jié)晶度略有下降,統(tǒng)計(jì)結(jié)果均存在顯著性差異.進(jìn)一步說明CMN可以從微觀成分的改變來逆轉(zhuǎn)老年相關(guān)性的骨丟失.

圖4 小鼠脛骨骨組織微觀成分結(jié)果Fig.4 The results of microelements of tibial bone tissue in mice

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)雄性老年小鼠骨量比年輕小鼠明顯降低,表現(xiàn)出明顯的骨質(zhì)疏松癥狀,且隨著年齡進(jìn)一步的增加,雄性老年小鼠會(huì)繼續(xù)發(fā)生骨丟失.在本研究中通過CMN干預(yù)后,雄性老年小鼠脛骨骨質(zhì)疏松癥狀得到明顯改善.

顯微CT可以很好地觀察骨的微觀結(jié)構(gòu),且有較好的準(zhǔn)確性與重建性[20].HE組織學(xué)染色,能夠在組織學(xué)角度上對(duì)顯微CT的結(jié)果進(jìn)行佐證.傳統(tǒng)紅外光譜學(xué)可以研究骨組織礦化過程中羥基磷灰石的信息,譬如碳酸鹽的存在,但它局限于均勻骨質(zhì).顯微紅外可以較好地研究不均勻骨質(zhì),且其空間分辨率較高,可以較好地了解礦物和基質(zhì)成分的空間變化,進(jìn)而解釋骨組織機(jī)械性能的變化.因而顯微紅外適用于骨這種不均勻、異質(zhì)性的組織,并判定它的空間含量結(jié)構(gòu)與成分的差異[19].

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)姜黃素可以緩解OVX模型引起的骨質(zhì)疏松,其機(jī)制與它的3個(gè)功能(對(duì)細(xì)胞膜功能和結(jié)構(gòu)的改變、抗炎作用、抗氧化作用)相關(guān).姜黃素作為一種親脂小分子,可以迅速滲透到細(xì)胞膜,從而破壞細(xì)胞膜的完整性,也會(huì)影響到細(xì)胞膜上附著的受體蛋白等.例如,姜黃素通過改變磷脂酰亞胺的通路調(diào)節(jié)蛋白激酶C的活性[21].它也會(huì)影響NF-κB,而NF-κB在參與炎癥疾病和炎癥反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起著重要作用[22].另外姜黃素會(huì)下調(diào)環(huán)氧合酶2的表達(dá),抑制促炎酶5-LOX的表達(dá)[23-24].姜黃素可以增加磷酸化蛋白激酶B和糖原磷酸化合成酶kinase-3β(GSK3β)的表達(dá)水平,即它能激活A(yù)kt-GSK3β信號(hào).也有文獻(xiàn)報(bào)道,姜黃素通過抑制MMP-9激活的microRNA-365改善糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松小鼠的骨微結(jié)構(gòu)[25].

我們的研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制與雄性激素低下相關(guān),與年齡相關(guān)的睪酮缺乏是老年男性骨質(zhì)流失的最重要因素.雄激素可以通過直接與雄激素受體結(jié)合或通過雌激素芳構(gòu)化間接與雌激素受體結(jié)合來影響骨骼健康[26-27].而姜黃素緩解雄性老年小鼠骨質(zhì)疏松可能與之相關(guān).

綜上所述,CMN能夠通過增加雄性老年小鼠脛骨組織,增加骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)目、增大骨小梁面積百分比,并減小骨小梁間距.目前沒有關(guān)于CMN對(duì)老年雄性小鼠骨組織作用的研究,本研究所得是對(duì)其藥效作用研究的有益補(bǔ)充.