高、低淀粉飼糧對山羊小腸甜味受體信號通路基因表達(dá)的影響

燕愛飛 周芳芳 康勁翮 王 榮 王 敏 林 波 冉 濤 劉 勇* 譚支良

(1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國家工程實驗室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)中心，長沙 2410125；2.中國科學(xué)院大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，北京 2100049；3.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 2530004)

近年來，高谷物飼糧已成為提升反芻動物養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的一種營養(yǎng)策略。淀粉(starch)作為高谷物飼糧的重要能源物質(zhì)，充分研究其在反芻動物胃腸道中感應(yīng)、轉(zhuǎn)運和吸收等生理過程，對于指導(dǎo)畜牧生產(chǎn)、通過營養(yǎng)調(diào)控手段實現(xiàn)養(yǎng)殖業(yè)提質(zhì)增效具有重要意義。

飼糧中約80%淀粉被瘤胃微生物降解成揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)，經(jīng)瘤胃上皮吸收，為機(jī)體提供能量。高谷物飼糧中5%～20%淀粉到達(dá)小腸，并經(jīng)胰α淀粉酶作用生成寡糖、低聚糖、二糖或單糖[1]，然后在位于腸上皮內(nèi)的感應(yīng)受體和轉(zhuǎn)運載體的作用下被吸收利用。腸道內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)感應(yīng)受體主要是G-蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors，GPCRs)[2-3]，如感應(yīng)糖類物質(zhì)的甜味受體Ⅰ型味覺受體2/Ⅰ型味覺受體3(taste receptor type 1 member 2/taste receptor type 1 member3， T1R2/T1R3)。甜味受體T1R2/T1R3是由第一味覺受體家族(taste receptor family 1， T1Rs)中T1R2和T1R3構(gòu)成的異二聚體，是人類及部分哺乳動物口腔及胃腸道內(nèi)的主要甜味物質(zhì)感應(yīng)受體[4-6]。T1R2/T1R3感知腸腔中葡萄糖[4，7]，激活級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促使腸道味覺化學(xué)感應(yīng)細(xì)胞(taste-chemosensory cells，TCS)活化，一方面將甜味信號分子以及腸腔內(nèi)葡萄糖信號傳導(dǎo)給神經(jīng)系統(tǒng)，另外一方面激活鈉/葡萄糖共轉(zhuǎn)運載體1(sodium-glucose linked transporter 1，SGLT1)和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2(glucose transporters 2，GLUT2)實現(xiàn)單糖的轉(zhuǎn)運。單糖或人工甜味劑與其關(guān)鍵位點結(jié)合，活化α-味移導(dǎo)素(α-gustducin)，并產(chǎn)生活性的G蛋白α亞基和游離β、γ亞基[8]。α亞基通過環(huán)磷酸腺苷(cAMP)途徑引起胞外Ca2+內(nèi)流，使TCS去極化；β、γ亞基激活磷脂酶 C-β2(phospholipaseC-β2， PLC-β2)使其發(fā)生異構(gòu)化，分解磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)產(chǎn)生三磷酸肌醇(IP3)和二酰甘油(DAG)，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲存的大量Ca2+釋放到細(xì)胞質(zhì)中，引起瞬態(tài)受體電位陽離子通道的開放，促進(jìn)Na+內(nèi)流而使TCS去極化[9-13]。T1R2/T1R3介導(dǎo)信號通路能促進(jìn)腸道激素如胃泌素抑制肽(gastrin inhibitory peptide，GIP)、胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)和胰高血糖素樣肽-2(glucagon-like peptide-2，GLP-2)的分泌[14]，并促進(jìn)SGLT1的表達(dá)[15]。有研究證實甜味受體T1R2/T1R3與SGLT1和GLUT2的表達(dá)呈顯著正相關(guān)[16]。在實際生產(chǎn)中，給反芻動物飼喂高淀粉飼糧無疑會使過瘤胃淀粉比率增加，因而使得小腸單糖濃度升高，猜測這一系列變化將活化腸道甜味化學(xué)感應(yīng)細(xì)胞，激活T1R2/T1R3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并對在葡萄糖感知、吸收轉(zhuǎn)運以及腸道激素分泌等方面發(fā)揮重要作用。對甜味受體的研究可以為提高淀粉在小腸內(nèi)的消化利用率提供新的思路。因此，本研究旨在探明成年黑山羊采食高、低淀粉飼糧對甜味受體T1R2/T1R3及其信號通路元件基因表達(dá)以及腸道激素濃度的影響，為反芻動物飼糧配制及營養(yǎng)調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

