被膜態(tài)與浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39對(duì)比格犬血清免疫指標(biāo)及腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

陳則東 郭書玉 朱建平 李子晗 盧 煒* 劉 蕾*

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院寵物科技學(xué)院，泰州 2225300；2.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，成都 2610039)

益生菌是一類在適當(dāng)劑量下可以對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生有利作用的活的微生物。益生菌產(chǎn)品的使用在提高動(dòng)物生產(chǎn)性能及預(yù)防、治療動(dòng)物疾病方面發(fā)揮了重要作用。在實(shí)踐中，益生菌主要通過口服方式進(jìn)入動(dòng)物的胃腸道，在進(jìn)入動(dòng)物胃腸道過程中常常受到包括低pH、膽鹽、共生菌、致病菌競(jìng)爭(zhēng)等不利因素的影響，導(dǎo)致有效活菌數(shù)量下降[1]。進(jìn)一步提高益生菌的口服利用度、提升腸道定植成功率是益生菌利用研究的關(guān)鍵。被多糖蛋白復(fù)合物包裹的生物被膜態(tài)細(xì)菌，顯示出比浮游態(tài)細(xì)菌更好的腸上皮細(xì)胞黏附性能[2]及對(duì)酸、膽鹽等不利環(huán)境因素的耐受能力[3]，通過胃腸道后的存活率與荷載量大大提高[4]，為益生菌開發(fā)提供了新的思路。生物被膜成分包括細(xì)胞外DNA、蛋白質(zhì)、多糖和脂類等物質(zhì)[5]，與機(jī)體免疫、細(xì)菌黏附、定植、群體行為等密切相關(guān)，具有浮游狀態(tài)不可比擬的優(yōu)勢(shì)[6]。研究表明，用黏附在生物相容性葡聚糖微球上的被膜態(tài)羅伊氏乳桿菌預(yù)防壞死性結(jié)腸炎，單次預(yù)防劑量給藥可使疾病的發(fā)生率降低50%，顯示出生物被膜態(tài)益生菌開發(fā)利用的光明前景[7]。此外，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)被膜成分的胞外多糖可以拮抗致病菌對(duì)細(xì)胞的黏附，抑制致病菌生物被膜形成，發(fā)揮調(diào)節(jié)宿主免疫及腸道菌群結(jié)構(gòu)的功能[8]。然而，目前關(guān)于被膜態(tài)益生菌對(duì)宿主免疫功能及腸道菌群結(jié)構(gòu)的研究尚極其匱乏，亟待深化研究。因此，本研究旨在比較被膜態(tài)與浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39的耐酸和耐膽鹽能力及其對(duì)比格犬血清免疫指標(biāo)及腸道菌群結(jié)構(gòu)影響的差異，并進(jìn)一步通過相關(guān)性分析揭示腸道菌群結(jié)構(gòu)與免疫因子之間的關(guān)聯(lián)，為揭示被膜態(tài)益生菌的調(diào)節(jié)作用研究提供參考，并為動(dòng)物用新型益生菌制劑的研發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

15只比格犬，3.5月齡，由揚(yáng)州四方實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，籠養(yǎng)于江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，自由飲水，早晚各采食比瑞吉品牌全價(jià)小型犬幼年期犬糧1次。

1.1.2 試驗(yàn)菌種

植物乳桿菌LR-39，保存在中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection，CICC)，保藏編號(hào)為CICC No.24811，其全基因組序列已提交至GenBank，登錄號(hào)為VRKS00000000。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒均購(gòu)自武漢默沙克生物科技有限公司，具體貨號(hào)如下：免疫球蛋白G(IgG)ELISA Kit(No.69-58623)、分泌型免疫球蛋白A(sIgA)ELISA Kit(No.69-71642)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)ELISA Kit(No.69-52361)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA Kit(No.69-22538)。Qiagen糞便腸道微生物DNA提取試劑盒購(gòu)自杭州沃森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：QlAamp DNA Stool Mini Kit(No.51604)。

