過氧化氫誘導(dǎo)的草魚原代肝細(xì)胞氧化損傷模型的構(gòu)建及其對(duì)天然植物抗氧化能力的評(píng)價(jià)

石瑤瑤 葉元土* 蔣 蓉 蔡春芳 吳 萍

(1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇省水產(chǎn)動(dòng)物與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘇州 2215123；2.無錫三智生物科技有限公司，無錫 2214135)

水產(chǎn)動(dòng)物受到體內(nèi)與體外環(huán)境的影響會(huì)產(chǎn)生過量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，包括自由基形式(超氧陰離子自由基、羥基自由基)和非自由基形式[過氧化氫(H2O2)、次溴酸等][1]。由ROS引起的氧化應(yīng)激和氧化損傷是危害水產(chǎn)動(dòng)物生理健康的主要因素，針對(duì)ROS的研究主要包括不同種類ROS對(duì)細(xì)胞、器官組織和機(jī)體的損傷作用及其作用路徑，以及如何提高水產(chǎn)動(dòng)物抗氧化應(yīng)激能力，例如，篩選適用于水產(chǎn)動(dòng)物抗氧化應(yīng)激、抗氧化損傷作用物質(zhì)的研究，這也是現(xiàn)代養(yǎng)殖學(xué)和營養(yǎng)學(xué)研究的重要領(lǐng)域之一。

利用離體細(xì)胞氧化損傷模型研究ROS的作用機(jī)制，并利用細(xì)胞氧化損傷模型篩選抗氧化損傷物質(zhì)是較為有效的技術(shù)方法，其中H2O2損傷細(xì)胞模型是常用的細(xì)胞氧化損傷模型[2]。H2O2是一種常見的活性氧，極易透過細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的氧化損傷或誘發(fā)細(xì)胞凋亡。因此H2O2是被用作細(xì)胞體外建立氧化損傷模型的常用試劑[3]。在細(xì)胞氧化損傷模型應(yīng)用方面，一個(gè)重要的應(yīng)用方向就是將對(duì)照組、模型組和“造模劑+受試物”試驗(yàn)組在相同條件下進(jìn)行試驗(yàn)，篩選和評(píng)價(jià)“受試物”抗氧化應(yīng)激的能力、對(duì)氧化損傷的修復(fù)能力，最終篩選出有效的受試物應(yīng)用于細(xì)胞、動(dòng)物的抗氧化應(yīng)激和氧化損傷修復(fù)。

一些植物多酚含量高的天然植物是抗氧化應(yīng)激、氧化損傷修復(fù)受試物的主要來源，依賴其中含有的植物多酚(如多酚酸和多酚黃酮類物質(zhì))實(shí)現(xiàn)對(duì)ROS的清除，并對(duì)受到氧化損傷的細(xì)胞或器官組織進(jìn)行修復(fù)[4]。

本試驗(yàn)以H2O2為造模劑，以草魚的原代肝細(xì)胞為試驗(yàn)對(duì)象，依據(jù)細(xì)胞存活率與細(xì)胞形態(tài)變化、培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)活性、細(xì)胞中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、細(xì)胞凋亡率等指標(biāo)，探索最佳的H2O2濃度及干預(yù)時(shí)間，旨在建立一種可靠性好、重復(fù)性高的H2O2誘導(dǎo)的草魚原代肝細(xì)胞氧化損傷模型，并利用構(gòu)建的草魚原代肝細(xì)胞氧化損傷模型對(duì)8種天然植物的抗氧化能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，篩選具有較強(qiáng)抗氧化活性的天然植物。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)草魚

試驗(yàn)用草魚為1冬齡草魚幼魚，體重為20～30 g/尾，飼養(yǎng)于蘇州大學(xué)室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)中。使用自制的含28%蛋白質(zhì)、4%油脂的飼料喂養(yǎng)，每天按時(shí)投喂1次。

1.2 肝細(xì)胞氧化損傷模型的構(gòu)建

1.2.1 H2O2的配制和使用

無菌條件下，吸取20 μL 30%的H2O2(中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)與1 880 μL的無菌三蒸水均勻混合，將H2O2稀釋100倍。分別吸取1、2、4和6 μL的H2O2溶液到1 mL的培養(yǎng)基中，混合均勻，制成終濃度為100、200、400和600 μmol/L的H2O2造模劑。