選用20只體況良好、體重[(17.50±2.67) kg]相近的(10.0±0.5)月齡雄性湘東黑山羊作為試驗動物，隨機(jī)分為2組(每組10只)，分別飼喂以玉米粉和玉米皮為主要能量飼料的高淀粉飼糧(50.4%，HS組)和低淀粉飼糧(13.1%，LS組)。飼糧配方參照NRC(2012)標(biāo)準(zhǔn)配制，精粗比為75∶25，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗動物單籠飼養(yǎng)，每天08：00和18：00各飼喂1次，自由飲水，預(yù)試期10 d，正試期38 d。試驗期間，每天記錄飼喂量和余料量，計算日采食量(剩料<5%)，試驗最后1周全收集糞、尿，用于計算營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率。本試驗所涉及動物飼養(yǎng)管理與屠宰流程符合中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所動物實驗倫理委員會的動物倫理要求。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 營養(yǎng)成分測定

精料、粗料和糞樣中常規(guī)營養(yǎng)成分含量均參照AOAC(1990)[17]方法進(jìn)行測定。干物質(zhì)含量采用烘干法(GB/T 6435—2014)測定；能量(GE)采用氧彈式量熱計方法(ISO/9831—1998)，利用等溫式全自動量熱儀(Cskaide， 5E-AC8018)測定；粗蛋白質(zhì)(CP)含量采用凱氏定氮法(GB/T 6432—2018)測定；中性洗滌纖維(NDF，GB/T 20806—2006)和酸性洗滌纖維(ADF，NY/T 1459—2007)含量采用范氏洗滌纖維法，利用自動纖維分析儀(Gerhardt， Fibretherm FT 12)測定；粗灰分(Ash)以及有機(jī)物(OM)含量采用灼燒法(GB/T 6438—1992)測定；纖維素含量參照李華等[18]的方法測定；粗脂肪(CF)含量采用索氏抽提法(GB/T 6433—2006)，利用全自動脂肪測定儀(Gerhardt， SOX 402 Micro/SOX 416 Macro)測定；淀粉含量參照GB/T 5009.159—2003的酶水解法測定。為保證數(shù)據(jù)的可靠性，每個樣品單個營養(yǎng)成分含量測定均設(shè)定2個平行。營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率計算公式如下：

營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率(%)=[(營養(yǎng)物質(zhì)
攝入量-糞中營養(yǎng)物質(zhì)排出量)/營養(yǎng)物質(zhì)攝入量]×100。

1.3 樣品采集

飼養(yǎng)試驗結(jié)束，試驗羊稱重、屠宰和采集樣品。分別取十二指腸中段、空腸前端(0.5 m)和回腸末端(2～3 cm)處的組織樣品，生理鹽水沖洗3～5次，4%多聚甲醛組織固定液固定12～24 h，蘇木精-伊紅(HE)染色法用于形態(tài)學(xué)觀察；各腸道相同位置取5～10 cm組織樣品，生理鹽水沖洗3～5次，液氮凍存，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于提取RNA。收集十二指腸、空腸和回腸內(nèi)容物20 g，液氮凍存，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于測定腸道內(nèi)容物激素及葡萄糖濃度。