1.1.4 試驗(yàn)儀器

多功能酶標(biāo)儀(Thermo公司，型號(hào)：VARIOSKAN LUX)、超低溫冰箱(Thermo公司，型號(hào)：905)、純水系統(tǒng)(Millipore公司，型號(hào)：Milli-Q Direct 8)、低溫離心機(jī)(湘儀離心機(jī)有限公司，型號(hào)：H1650R)、超低溫冷凍干燥機(jī)(上海田楓實(shí)業(yè)有限公司，型號(hào)：TF-FD-1L壓蓋型)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 被膜態(tài)與浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39制備

被膜態(tài)植物乳桿菌LR-39制備：將活化的植物乳桿菌LR-39按1∶100比例接種于MRS液體培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃靜置培養(yǎng)36 h，5 000 r/min離心10 min收集菌體，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌3次，凍干保護(hù)劑重懸菌體至終濃度1×109CFU/mL，分裝至西林瓶。-80 ℃冰箱內(nèi)預(yù)凍10 h后，置于真空冷凍干燥機(jī)中，-40 ℃、40 MPa冷凍干燥24 h，制備得凍干菌粉，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39制備：將活化的植物乳桿菌LR-39按1∶100比例接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)36 h，5 000 r/min離心10 min收集菌體，PBS洗滌3次，凍干保護(hù)劑重懸菌體至終濃度1×109CFU/mL，分裝至西林瓶。-80 ℃冰箱內(nèi)預(yù)凍10 h后，置于真空冷凍干燥機(jī)中，-40 ℃、40 MPa冷凍干燥24 h，制備得凍干菌粉，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.2.2 被膜態(tài)與浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39耐酸及耐膽鹽能力評(píng)價(jià)

制備浮游態(tài)和被膜態(tài)植物乳桿菌LR-39，將收集到的菌體分別重懸于pH為2.5的MRS培養(yǎng)基中，處理1 h，以測(cè)定被膜態(tài)與浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39的耐酸能力；將被膜態(tài)與浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39菌體分別重懸于膽鹽含量為0.2%(質(zhì)量體積比)的MRS培養(yǎng)基中，處理0.5 h，以測(cè)定菌株的耐膽鹽能力。處理結(jié)束后通過平板計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)。試驗(yàn)每組3個(gè)平行，且進(jìn)行5次生物學(xué)重復(fù)。存活率計(jì)算公式如下：

存活率(%)=100×處理后活菌數(shù)/初始活菌數(shù)。

1.2.3 動(dòng)物分組與處理

15只比格犬隨機(jī)分為被膜組、浮游組和對(duì)照組3個(gè)組，每組5只。被膜組、浮游組于每日早上采食犬糧后分別灌飼被膜態(tài)與浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39菌液1 mL(1×109CFU/mL)，對(duì)照組灌飼等體積PBS，連續(xù)灌飼28 d。

1.2.4 血清免疫指標(biāo)檢測(cè)

試驗(yàn)進(jìn)行28 d后，經(jīng)前肢靜脈采集各組試驗(yàn)犬的血液制備血清。依據(jù)ELISA試劑盒說明書測(cè)定血清IgG、sIgA、IL-6、TNF-α含量。

1.3 腸道菌群微生物多樣性分析

1.3.1 腸道菌群16S rDNA測(cè)序

試驗(yàn)結(jié)束后，無菌采集犬新鮮糞便，按照Qiagen糞便腸道微生物DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行總DNA提取。取質(zhì)量合格的基因組DNA樣品30 ng及對(duì)應(yīng)的融合引物配制PCR反應(yīng)體系，設(shè)置PCR反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用Agencourt AMPure XP磁珠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并溶于洗脫緩沖液，貼上標(biāo)簽，完成建庫(kù)。

使用Agilent 2100 Bioanalyzer對(duì)文庫(kù)的片段范圍及濃度進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)合格的文庫(kù)根據(jù)插入片段大小，選擇HiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，得到原始數(shù)據(jù)。

