添加乳酸菌和纖維素酶對豆渣與桑葉混貯品質(zhì)及體外瘤胃發(fā)酵特性的影響

趙 超 馬廣明 呂靜怡 姜 鑫 張永根

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 2150030)

豆渣(soybean residue，SR)是豆腐、豆?jié){、腐乳等豆制品加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品，在我國產(chǎn)量極為豐富，且非纖維碳水化合物和蛋白質(zhì)含量高，因而具有很高的營養(yǎng)價(jià)值[1]。然而由于新鮮SR含水量大，導(dǎo)致其很難長期保存，因而限制了其在動物飼糧中的應(yīng)用[2]。目前，青貯發(fā)酵是對含水量較高飼料進(jìn)行長期保存的一種經(jīng)濟(jì)有效的方式，這種方式不僅可以緩解廢物處理問題，還可以提高動物飼料的利用[3]。但飼料含水量過高，導(dǎo)致青貯過程中不良微生物大量繁殖，進(jìn)而影響飼料的發(fā)酵品質(zhì)[4]。由于SR的含水量過高(大于80%)，因而在青貯發(fā)酵時(shí)需將其與一些干物質(zhì)(DM)含量較高的非常規(guī)飼料混合，以調(diào)整水分含量，進(jìn)而達(dá)到最佳青貯條件。桑葉(mulberry leaf，ML)作為一種非常規(guī)飼料資源，在我國產(chǎn)量極為豐富[5]，目前主要是將新鮮ML曬干、磨碎制成桑葉粉后用于動物飼料中，這種方式簡單、方便、易操作。然而，ML高粗纖維含量和一些抗?fàn)I養(yǎng)因子能抑制動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[6]，從而限制其在動物飼喂中的應(yīng)用。因此，將SR與ML進(jìn)行混合青貯，既可以調(diào)整水分含量，延長保存時(shí)間，還可以改善飼料的營養(yǎng)價(jià)值，這對于提高我國飼料資源利用具有重要意義。

微生物青貯技術(shù)可以抑制不良微生物生長、延長貯存時(shí)間并減少氨態(tài)氮(NH3-N)的產(chǎn)生[7]。崔彥召[8]研究表明，添加乳酸菌(LAB)不僅可以有效地改善發(fā)酵全混合日糧青貯的發(fā)酵品質(zhì)和風(fēng)味，還能夠有效降低其霉菌毒素的含量，從而提高發(fā)酵全混合日糧青貯的營養(yǎng)價(jià)值和飼喂安全性。王昆昆等[9]發(fā)現(xiàn)添加LAB可以降低不同比例苜蓿和披堿草混貯的NH3-N含量，提高水溶性碳水化合物(WSC)含量，從而提高其發(fā)酵品質(zhì)。纖維素酶(cellulose，CE)是一種復(fù)合酶，可增加發(fā)酵糖的供應(yīng)量，為LAB快速繁殖提供底物，加速pH降低，從而進(jìn)一步提高青貯發(fā)酵品質(zhì)。李春霞[10]發(fā)現(xiàn)在甘蔗梢青貯中添加纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶均能降低中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量，提高糖的生成量，進(jìn)而大幅改善青貯發(fā)酵品質(zhì)。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)將紫花苜蓿與全株玉米混合青貯可降低不良微生物數(shù)量，提高發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性。

然而，目前有關(guān)LAB與CE的組合添加對SR和ML混貯發(fā)酵品質(zhì)的影響鮮有報(bào)道，需進(jìn)一步研究。為此，本試驗(yàn)評價(jià)了LAB和CE添加對SR與ML混合青貯發(fā)酵品質(zhì)及體外瘤胃發(fā)酵特性的影響，以期為SR和ML的合理飼用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 青貯飼料調(diào)制和樣品采集

1.1.1 試驗(yàn)材料

混貯原料：試驗(yàn)所用SR和ML均購自哈爾濱某股份有限公司。復(fù)合乳酸菌劑：由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)反芻動物營養(yǎng)研究所提供。CE：10 000 U/g，購于哈爾濱某生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 青貯飼料調(diào)制