1.4 腸道黏膜形態(tài)學(xué)檢測

參考Lesmeister等[19]的組織切片法，將腸道固定樣品經(jīng)洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、染色和封片等處理，用正置熒光顯微鏡(Olympus， BX51)觀察腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)。用圖像采集處理軟件(DP2-BSW)測量小腸絨毛高度、絨毛寬度和隱窩深度，每個切片讀取6次數(shù)值。

1.5 腸道內(nèi)容物激素濃度測定

參照酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒說明書(凡科維)，用酶標(biāo)儀(Raytort-6100)測定腸道內(nèi)容物和腸道黏膜中的GLP-1、GLP-2、膽囊收縮素(CCK)、GIP和酪酪肽(Pyy)的濃度[20]。

1.6 腸道甜味受體基因表達(dá)量測定

將-80 ℃組織樣品解凍，用Trizol(Invitrogen，美國)試劑盒參照產(chǎn)品說明從樣品中提取總RNA[21]。用DNase I (Thermo Scientific，美國)清除DNA分子，使用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific，美國)測定RNA質(zhì)量和濃度，并用凝膠電泳檢測所提取的RNA的完整性。隨后立即用PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa，日本)對符合質(zhì)量要求的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將制備的cDNA樣品進(jìn)一步純化、定量并稀釋至相同初始濃度，-20 ℃保存。根據(jù)GenBank中發(fā)表的山羊基因序列設(shè)計，使用Primer premier 6.0軟件進(jìn)行目的基因和內(nèi)參基因[甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)]的引物設(shè)計，并用Primer BLAST工具在線進(jìn)行引物特異性分析。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列及參數(shù)見表2。

表2 引物序列及參數(shù)

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)先經(jīng)Excel 2016進(jìn)行匯總，再使用SPSS 24進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用one-way ANOVA程序進(jìn)行方差分析，試驗結(jié)果均以平均值(mean)及均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，設(shè)定P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.15為有變化趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 高、低淀粉飼糧對山羊營養(yǎng)物質(zhì)攝入量和營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

由表3可知，在營養(yǎng)物質(zhì)攝入量方面，雖然2組山羊DM、OM和GE攝入量無顯著差異(P>0.05)，但是HS組山羊攝入的CP、NDF和ADF均較LS組顯著降低(P<0.05)，而淀粉的攝入量顯著提高(P<0.05)；在表觀消化率方面，與LS組比，HS組中淀粉、DM和OM的表觀消化率均顯著提高(P<0.05)，但NDF、ADF和CP的表觀消化率均顯著下降(P<0.05)。

表3 高、低淀粉飼糧對山羊營養(yǎng)物質(zhì)攝入量和表觀消化率的影響

2.2 高、低淀粉飼糧對山羊小腸黏膜結(jié)構(gòu)的影響

由表4可知，HS組十二指腸絨毛高度(P=0.072)和隱窩深度(P=0.084)低于LS組，但絨毛高度/隱窩深度(V/C)在2組間沒有顯著差異(P>0.05)；空腸和回腸的絨毛高度、隱窩深度及V/C均無顯著差異(P>0.05)。

表4 高、低淀粉飼糧對山羊小腸腸道黏膜結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可知，各營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率對十二指腸和空腸黏膜結(jié)構(gòu)的影響程度大于回腸，且淀粉表觀消化率與空腸的絨毛高度(r=-0.27，P<0.01)和隱窩深度(r=-0.29，P=0.02)呈顯著負(fù)相關(guān)，而空腸絨毛高度和隱窩深度與CP、ADF和NDF表觀消化率呈顯著正相關(guān)性，絨毛高度與CP、ADF和NDF表觀消化率正相關(guān)系數(shù)分別為0.34、0.28和0.27(P<0.01、P<0.01和P<0.01)，隱窩深度與CP、ADF和NDF表觀消化率的相關(guān)系數(shù)分別為0.30、0.25和0.22(P<0.05、P=0.22和P=0.36)。