1.3.2 生物信息學(xué)分析

對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾、Tags拼接、操作分類單元(OTUs)聚類，并與GreenGene數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)、物種注釋；基于OTUs和注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種復(fù)雜度分析、組間物種差異分析以及關(guān)聯(lián)分析等。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。血清免疫指標(biāo)的比較進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD法檢驗(yàn)；耐酸、耐鹽能力比較進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；腸道菌群指標(biāo)的比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)；腸道菌群指標(biāo)與血清免疫指標(biāo)的相關(guān)性用Spearman相關(guān)系數(shù)表示。0.05≤P<0.10表示有顯著趨勢(shì)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 被膜態(tài)與浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39的耐酸及耐膽鹽能力

菌株經(jīng)口服攝入會(huì)通過消化道環(huán)境，胃腸道中的酸性及膽鹽環(huán)境會(huì)對(duì)菌株形成壓力。因此，菌株耐受胃腸道不良環(huán)境的拮抗能力對(duì)于菌株保持活性非常重要。本研究對(duì)植物乳桿菌LR-39在被膜態(tài)及浮游態(tài)2種狀態(tài)下的耐酸和耐膽鹽能力進(jìn)行了比較分析。如圖1所示，被膜態(tài)植物乳桿菌LR-39經(jīng)酸性和膽鹽環(huán)境處理后，其存活率顯著或極顯著高于浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39(P<0.05或P<0.01)。以上結(jié)果表明，被膜態(tài)植物乳桿菌LR-39具有更強(qiáng)的抗環(huán)境脅迫能力。

PT：浮游組；BF：被膜組。*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。

2.2 被膜態(tài)與浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39對(duì)犬血清免疫指標(biāo)的影響

由表1可知，與對(duì)照組相比，被膜組血清IgG和sIgA含量極顯著提高(P<0.01)；與浮游組相比，被膜組血清sIgA含量極顯著提高(P<0.01)，血清IL-6含量有下降趨勢(shì)(0.05≤P<0.10)；與對(duì)照組相比，浮游組血清IgG、sIgA、IL-6、TNF-α含量無顯著差異(P>0.05)。以上結(jié)果表明，被膜態(tài)與浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39對(duì)犬的免疫激活效果不同，被膜態(tài)植物乳桿菌LR-39能夠提高犬血清IgG、sIgA含量，并降低炎性因子IL-6含量；而浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39對(duì)犬的血清免疫指標(biāo)則無顯著影響。

表1 各組血清免疫指標(biāo)的比較

2.3 被膜態(tài)與浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39對(duì)犬腸道菌群的影響

2.3.1 被膜態(tài)與浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39對(duì)犬腸道菌群總體結(jié)構(gòu)的影響

通過Illumina HiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序后以相似度在97%的以上的Tags聚類劃分OTUs，結(jié)果見圖2-A。由圖可知，各組OTUs數(shù)量從高到低依次為浮游組(256個(gè))、被膜組(252個(gè))、對(duì)照組(249個(gè))，3組共有OTUs數(shù)量為227個(gè)。稀釋曲線如圖2-B所示，隨著測(cè)序深度增加，各樣本物種數(shù)量趨于飽和。

CL：對(duì)照組；PT：浮游組；BF：被膜組。下圖同。

α多樣性是對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性的分析，包括Observed species指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)等[9]。Observed species指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)反映樣品中菌群的豐富度(species richness)，即簡(jiǎn)單指菌群中物種的數(shù)量。與對(duì)照組相比，灌飼浮游態(tài)與被膜態(tài)植物乳桿菌LR-39，均能提高樣本物種數(shù)量(圖3-A、圖3-B、圖3-C)。Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)反映菌群的多樣性(species diversity)，Shannon指數(shù)越大說明菌群的多樣性越高，Simpson指數(shù)越大說明菌群的多樣性越低。灌飼被膜態(tài)植物乳桿菌LR-39能夠提高菌群的多樣性，而灌飼浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39則降低菌群多樣性(圖3-D、圖3-E)。覆蓋度反映了樣品文庫(kù)的覆蓋率，該數(shù)值越高，樣品中序列沒有被測(cè)出來的概率越低。各組測(cè)序覆蓋度均達(dá)到99%以上(圖3-F)，表明本試驗(yàn)16S rDNA測(cè)序量可以滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析。