1.2.2 肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

草魚原代肝細(xì)胞的分離參照秦潔等[5]的試驗(yàn)方法并稍作調(diào)整。草魚用0.01%高錳酸鉀溶液浸泡15 min，常規(guī)解剖取出肝臟，磷酸鹽緩沖液(PBS，0.01 mol/L、pH 7.4)清洗3遍去除多余組織塊后，剪成1 mm3大小的顆粒，按照體積1∶3的比例加入0.25%的胰蛋白酶，27 ℃控溫?fù)u床消化15 min，終止消化后1 000 r/min離心1 min，棄掉上清液。按1∶3的比例加入PBS和紅細(xì)胞裂解液，1 000 r/min離心4 min棄掉上清液。PBS清洗細(xì)胞2次，800 r/min離心1 min棄掉上清液，加入含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，于5% CO2、27 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換完全培養(yǎng)液。

1.2.3 細(xì)胞分組及處理

取培養(yǎng)24 h后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞(細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)且貼壁細(xì)胞約占80%的培養(yǎng)板面積)，分組后分別用終濃度為0(對(duì)照組)、100、200、400、600 μmol/L的H2O2處理細(xì)胞0.5、1.0、2.0、4.0 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞存活率的測(cè)定

接種2.5×105個(gè)細(xì)胞到96孔板中，按照1.2.3的分組處理細(xì)胞后換上正常培養(yǎng)液，每孔加入10 μL噻唑藍(lán)(MTT)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去舊培養(yǎng)液，每孔加入100 μL純度為99.5%的二甲基亞砜(DMSO)，遮光振搖10 min，充分溶解甲瓚(formazan)。用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)下各孔的吸光度值(OD570 nm)，計(jì)算細(xì)胞存活率，數(shù)據(jù)用百分比表示(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。細(xì)胞存活率的計(jì)算公式如下：

細(xì)胞存活率(%)=(試驗(yàn)組OD570 nm/
對(duì)照組OD570 nm)×100。

1.2.5 培養(yǎng)液中LDH活性的檢測(cè)

細(xì)胞分組處理方法同1.2.3，分別收集不同濃度H2O2、不同處理時(shí)間的培養(yǎng)基上清液。按照試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn))所述方法，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)LDH活性。

1.2.6 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞經(jīng)不同濃度的H2O2處理1 h后用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化并拍照。

1.2.7 細(xì)胞中MDA含量、SOD活性的檢測(cè)

細(xì)胞分組處理方法同1.2.3，接種2.5×106個(gè)細(xì)胞到24孔板中，不同濃度的H2O2處理1 h。將細(xì)胞收集在1.5 mL離心管中，1 000×g離心4 min，棄掉上清液后用PBS清洗1次。加入200 μL的細(xì)胞裂解液，重懸細(xì)胞，裂解30 min，13 000×g離心10 min取上清液，按照試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn))所述方法檢測(cè)MDA含量和SOD活性。

1.2.8 細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中ROS水平的檢測(cè)

細(xì)胞收集方法同1.2.7，細(xì)胞凋亡率試驗(yàn)按照Annexin V-FITC/PI試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn))說明書，ROS水平按照ROS試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn))所述方法，均使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 天然植物抗氧化能力的評(píng)價(jià)

1.3.1 8種天然植物

依據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)和有關(guān)中藥的文獻(xiàn)報(bào)道[6-10]，選擇訶子(TerminaliachebulaRetz)、虎杖(PolygoniCuspidatiRhizomaetRadix)、荷葉(Foliumnelumbinis)、車前草(Plantaginisherba)、側(cè)柏葉(Platycladicacumen)、甘草(GlycyrrhizaeRadixetRhizoma)、大黃(RheiRadixetRhizoma)和肉桂(Cinnamomicortex)共8種天然植物(中藥飲片，且均為植物原粉)，利用所建立的肝細(xì)胞氧化損傷模型評(píng)價(jià)其抗氧化能力。