NDF_AD：中性洗滌纖維表觀消化率；ADF_AD：酸性洗滌纖維表觀消化率；CP_AD：粗蛋白質(zhì)表觀消化率；Starch_AD：淀粉表觀消化率；DMI：干物質(zhì)采食量 dry matter intake；VH_duodenum：十二指腸的絨毛高度；CD_duodenum：十二指腸的隱窩深度；V/C_duodenum：十二指腸的絨毛高度/隱窩深度；VH_Jejunum：空腸的絨毛高度；CD_Jejunum：空腸的隱窩深度；V/C_Jejunum：空腸的絨毛高度/隱窩深度；VH_ileum：回腸的絨毛高度；CD_ileum：回腸的隱窩深度；V/C_ileum：回腸的絨毛高度/隱窩深度；JGlucose-conc：空腸內(nèi)容物葡萄糖濃度；IGlucose-conc：回腸內(nèi)容物葡萄糖濃度。下圖同 the same as below。

2.3 高、低淀粉飼糧對山羊回腸黏膜和內(nèi)容物中激素濃度的影響

由表5可知，回腸黏膜中CKK、GLP-1、GLP-2、Pyy和GIP濃度在2組間無顯著差異(P>0.05)；HS組回腸內(nèi)容物GLP-1濃度顯著高于LS組(P<0.05)，但2組間Pyy、GIP、CCK和GLP-2濃度無顯著差異(P>0.05)。

表5 高、低淀粉飼糧對山羊回腸黏膜和內(nèi)容物中激素濃度的影響

由圖2可知，回腸黏膜中各激素濃度的相關(guān)性強且具有協(xié)同效應(yīng)(聚類分析)，其中Pyy濃度與GLP-2、GLP-1濃度的相關(guān)系數(shù)分別為0.82(P<0.01)和0.73(P<0.01)，而GLP-1與GLP-2濃度間的相關(guān)系數(shù)為0.60(P<0.01)。從營養(yǎng)學(xué)角度分析，回腸黏膜中CCK(r=0.27，P<0.01)、GLP-2(r=0.20，P=0.08)和Pyy(r=0.22，P<0.05)濃度與淀粉攝入量呈正相關(guān)，而GLP-1(r=-0.01，P=0.49)和GIP(r=-0.11，P=0.14)濃度則與淀粉攝入量呈負(fù)相關(guān)性；同時，表中腸道激素濃度與CP、NDF和ADF攝入量的相關(guān)性與淀粉攝入量的相關(guān)性相反(圖2)。

ADF_intake：酸性洗滌纖維攝入量；NDF_intake：中性洗滌纖維攝入量；CP_intake：粗蛋白質(zhì)攝入量；Starch_intake：淀粉攝入量；GIP：胃泌素抑制肽 gastric inhibitory polypeptide；GLP-1：胰高血糖素樣肽-1 glucagon-like peptide-1；GLP-2：胰高血糖素樣肽-2 glucagon-like peptide-2；CCK：膽囊收縮素 cholecystokinin；Pyy：酪酪肽 peptide tyrosine-tyrosine。下圖同 the same as below。

2.4 高、低淀粉飼糧對山羊甜味受體以及關(guān)鍵通路元件基因表達(dá)量的影響

由表6可知，除HS組空腸中α-gustducin的基因表達(dá)量顯著低于LS組(P<0.05)之外，其余甜味受體通路元件包括T1R3、α-gustducin、TRPM5、GLUT2和SGLT1基因在十二指腸、空腸和回腸的表達(dá)量在2組間均無顯著差異(P>0.05)。

表6 高、低淀粉飼糧對山羊甜味受體以及通路關(guān)鍵元件基因表達(dá)量的影響

由圖3可知，空腸中T1R3、TRPM5、SGLT1和GLUT2基因表達(dá)量與淀粉攝入量存在一定的正相關(guān)性，空腸α-gustducin基因表達(dá)量與淀粉表觀消化率間則存在一定的負(fù)相關(guān)(r=-0.21，P=0.08)。與淀粉表觀消化率相比，空腸T1R3、TRPM5基因表達(dá)量與CP、ADF和NDF表觀消化率的相關(guān)系數(shù)更低(r<0.05，P>0.05)，而GLUT2和SGLT1基因表達(dá)量與CP、ADF和NDF表觀消化率間則呈負(fù)相關(guān)(-0.100.05)。回腸T1R3(r=-0.10，P<0.01)和α-gustducin(r=-0.34，P<0.01)的基因表達(dá)量與淀粉表觀消化率呈顯著負(fù)相關(guān)，回腸T1R3基因表達(dá)量與CP、ADF和NDF的表觀消化率呈顯著正相關(guān)(0.02