圖3 被膜態(tài)與浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39對(duì)犬腸道菌群α多樣性的影響

β多樣性分析是用來比較樣品間多樣性方面存在的差異大小[10-12]。主坐標(biāo)分析(PCoA)可用來研究樣本菌群組成的相似性或相異性。PCo1和PCo2的主要貢獻(xiàn)率分別為43.71%、16.71%，3組樣本在PCo1有明顯聚類現(xiàn)象(圖4)。以上結(jié)果表明，被膜態(tài)與浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39均能夠改變宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)，且2種生物狀態(tài)的益生菌對(duì)菌群結(jié)構(gòu)的影響也明顯不同。

圖4 被膜態(tài)與浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39

2.3.2 被膜態(tài)與浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39對(duì)犬腸道菌群相對(duì)豐度的影響

主要菌門相對(duì)豐度比較見圖5，列代表分組，行代表菌門，顏色塊代表細(xì)菌相對(duì)豐度，顏色越紫代表細(xì)菌的相對(duì)豐度越高，顏色越紅代表細(xì)菌的相對(duì)豐度越低。在門水平，3組樣本都包含5個(gè)門，分別是變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、梭桿菌門(Fusobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)。被膜組腸道Firmicutes相對(duì)豐度較浮游組、對(duì)照組提高；浮游組腸道Bacteroidetes、Fusobacteria相對(duì)豐度較被膜組、對(duì)照組提高。

Other：其他；Proteobacteria：變形菌門；Actinobacteria：放線菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Fusobacteria：梭桿菌；Firmicutes：厚壁菌門。

由圖6可見，各組樣本菌群共鑒定出37個(gè)屬，與對(duì)照組相比，浮游組乳桿菌屬(Lactobacillus)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、普雷沃菌屬(Prevotella)、薩特氏菌屬(Sutterella)相對(duì)豐度提高，其他菌屬相對(duì)豐度降低或無明顯變化；被膜組Lactobacillus、Allobaculum、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、韋榮氏球菌屬(Veillonella)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、丁酸球菌屬(Butyricicoccus)、戴阿利斯特桿菌屬(dialiste)等相對(duì)豐度提高。以上結(jié)果表明，浮游態(tài)與被膜態(tài)植物乳桿菌LR-39對(duì)犬腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響存在差異。

Faecalibacterium：糞桿菌屬；Adlercreutzia：安德克氏菌屬；Coprococcus：糞球菌屬；Eubacterium：真桿菌屬；Bulleidia：布雷德菌屬；Cetobacterium：醋酸桿菌屬；Clostridium：芽胞梭菌屬；Slackia：斯萊克氏菌屬；Blautia：勞特氏菌屬；Catenibacterium：鏈型桿菌屬；Collinsella：柯林斯氏菌屬；Turicibacter：彎曲菌屬；Streptococcus：鏈球菌屬；Butyricicoccus：丁酸球菌屬；Peptococcus：消化球菌屬；Dialister：戴阿利斯特桿菌屬；Bifidobacterium：雙歧桿菌屬；Gemmiger：吉米菌屬；Escherichia：埃希氏桿菌屬；Enterococcus：腸球菌屬；Megamonas：巨單胞菌屬；Ruminococcus：瘤胃球菌屬；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；Other：未分類；Lactobacillus：乳桿菌屬；Peptostreptococcus：消化鏈球菌屬；Vellonella：韋榮球菌屬；Fusobacterium：梭桿菌屬；Sutterella：薩特氏菌屬；Anaerovibrio：厭氧弧菌屬；Prevotella：普雷沃菌屬；Parabacteroides：副擬桿菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；Oscillospira：顫螺菌屬；Anaerobiospirillum：厭氧螺菌屬。