將SC與ML按比例在玻璃盆中混合均勻，以鮮重為基礎(chǔ)，調(diào)整含水量為65%。試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)組，分別為對照組(CON組)、LAB組、CE組及LAB+CE組，每組3個(gè)重復(fù)，其中LAB和CE添加量分別為1×106CFU/g和100 U/g。各組中各添加劑均充分溶解在10 mL蒸餾水中，隨后用微型噴霧器噴灑在2 kg混合青貯上，CON組只噴灑10 mL蒸餾水。混合均勻后，將飼料放入聚乙烯袋(40 cm×50 cm)中，并用食品真空封口機(jī)密封，置于室溫(28±3) ℃下進(jìn)行8周青貯發(fā)酵。

1.2 樣品分析

1.2.1 微生物分析

發(fā)酵完成后取出樣品，采用平板計(jì)數(shù)法對混合青貯飼料進(jìn)行微生物分析[12]。首先，取樣品10 g加入90 mL滅菌生理鹽水中進(jìn)行提取。其次，將提取液稀釋為9個(gè)梯度(10-1～10-9)，并選取3個(gè)最適稀釋倍數(shù)進(jìn)行細(xì)菌群落計(jì)數(shù)。最后，取不同濃度的稀釋液100 μL在MRS瓊脂培養(yǎng)基和紫紅色膽汁(VRB)瓊脂培養(yǎng)基上均勻涂布，然后置于厭氧培養(yǎng)盒中30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后進(jìn)行LAB計(jì)數(shù)。與上述操作方法一致，分別通過孟加拉紅培養(yǎng)基(Rose Bengal agar)和PDA瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)后進(jìn)行酵母菌和霉菌計(jì)數(shù)(在28 ℃下培養(yǎng)72 h)。

1.2.2 發(fā)酵品質(zhì)分析

取20 g樣品置于180 mL蒸餾水中勻漿1 min，經(jīng)4層紗布過濾，制得青貯飼料并在4 ℃下保存過夜，然后用定性濾紙過濾。所得濾液立即用Sartorius PB-10型pH測定儀測定pH。濾液在4 ℃，12 000×g條件下離心10 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾后，用高效液相色譜儀(Waters-600，日本)進(jìn)行乳酸(LA)含量測定。采用氣相色譜儀(島津GC-2010，日本)分析濾液中乙酸(AA)含量。NH3-N含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法進(jìn)行測定[13]。

1.2.3 化學(xué)成分分析

將取出的樣品置于65 ℃烘箱中干燥48 h，然后用研磨機(jī)研磨過1 mm篩網(wǎng)。根據(jù)AOAC(1990)中描述的方法，測定樣品DM含量，并計(jì)算干物質(zhì)回收率(DMR)。使用凱氏定氮儀(Foss，2300自動分析儀，瑞典)測定樣品粗蛋白質(zhì)(CP)含量[14]。按照Van Soest等[15]所描述的方法，采用纖維分析儀(ANKOM)測定樣品NDF和ADF含量。WSC含量采用3，5-二硝基水楊酸比色法進(jìn)行測定[16]。鈣(Ca)和磷(P)含量分別參考國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 27085—2009(高錳酸鉀法)和GOST R 50852—1996(磷釩鉬酸比色法)進(jìn)行測定。