NDF_AD：酸性洗滌纖維表觀消化率；ADF_AD：中性洗滌纖維表觀消化率；CP_AD：粗蛋白質(zhì)表觀消化率；Starch_AD：淀粉表觀消化率；GLUT2：葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2 glucose transporters 2；TRPM5：瞬時受體電位離子通道蛋白M型5 transient receptor potential cation channel subfamily M member 5；T1R3：Ⅰ型味覺受體3 taste receptor type 1 member 3；SGLT1：鈉/葡萄糖共轉(zhuǎn)運載體1 sodium-glucose linked transporter 1；α-gustducin：α-味移導(dǎo)素。下圖同 the same as below。

2.5 高、低淀粉飼糧對山羊小腸內(nèi)容物葡萄糖濃度的影響

由表7可知，HS組空腸和回腸內(nèi)容物中葡萄糖濃度均顯著高于LS組(P<0.05)。

表7 高、低淀粉飼糧對山羊小腸內(nèi)容物葡萄糖濃度的影響

2.6 回腸甜味受體通路元件與回腸黏膜激素濃度和葡萄糖濃度的關(guān)聯(lián)分析

由圖4可知，回腸T1R3基因表達(dá)量與回腸黏膜中CCK濃度的相關(guān)系數(shù)為-0.36(P<0.01)?；啬c內(nèi)容物葡萄糖濃度跟腸道黏膜GLP-1濃度的相關(guān)系數(shù)為0.48(P<0.01)，與GIP濃度的相關(guān)系數(shù)為0.45(P<0.01)，與Pyy濃度的相關(guān)系數(shù)為0.45(P<0.01)?；啬cSGLT1和α-gustducin基因表達(dá)量與腸道內(nèi)容物葡萄糖濃度的相關(guān)系數(shù)分別為0.28(P<0.05)和0.26(P<0.05)。

Crypt_depth：隱窩深度；Villus_height：絨毛高度；V/C：絨毛高度/隱窩深度 villus height/crypt depth。

3 討 論

反芻動物對甜味和鮮味存在一定偏好，研究發(fā)現(xiàn)飼糧中水溶性碳水化合物含量升高可促進(jìn)動物采食。淀粉在反芻動物小腸內(nèi)消化的終產(chǎn)物為葡萄糖，而甜味受體T1R2/T1R3通過其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)對葡萄糖的感應(yīng)，但是攝入高淀粉飼糧對甜味受體T1R2/T1R3介導(dǎo)的信號通路(α-gustducin、TRPM5)以及葡萄糖轉(zhuǎn)運載體(SGLT1、GLUT2)基因表達(dá)的影響尚未見報道。

小腸黏膜結(jié)構(gòu)易受飼糧結(jié)構(gòu)的影響，研究證實各類營養(yǎng)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、淀粉或脂肪，能促進(jìn)小腸發(fā)育[22-24]。?itan等[25]報道稱，高精料飼糧可影響十二指腸、空腸的腸絨毛高度以及十二指腸隱窩深度，但王艷紅[26]指出飼糧淀粉水平并不影響除空腸絨毛高度以外的小腸形態(tài)。本試驗中，高淀粉飼糧使山羊十二指腸和空腸絨毛高度分別下降了23.92%和18.38%，使十二指腸隱窩深度下降了22.73%。而高淀粉飼糧對回腸黏膜結(jié)構(gòu)無顯著影響，這與王艷紅[26]報道一致。本研究中，飼糧淀粉表觀消化率與腸道黏膜結(jié)構(gòu)間呈弱相關(guān)性，可能是本試驗中采用10月齡的育肥山羊為試驗動物，其腸道發(fā)育趨于成熟，受飼糧的影響較小，這可能與瘤胃微生物降解淀粉生成的揮發(fā)性脂肪酸有關(guān)(揮發(fā)性脂肪酸能改善腸道屏障功能，保護(hù)上皮完整性)[27-28]。