2.4 不同組別腸道菌群特征微生物分析

為了找出各組間具有差異的生物標(biāo)志物(biomarker)，通過非參數(shù)因子Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)進(jìn)行LEfSe分析，結(jié)果見圖7。由圖可以看出，被膜組顯著作用微生物類群包括桿菌綱(Bacilli)、乳桿菌目(Lactobacillales)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)、Lactobacillus、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)；浮游組顯著作用微生物類群包括Fusobacterium；對(duì)照組顯著作用微生物類群包括α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、柯林斯氏菌屬(Collinsella)、鏈型桿菌屬(Catenibacterium)、真桿菌屬(Eubacterium)。以上結(jié)果表明，與浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39相比，被膜態(tài)植物乳桿菌LR-39能夠增加犬腸道的Lactobacillus相對(duì)豐度。

Fusobacterium：梭桿菌屬；Alphaproteobacteria：α-變形菌綱；Collinsella：柯林斯氏菌屬；Catenibacterium：鏈型桿菌屬；Eubacterium：真桿菌屬；Bacilli：桿菌綱；Lactobacillales：乳桿菌目；Lactobacillaceae：乳桿菌科；Lactobacillus：乳桿菌屬；Ruminococcaceae：瘤胃菌科。

2.5 腸道菌屬與血清免疫指標(biāo)的相關(guān)性分析

為進(jìn)一步分析犬血清免疫指標(biāo)的變化是否與腸道菌群結(jié)構(gòu)變化相關(guān)，根據(jù)LEfSE分析結(jié)果，開展差異菌屬與血清免疫指標(biāo)之間的Spearman相關(guān)性分析。由表2可知，血清IgG、sIgA、IL-6、TNF-α含量與腸道富集菌群相對(duì)豐度不存在顯著的相關(guān)性(P>0.05)。以上結(jié)果提示，被膜組血清IgG、sIgA、IL-6含量變化可能與植物乳桿菌LR-39的生物被膜成分有關(guān)。

表2 腸道菌屬與血清免疫指標(biāo)的Spearman秩相關(guān)系數(shù)

3 討 論

益生菌經(jīng)口服進(jìn)入宿主體內(nèi)，會(huì)遭遇胃腸道不良環(huán)境的脅迫，例如胃酸和膽鹽。酸脅迫是指低pH對(duì)菌體生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生的不利影響，它會(huì)引起菌體胞內(nèi)pH下降，導(dǎo)致碳水化合物代謝途徑中的某些酸敏感酶活性喪失，從而影響能量供給；酸脅迫還會(huì)對(duì)細(xì)胞膜和某些大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成損傷[13]。膽鹽脅迫對(duì)細(xì)菌最直接的危害是破壞細(xì)胞膜。低濃度的膽鹽能夠改變細(xì)胞膜的通透性和流動(dòng)性，引起某些膜鑲嵌酶類的失活和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)子的功能紊亂，還能改變細(xì)胞表面疏水性和電勢(shì)等表面特性；而高濃度的膽鹽可以迅速解離細(xì)胞質(zhì)膜和膜蛋白，造成細(xì)胞質(zhì)組分外泄，導(dǎo)致菌體死亡[14]。因此，耐酸和膽鹽能力是評(píng)價(jià)益生菌性能非常重要的參數(shù)之一。本研究結(jié)果表明，被膜態(tài)植物乳桿菌LR-39的耐酸和耐膽鹽能力均顯著強(qiáng)于浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39。這可能是由于生物被膜中的胞外多聚物將菌體包裹其中，使菌體生存環(huán)境與低pH和膽鹽脅迫環(huán)境隔離開來，削弱二者對(duì)菌體細(xì)胞膜的直接破壞作用。此外，生物被膜中菌體形成立體的三維結(jié)構(gòu)，其中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、滲透壓及pH形成梯度，這可以對(duì)低pH和膽鹽環(huán)境起到緩沖作用，提高菌體存活率。