1.3.2 天然植物水提物的制備

將8種天然植物飲片分別用粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，各稱取一定量的粉末，按料液比1∶10加入雙蒸水，攪拌均勻，4 ℃浸泡24 h，用濾膜過濾2遍，將濾液放入冷凍干燥機(jī)，制成粉末，-80 ℃冷凍保存待用。

1.3.3 天然植物清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基能力的測(cè)定

清除DPPH自由基能力參照陳旭丹等[11]和王萍等[12]的方法測(cè)定并稍作改進(jìn)。將DPPH溶于無水乙醇中，配成終濃度為8.62×10-5mol/L的DPPH溶液。分別稱取0.128 g待測(cè)樣品，加入20 mL 75%乙醇，超聲提取5 min，8 000 r/min離心8 min，收集上清液，得到初始濃度為6.4 g/L的待測(cè)液母液，用無水乙醇稀釋成不同濃度。待測(cè)液與DPPH溶液各2 mL避光靜置30 min，517 nm處測(cè)定吸光度值(Ai)；待測(cè)液與無水乙醇各2 mL做參比，517 nm處測(cè)定吸光度值(Aj)；DPPH溶液與無水乙醇各2 mL做空白，517 nm處測(cè)定吸光度值(A0)。每個(gè)樣品做3個(gè)平行。按照下列公式計(jì)算DPPH清除率：

S(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100。

式中：S為DPPH自由基清除率；Aj為待測(cè)液在517 nm處的吸光度值；Ai為加入DPPH溶液后待測(cè)液在517 nm處的吸光度值；A0為DPPH溶液在517 nm處的吸光度值。

IC50定義為：自由基數(shù)目減少50%時(shí)所需要的樣品濃度，即為自由基清除率為50%時(shí)樣品的濃度。根據(jù)樣品濃度和對(duì)應(yīng)的DPPH清除率繪圖，得出公式，計(jì)算IC50。

1.3.4 天然植物對(duì)H2O2損傷細(xì)胞活性的測(cè)定

將細(xì)胞培養(yǎng)24 h之后分為對(duì)照組、模型組、試驗(yàn)組。對(duì)照組換正常培養(yǎng)液，模型組和試驗(yàn)組換含200 μmol/L H2O2的培養(yǎng)液，處理細(xì)胞1 h，棄掉培養(yǎng)液，試驗(yàn)組分別加入含不同濃度(0.5、1.0、2.0 mg/mL)天然植物水提物的培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h換正常培養(yǎng)液，采用MTT法檢測(cè)各組的吸光度值，以對(duì)照組為參照，計(jì)算各組細(xì)胞存活率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間差異顯著性用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，P<0.05表示顯著差異，P<0.01表示極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝細(xì)胞氧化損傷模型的構(gòu)建

2.1.1 細(xì)胞存活率

如圖1所示，4個(gè)處理時(shí)間(0.5、1.0、2.0、4.0 h)時(shí)細(xì)胞存活率均隨著H2O2濃度的增加而降低。100 μmol/L H2O2組細(xì)胞存活率在4個(gè)處理時(shí)間時(shí)均大于70%，細(xì)胞損傷程度不夠；而400和600 μmol/L H2O2組細(xì)胞存活率在4個(gè)處理時(shí)間時(shí)基本均小于50%，細(xì)胞壞死過多；200 μmol/L H2O2處理1.0～4.0 h時(shí)細(xì)胞存活率均降到50%～70%，可作為誘導(dǎo)氧化損傷模型的H2O2濃度。200 μmol/L H2O2處理1.0 h時(shí)細(xì)胞存活率為(64.85±0.38)%，且符合細(xì)胞損傷程度，可作為肝細(xì)胞氧化損傷模型建立的條件。

圖1 H2O2對(duì)細(xì)胞存活率的影響

2.1.2 培養(yǎng)液中LDH活性

如圖2所示，4個(gè)處理時(shí)間時(shí)LDH活性均隨H2O2濃度的增加先上升后趨于穩(wěn)定。與對(duì)照組相比，200、400、600 μmol/L H2O2組LDH活性在4個(gè)處理時(shí)間時(shí)均出現(xiàn)顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)，且200、400、600 μmol/L H2O2組之間沒有顯著差異(P>0.05)。200 μmol/L H2O2處理細(xì)胞1.0 h后培養(yǎng)液中LDH活性為(505.67±10.49) U/L，與對(duì)照組相比極顯著升高(P<0.01)。