甜味受體T1R2/T1R3具有腸道甜味感受及調(diào)節(jié)葡萄糖動態(tài)平衡的作用，腸腔內(nèi)甜味物質(zhì)被腸上皮細(xì)胞頂端的甜味受體感知，促使腸道激素的釋放。本試驗中HS組回腸黏膜和腸道內(nèi)容物中的GLP-1和GLP-2濃度都略高于LS組，但二者間無顯著差異。其原因可能是GLP-1分泌后被快速水解或與受體(GLP-1R)結(jié)合而發(fā)生自身磷酸化反應(yīng)，導(dǎo)致了腸黏膜組織內(nèi)GLP-1濃度差異不顯著。GLP-1、GLP-2等腸道激素的分泌受腸腔內(nèi)單糖濃度的影響，腸道激素濃度跟淀粉攝入量呈正相關(guān)性(與CP、ADF和NDF攝入量呈負(fù)相關(guān)性)，但相關(guān)系數(shù)不高，這也在一定程度說明了淀粉攝入量是影響腸道激素濃度的重要因素。另外，因屠宰時需要采取饑餓處理，故本試驗中測定的腸道激素濃度僅代表在低營養(yǎng)狀態(tài)下的特征值，這有可能是本研究腸道激素濃度差異不顯著以及相關(guān)性系數(shù)不高的一個原因。

山羊腸道中廣泛表達(dá)甜味受體T1R2/T1R3，但隨著日齡的增長而表達(dá)量下降[16]，而且隨著瘤胃功能逐漸發(fā)育完善，瘤胃微生物對淀粉起主導(dǎo)消化作用。此外，飼糧能量水平也會影響T1R2/T1R3基因表達(dá)。高糖攝入增加血糖濃度，使甜味受體介導(dǎo)的GLP-1等降血糖素的分泌增加，引起T1R2/T1R3基因的表達(dá)量降低[29]。本研究中甜味受體和通路元件的基因表達(dá)量之間呈上調(diào)或下調(diào)的協(xié)同變化趨勢，免疫熒光共定位試驗證明甜味受體蛋白及下游信號蛋白α-gustducin、TRPM5之間存在共表達(dá)關(guān)系[30]。綜合分析，回腸和空腸各特征值間的相關(guān)性結(jié)果顯示，淀粉是甜味信號通路相關(guān)元件和葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因表達(dá)的主要影響因素。在腸道中，甜味受體、腸道激素、葡萄糖轉(zhuǎn)運載體及腸道內(nèi)葡萄糖濃度間組成一個動態(tài)穩(wěn)衡網(wǎng)絡(luò)，本試驗中HS組甜味受體介導(dǎo)信號通路元件的基因表達(dá)量無顯著變化，原因可能是機(jī)體為了維持糖代謝，通過降低關(guān)鍵元件的基因表達(dá)而減少糖的攝入，但這個猜測需進(jìn)一步驗證。