本研究表明，不同生物狀態(tài)的植物乳桿菌LR-39對(duì)犬的免疫影響存在差異。被膜態(tài)植物乳桿LR-39能夠提高犬血清IgG、sIgA含量，降低血清IL-6、TNF-α含量，而浮游態(tài)植物乳桿LR-39則對(duì)上述免疫指標(biāo)無顯著影響。這種差異可能與腸道菌群結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，然而通過Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，腸道優(yōu)勢(shì)菌屬與免疫指標(biāo)并不存在顯著相關(guān)性，提示血清IgG、sIgA、IL-6、TNF-α含量變化與腸道菌群結(jié)構(gòu)變化無明顯關(guān)聯(lián)性。Secor等[15]和Brady等[16]認(rèn)為在生物膜群落中生長(zhǎng)的細(xì)菌分泌細(xì)胞外基質(zhì)，被膜態(tài)細(xì)菌在結(jié)構(gòu)、代謝活性、表型等方面不同于浮游態(tài)細(xì)菌，推測(cè)可能會(huì)導(dǎo)致不同的免疫反應(yīng)。構(gòu)建雞沙門氏菌生物被膜合成相關(guān)基因缺失株導(dǎo)致免疫產(chǎn)生的IgG含量極顯著降低[17]，被膜態(tài)嗜水氣單胞菌口服免疫小鼠產(chǎn)生的抗體水平顯著高于浮游態(tài)[18]，被膜態(tài)金黃色葡萄球菌ATCC 25923及無枝菌酸棒狀桿菌(C.amycolatum)ATCC 700207分別刺激Jurkat細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)p70、IL-6、TNF-α及抗炎因子白細(xì)胞介素-10(IL-10)含量均低于浮游態(tài)[19]，以上試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步印證了上述觀點(diǎn)。此外，被膜態(tài)植物乳桿菌LR-39更強(qiáng)的耐酸、耐膽鹽等抗環(huán)境脅迫能力導(dǎo)致其在腸道有效定植率提升，也可能是不同生物狀態(tài)植物乳桿菌LR-39對(duì)犬產(chǎn)生不同免疫影響的原因。然而，被膜態(tài)與浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39對(duì)機(jī)體免疫影響差異的具體原因還有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，植物乳桿菌LR-39的不同生物狀態(tài)對(duì)犬的腸道菌群結(jié)構(gòu)調(diào)整影響不同。灌喂被膜態(tài)植物乳桿菌LR-39后，腸道Lactobacillus相對(duì)豐度提高，成為腸道顯著作用微生物菌群；而灌喂浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39卻導(dǎo)致Fusobacterium成為腸道顯著作用微生物菌群。Secor等[15]和Brady等[16]對(duì)浮游態(tài)的致病菌常導(dǎo)致急性感染而被膜態(tài)的致病菌常導(dǎo)致慢性感染的原因進(jìn)行分析，認(rèn)為被膜態(tài)細(xì)菌處于生物被膜的內(nèi)部并向外部緩慢釋放游離菌，而游離態(tài)細(xì)菌則不具備此種優(yōu)勢(shì)。此外，本研究團(tuán)隊(duì)在該研究及過往研究[3]中分別比較了被膜態(tài)與浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39和L-ZS9的抗環(huán)境脅迫能力、黏附性能，均顯示被膜態(tài)抗環(huán)境脅迫能力及黏附率顯著高于浮游態(tài)。綜上所述，緩慢釋放被膜態(tài)內(nèi)部的游離菌及更高效率在腸道定植可能是導(dǎo)致飼喂被膜態(tài)植物乳桿菌LR-39能夠使Lactobacillus成為腸道優(yōu)勢(shì)菌屬的原因。

4 結(jié) 論

①被膜態(tài)植物乳桿菌LR-39具有更強(qiáng)的耐酸及膽鹽能力，能夠提高血清IgG和sIgA含量，降低血清IL-6含量；而浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39對(duì)血清免疫指標(biāo)無顯著影響。

②被膜態(tài)植物乳桿菌LR-39主要提高腸道Lactobacillus相對(duì)豐度，而浮游態(tài)植物乳桿菌LR-39則主要提高腸道Fusobacterium相對(duì)豐度。

③腸道優(yōu)勢(shì)菌屬與血清免疫指標(biāo)無顯著相關(guān)性。

致謝：

感謝江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院寵物科技學(xué)院陸江教師、動(dòng)物醫(yī)學(xué)院胡新崗教授對(duì)文稿所提的寶貴意見。