*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

不同濃度H2O2處理細(xì)胞1 h后倒置顯微鏡觀察情況如圖3所示。對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞密度高，呈現(xiàn)圓形或橢圓形，形態(tài)飽滿，細(xì)胞膜邊緣清晰(圖3-A)。隨著H2O2濃度的增加，細(xì)胞體積逐漸變小，細(xì)胞膜出現(xiàn)破裂，邊緣模糊，細(xì)胞貼壁不牢。100 μmol/L H2O2組細(xì)胞較對(duì)照組無明顯變化(圖3-B)。200 μmol/L H2O2組部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜邊緣模糊，細(xì)胞少量皺縮，大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)完整細(xì)胞狀態(tài)(圖3-C)。400 μmol/L H2O2組部分細(xì)胞皺縮，胞內(nèi)顆粒物增多，出現(xiàn)些許細(xì)胞碎片(圖3-D)。600 μmol/L H2O2組細(xì)胞碎片很多，細(xì)胞凋亡壞死嚴(yán)重(圖3-E)。

2.1.4 細(xì)胞中MDA含量、SOD活性

不同濃度的H2O2處理細(xì)胞1 h后，細(xì)胞中MDA含量及SOD活性如表1所示。與對(duì)照組相比，各濃度H2O2組細(xì)胞中SOD活性均極顯著下降(P<0.01)，其中200 μmol/L H2O2組SOD活性為(57.55±1.20) U/mg prot，降低了24.50%。隨著H2O2濃度的增加，細(xì)胞中MDA含量逐漸升高，在H2O2濃度達(dá)到200 μmol/L時(shí)開始出現(xiàn)顯著升高(P<0.05)，之后保持穩(wěn)定。

2.1.5 細(xì)胞凋亡率

如圖4-A所示，不同濃度H2O2處理細(xì)胞1 h后，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，100 μmol/L H2O2組細(xì)胞已經(jīng)有明顯的凋亡，隨著H2O2濃度的增加，凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，400～600 μmol/L H2O2組晚期凋亡和壞死細(xì)胞明顯增多。如圖4-B所示，100、 200、400和600 μmol/L H2O2處理1 h后，細(xì)胞凋亡率分別為(21.29±1.62)%、(36.78±1.23)%、(53.82±3.56)%、(61.52±3.71)%，與對(duì)照組相比均極顯著升高(P<0.01)。

A圖為流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V/PI雙染結(jié)果；B圖為細(xì)胞凋亡率。

2.1.6 細(xì)胞中ROS水平

如圖5所示，H2O2濃度為0～200 μmol/L時(shí)細(xì)胞中ROS水平隨H2O2濃度的升高而升高，在200 μmol/L時(shí)達(dá)到最高，與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)；H2O2濃度為400～600 μmol/L時(shí)細(xì)胞中ROS水平逐漸降低。100～600 μmol/L H2O2處理細(xì)胞1 h后，細(xì)胞中ROS水平用平均熒光強(qiáng)度來表示分別為62.0±4.0、103.7±2.5、109.3±1.5、87.0±6.3、66.3±3.0。

圖5 不同濃度H2O2對(duì)細(xì)胞中ROS水平的影響

2.2 天然植物抗氧化能力評(píng)價(jià)

2.2.1 8種天然植物清除DPPH自由基能力比較

清除自由基能力以IC50進(jìn)行比較，IC50值越小表明樣品清除自由基能力越強(qiáng)，抗氧化能力越高。根據(jù)表2結(jié)果得知，訶子、虎杖、大黃、荷葉的清除DPPH自由基能力無顯著差異(P>0.05)，虎杖、大黃、荷葉、肉桂的清除DPPH自由基能力無顯著差異(P>0.05)。8種天然植物的清除DPPH自由基能力大小排序?yàn)樵X子≥虎杖≥荷葉≥大黃≥肉桂>側(cè)柏葉>車前草>甘草。清除DPPH自由基能力最強(qiáng)的是訶子。