山羊十二指腸和空腸是甜味受體表達(dá)的主要部位[17]。本試驗中空腸甜味受體T1R2/T1R3通路元件基因表達(dá)量高于回腸和十二指腸，空腸內(nèi)容物葡萄糖的濃度也高于回腸，說明空腸可能是糖類消化吸收的主要場所。腸中單糖、寡糖或其類似物均可直接調(diào)控腸黏膜中SGLT1的基因表達(dá)[31]，但本試驗中不同水平淀粉飼糧對腸道中SGLT1、GLUT2的基因表達(dá)量無顯著影響，但空腸中SGLT1、GLUT2基因表達(dá)量與空腸內(nèi)容物中葡萄糖濃度呈正相關(guān)。而回腸中則表現(xiàn)出相反的結(jié)果，可能是空腸作為短鏈碳水化合物消化吸收的主要場所，導(dǎo)致進(jìn)入回腸內(nèi)葡萄糖濃度低。本試驗結(jié)果顯示，T1R3、SGLT1和GLUT2在腸道內(nèi)的基因表達(dá)具有協(xié)同關(guān)系，甜味受體的基因表達(dá)量與SGLT1、GLUT2基因表達(dá)量之間呈正相關(guān)[16]。針對幼齡羔羊，因瘤胃功能尚未發(fā)育成熟，進(jìn)入小腸的葡萄糖濃度增加，直接刺激羔羊腸腔中葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因mRNA的表達(dá)，進(jìn)而增加羔羊小腸葡萄糖轉(zhuǎn)運載體SGLT-1和GLUT-2的表達(dá)量[32]，而成年綿羊腸腔葡萄糖濃度低，腸道上皮細(xì)胞絨毛頂端的SGLT1的表達(dá)量就相對較低，但經(jīng)30 mmol/L的葡萄糖(≈5 g/L)灌注后，SGLT1表達(dá)量在短時間內(nèi)即可恢復(fù)并使葡萄糖轉(zhuǎn)運能力提高[33]，與本試驗HS組回腸以及空腸SGLT1基因表達(dá)量上調(diào)相一致。本試驗?zāi)c道內(nèi)容物葡萄糖濃度(0.13 g/L)可能是因為采樣時間點無法與腸道消化時間點吻合，所測定的腸道內(nèi)容物葡萄糖濃度低。十二指腸中SGLT1、GLUT2基因表達(dá)量無顯著差異可能是因為流通速度過快，也可能是因為采樣時間點無法與胃排空時間點吻合。文獻(xiàn)報道稱，T1R2/T1R3表達(dá)量與SGLT1和GLUT2的表達(dá)量是顯著相關(guān)[16]，這與本研究中腸道基因表達(dá)量的結(jié)果是基本一致的。高淀粉飼糧對甜味受體表達(dá)的影響可能是進(jìn)入腸腔內(nèi)的葡萄糖被甜味受體感應(yīng)，通過甜味受體的信號傳導(dǎo)通路來活化細(xì)胞，促使腸道激素的分泌，提高SGLT1基因表達(dá)[7]，這也是為何前期研究中顯示在飼糧中添加人工甜味劑能提高SGLT1的表達(dá)[7]。另外，甜味受體作為葡萄糖的感受器而調(diào)控葡萄糖平衡，高葡萄糖濃度逆向下調(diào)甜味受體基因表達(dá)，機(jī)體可能通過感受腸腔的葡萄糖濃度來上調(diào)或下調(diào)甜味受體基因表達(dá)，調(diào)控腸道激素如GLP-1、GLP-2和GIP等的分泌，進(jìn)而影響SGLT1和GLUT2的表達(dá)[6]。

4 結(jié) 論

本試驗條件下，高淀粉飼糧對成年山羊腸道甜味受體T1R2/T1R3及其關(guān)鍵通路元件TRPM5、葡萄糖轉(zhuǎn)運載體(SGLT1、GLUT2)的基因表達(dá)量以及回腸激素濃度均無顯著影響，但顯著降低空腸α-gustducin基因表達(dá)量；關(guān)聯(lián)性分析顯示，飼糧淀粉攝入量與腸道甜味受體、相關(guān)通路元件以及轉(zhuǎn)運載體基因表達(dá)量呈正相關(guān)，而CP、ADF和DNF攝入量與其呈負(fù)相關(guān)。綜上所述，淀粉是甜味信號通路元件以及葡萄糖轉(zhuǎn)運載體的主要影響因素，但高淀粉飼糧對發(fā)育成熟的山羊腸道黏膜結(jié)構(gòu)及功能影響較小。