表2 8種天然植物的清除DPPH自由基能力

2.2.2 8種天然植物對(duì)H2O2損傷細(xì)胞存活率的影響

由表3結(jié)果可知，0.5、1.0、2.0 mg/mL組細(xì)胞存活率與模型組相比均有所提高且隨天然植物水提物濃度的升高而增加。濃度為0.5 mg/mL時(shí)，8種天然植物組的細(xì)胞存活率排序?yàn)樵X子>肉桂>荷葉≥大黃≥虎杖≥側(cè)柏葉≥甘草≥車前草，細(xì)胞存活率分別為(140.84±0.07)%、(90.82±0.03)%、(65.68±0.02)%、(64.49±0.03)%、(60.58±0.02)%、(50.56±0.01)%、(53.50±0.06)%、(53.87±0.01)%。濃度為1.0 mg/mL時(shí)，8種天然植物組的細(xì)胞存活率排序?yàn)樵X子>肉桂≥荷葉≥虎杖>側(cè)柏葉≥大黃≥甘草≥車前草，細(xì)胞存活率分別為(180.36±0.07)%、(90.38±0.04)%、(74.51±0.02)%、(73.27±0.04)%、(52.74±0.02)%、(61.27±0.04)%、(56.03±0.01)%、(58.77±0.03)%。濃度為2.0 mg/mL時(shí)，8種天然植物組的細(xì)胞存活率排序?yàn)樵X子>虎杖≥肉桂≥荷葉>大黃≥側(cè)柏葉≥甘草≥車前草，細(xì)胞存活率分別為(211.34±0.05)%、(102.32±0.07)%、(94.58±0.04)%、(88.66±0.02)%、(76.95±0.05)%、(60.30±0.03)%、(59.49±0.02)%、(62.65±0.03)%。3個(gè)濃度下8種天然植物處理后的細(xì)胞存活率排序基本一致。訶子水提物在濃度為0.5 mg/mL時(shí)細(xì)胞存活率就能達(dá)到對(duì)照組水平，且比對(duì)照組高出40.84%；3個(gè)濃度的肉桂水提物均能使細(xì)胞存活率達(dá)到90%以上；訶子對(duì)損傷細(xì)胞的修復(fù)能力最強(qiáng)，最弱的為甘草和車前草。

表3 8種天然植物對(duì)H2O2損傷細(xì)胞存活率的影響(相對(duì)于對(duì)照組)

續(xù)表3項(xiàng)目 Items對(duì)照組 Control group模型組 Model group0.5 mg/mL組0.5 mg/mL group1.0 mg/mL組1.0 mg/mL group2.0 mg/mL組2.0 mg/mL group大黃 Rhei Radix et Rhizoma100.00±0.0853.62±0.0464.49±0.03c61.27±0.04c76.95±0.05d車前草Plantaginis herba100.00±0.0252.69±0.0253.87±0.01cd58.77±0.03d62.65±0.03de荷葉 Folium nelumbinis100.00±0.0546.83±0.0265.68±0.02c74.51±0.02bc88.66±0.02c側(cè)柏葉 Platycladi cacumen100.00±0.0344.48±0.0350.56±0.01cd52.74±0.02d60.30±0.03de甘草 Glycyrrhizae Radix et Rhizoma100.00±0.0752.35±0.0453.50±0.06cd56.03±0.01cd59.49±0.02de

3 討 論

3.1 H2O2誘導(dǎo)草魚原代肝細(xì)胞氧化損傷模型的條件

以H2O2作為造模劑構(gòu)建體外氧化損傷模型的研究已經(jīng)有很多報(bào)道，如人、大鼠、小鼠、建鯉、斜帶石斑魚等肝細(xì)胞或其他細(xì)胞的氧化損傷模型[13-16]，而關(guān)于建立草魚肝細(xì)胞氧化損傷模型的報(bào)道極少。由于細(xì)胞種類和性質(zhì)不同，對(duì)外界應(yīng)激的耐受程度不同，因此以H2O2為造模劑建模的標(biāo)準(zhǔn)和模型檢驗(yàn)方法也不完全相同[17]。細(xì)胞存活率是表征細(xì)胞狀態(tài)的基礎(chǔ)指標(biāo)，直接反映外界刺激對(duì)細(xì)胞的損傷程度。很多報(bào)道都以細(xì)胞存活率作為建?；A(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞存活率不能過低或者過高，過低(<50%)表明大量細(xì)胞可能發(fā)生不可逆損傷，不利于氧化機(jī)制的研究；過高(>70%)則說明細(xì)胞狀態(tài)良好，沒造成明顯的氧化損傷，不利于后期試驗(yàn)的進(jìn)展[18]。細(xì)胞存活率在50%～70%時(shí)能作為建立模型的基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)。

檢驗(yàn)建模成功與否的指標(biāo)較多，包括LDH活性、MDA含量、SOD活性、ROS水平和細(xì)胞凋亡率等。LDH存在于活細(xì)胞胞漿中，當(dāng)細(xì)胞膜受損時(shí)，LDH會(huì)滲出到細(xì)胞外，通過檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH活性就可判斷細(xì)胞膜的完整性，從而判斷細(xì)胞損傷程度[19]。MDA是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)后產(chǎn)生的，MDA含量的多少能夠反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映細(xì)胞的損傷程度[20]。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，催化過氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，清除多余自由基，作為各種器官組織中第1道抗氧化防御系統(tǒng)，防止自由基對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，SOD活性的變化能反映機(jī)體清除氧自由基的能力[21]。細(xì)胞中ROS水平和細(xì)胞凋亡率直接體現(xiàn)細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，用200 μmol/L H2O2處理細(xì)胞1.0 h后，與對(duì)照組相比，培養(yǎng)液中LDH活性升高13.88%，細(xì)胞中MDA含量增加5.56%、SOD活性降低24.49%，細(xì)胞凋亡率增加68.08%，細(xì)胞中ROS水平增加43.28%，且與對(duì)照組的差異均達(dá)到顯著水平，該處理可作為建立草魚原代肝細(xì)胞氧化損傷模型的條件。

3.2 應(yīng)用草魚原代肝細(xì)胞氧化損傷模型評(píng)價(jià)8種天然植物的抗氧化能力

植物多酚廣泛存在于天然植物中，多酚類化合物主要包括黃酮類化合物、酚酸類化合物，這也是植物提取物發(fā)揮抗氧化活性的主要成分。植物多酚的抗氧化作用體現(xiàn)在它能夠清除自由基、抑制氧化酶活性、提高抗氧化酶活性[22]。外源性的抗氧化劑能夠調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)抗氧化平衡，研究天然植物的抗氧化能力對(duì)抗氧化劑的篩選具有重要意義。

訶子的主要活性成分包括訶子多酚、鞣質(zhì)類、三萜皂苷、訶子多糖等[23]；虎杖中主要含有蒽醌類、芪類、黃酮類和酚類等活性成分[24]；肉桂的主要活性成分是肉桂油，其中肉桂醛的含量是最高的，除此之外還有萜類、苯丙素類、酚苷類、黃酮類等活性成分[25]；大黃的主要活性成分包括大黃素、大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚在內(nèi)的游離蒽醌[26]；荷葉的主要活性成分包括多種生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油類、多糖類有機(jī)酸類等[27]；車前草含有多糖類、黃酮類、萜類和揮發(fā)油等活性成分[28]；側(cè)柏葉中的主要活性成分是揮發(fā)油、黃酮、鞣質(zhì)等[29]；甘草中的主要活性成分有三萜類、黃酮類和甘草多糖類[30]。8種天然植物都含有抗氧化多酚類化合物，多酚類化合物可通過氫自由基淬滅體內(nèi)的ROS，抑制卵磷脂脂質(zhì)過氧化損傷。多酚類化合物可激活抗氧化信號(hào)通路、緩解應(yīng)激、調(diào)節(jié)抗氧化酶的表達(dá)，從而減少氧化損傷。訶子的多酚含量達(dá)到13.27%，這是8種天然植物中訶子的抗氧化能力最強(qiáng)的主要原因[31]。有關(guān)研究報(bào)道，訶子對(duì)小鼠有明顯的抗氧化作用，能夠保護(hù)肝細(xì)胞[32]。

通過細(xì)胞模型試驗(yàn)評(píng)價(jià)天然植物的體外抗氧化能力，并結(jié)合化學(xué)分析法測(cè)定天然植物對(duì)自由基的清除能力，既能通過細(xì)胞模型試驗(yàn)評(píng)價(jià)天然植物的抗氧化能力，又可以根據(jù)天然植物對(duì)損傷細(xì)胞的影響來檢測(cè)細(xì)胞模型建立的是否成功[33]。有文獻(xiàn)報(bào)道抗氧化能力即為清除相關(guān)自由基的能力[34]。通過進(jìn)一步比較分析表2和表3的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，8種天然植物水提物對(duì)氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞修復(fù)能力的強(qiáng)弱順序與8種天然植物清除DPPH自由基能力的高低順序基本一致。訶子的氧化損傷修復(fù)能力最強(qiáng)，0.5 mg/mL的訶子水提物修復(fù)損傷細(xì)胞12 h后，細(xì)胞存活率比對(duì)照組還高出40.84%；訶子的IC50值最小，清除DPPH自由基能力最高。0.5 mg/mL的車前草和甘草水提物修復(fù)損傷細(xì)胞12 h后，細(xì)胞存活率升高不明顯；車前草和甘草的IC50值最大，清除DPPH自由基能力最弱。以上結(jié)果表明天然植物對(duì)細(xì)胞氧化損傷修復(fù)作用與每種天然植物的抗氧化能力(清除DPPH自由基能力)的高低有關(guān)。

從本試驗(yàn)結(jié)果分析，H2O2處理相同時(shí)間時(shí)，細(xì)胞存活率隨H2O2濃度的升高而降低。同一濃度H2O2處理細(xì)胞，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率有先降低后升高的趨勢(shì)。這可能是由于H2O2對(duì)細(xì)胞具有雙向反應(yīng)，細(xì)胞隨時(shí)間變化對(duì)H2O2的削弱作用加強(qiáng)，從而刺激細(xì)胞增長(zhǎng)。200 μmol/L H2O2處理1.0 h時(shí)細(xì)胞存活率為(64.85±0.38)%，符合建模要求的細(xì)胞存活率范圍(50%～70%)。從細(xì)胞形態(tài)來看，200 μmol/L H2O2組部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜邊緣模糊，細(xì)胞少量皺縮，胞內(nèi)顆粒變多，但大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)完整細(xì)胞狀態(tài)，利于后期抗氧化物質(zhì)篩選的研究。細(xì)胞內(nèi)ROS水平隨H2O2濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，可能是因?yàn)楦邼舛鹊腍2O2導(dǎo)致大量細(xì)胞壞死，細(xì)胞破裂，未檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)的ROS，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。在損傷后的細(xì)胞培養(yǎng)液中添加天然植物水提物能夠提高細(xì)胞的存活率，對(duì)損傷細(xì)胞具有一定的修復(fù)能力，且修復(fù)效果與天然植物本身抗氧化能力的高低有關(guān)，天然植物能夠修復(fù)氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞，進(jìn)一步驗(yàn)證了本試驗(yàn)所篩選的H2O2濃度和處理時(shí)間能成功構(gòu)建草魚原代肝細(xì)胞氧化損傷模型。

4 結(jié) 論

① 以草魚原代肝細(xì)胞作為試驗(yàn)對(duì)象，以含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基為培養(yǎng)液，在5% CO2、27 ℃培養(yǎng)條件下，以培養(yǎng)液中終濃度為200 μmol/L的H2O2為造模劑、處理肝細(xì)胞1 h，可以成功構(gòu)建草魚原代肝細(xì)胞氧化損傷模型，模型特征為細(xì)胞存活率在50%～70%，細(xì)胞表現(xiàn)為明顯的氧化損傷，且出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率在30%～50%。

② 本試驗(yàn)利用H2O2構(gòu)建的草魚原代肝細(xì)胞氧化損傷模型可以用于天然植物抗氧化能力的評(píng)價(jià)和抗氧化損傷修復(fù)天然植物的篩選，在所評(píng)價(jià)的8種天然植物中，以訶子的抗氧化能力最佳且氧化損傷修復(fù)能力最強(qiáng)。