1.3 體外發(fā)酵

稱取0.5 g樣品放入經(jīng)105 ℃烘干2 h恒重后的F75(北京正方興達(dá)科技有限公司)濾袋中并進(jìn)行封口。然后在早上飼喂前，從3頭裝有永久性瘤胃瘺管的奶牛瘤胃中收集新鮮瘤胃液(奶?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1)，并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，整個(gè)過程中瘤胃液一直處于39 ℃下厭氧保存。根據(jù)Menke等[17]的報(bào)道配制緩沖溶液，并將飽和的二氧化碳(CO2)通入配制好的緩沖液中直至緩沖液呈無色透明，此期間緩沖液一直置于39 ℃水浴鍋中。隨后將緩沖液與瘤胃液按2∶1的比例混合均勻，配制發(fā)酵液。將裝有樣品的濾袋與30 mL發(fā)酵液放入對應(yīng)編號的發(fā)酵瓶中，通入CO2后擰緊瓶蓋，并在蓋口涂抹少許石蠟，以防出現(xiàn)漏氣的情況。將產(chǎn)氣記錄裝置(Cerabar T PMP131)和Alltech公司記錄系統(tǒng)相連接，以準(zhǔn)確記錄產(chǎn)氣量。發(fā)酵瓶在39 ℃條件下連續(xù)培養(yǎng)48 h，且每個(gè)樣品5個(gè)重復(fù)并設(shè)置3個(gè)空白，并在0、2、4、8、12、16、24、36和48 h時(shí)記錄產(chǎn)氣數(shù)值。體外發(fā)酵結(jié)束后，立即使用pH測定儀測定發(fā)酵液pH，隨后取20 mL發(fā)酵液平均分裝于2個(gè)15 mL離心管中，并分別加入2 mL 25%的偏磷酸，充分混勻后置于-20 ℃保存，直至用于揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和NH3-N含量測定，測定方法與上述飼料測定相同[18]。將濾袋取出后立即沖洗至沖洗液清澈無味，隨后置于烘箱內(nèi)烘干(105 ℃，4 h)，恒重后稱重，用于測定干物質(zhì)回收率。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.4 產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣參數(shù)計(jì)算

發(fā)酵后產(chǎn)氣量計(jì)算公式如下：

GPt=(Vt-V0)/W。

式中：GPt指混貯后樣本在t時(shí)間共積累的產(chǎn)氣量(mL/g)；Vt為混貯后樣本在t時(shí)間段產(chǎn)氣量(mL/g)；V0為t時(shí)間段空白產(chǎn)氣量(mL/g)；W為發(fā)酵底物的質(zhì)量(g)。

產(chǎn)氣參數(shù)根據(jù)?rskov等[20]提出的產(chǎn)氣模型計(jì)算：

GP=a+b(1-exp-ct)。

式中：GP表示t時(shí)間點(diǎn)的累計(jì)產(chǎn)氣量(mL/g)；a表示快速產(chǎn)氣部分(mL/g)；b表示慢速產(chǎn)氣部分(mL/g)；c表示產(chǎn)氣速率(mL/h)。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SAS軟件包(Version 9.4)中的GLM程序進(jìn)行分析。采用Turkey’s作顯著性檢驗(yàn)，其中P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯原料化學(xué)組成

如表2所示，SR與ML的DM含量分別為16.52%和89.32%，且pH均大于6.0。SC中NDF和ADF含量均高于ML，但WSC含量較低，僅為2.5%。SR中檢測到LAB和酵母菌菌落數(shù)分別為2.31和2.54 lg(CFU/g)，但未檢測到霉菌。ML中霉菌和酵母菌菌落數(shù)分別為2.17和4.47 lg(CFU/g)，而SR和ML中大腸桿菌菌落數(shù)均低于檢測水平[<2.00 lg(CFU/g)]。

表2 混合青貯前SR和ML的營養(yǎng)組成及微生物群落數(shù)(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.2 青貯飼料化學(xué)成分分析

由表3可知，與CON組相比，CE組與LAB+CE組DM含量顯著提高(P<0.05)，而與LAB組相比無顯著差異(P>0.05)。LAB組、CE組及LAB+CE組CP含量較CON組分別提高16.45%、11.30%、19.60%(P<0.05)。與CON組相比，各試驗(yàn)組ADF含量顯著下降(P<0.05)，且CE組和LAB+CE組NDF含量顯著降低(P<0.05)，但LAB組NDF含量無顯著變化(P>0.05)。此外，各試驗(yàn)組間WSC含量差異并不顯著(P>0.05)，但均較CON組略微降低。

表3 LAB和CE對SR與ML混貯的化學(xué)成分的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.3 青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)分析

由表4可知，與CON組相比，LAB+CE組干物質(zhì)回收率顯著提高(P<0.05)，而LAB組和CE組間無顯著差異(P>0.05)。各試驗(yàn)組pH均較CON組顯著降低(P<0.05)，其中LAB+CE組達(dá)到最低，LAB組和LAB+CE組之間差異不顯著(P>0.05)。與CON組相比，LAB組和LAB+CE組NH3-N含量均顯著下降(P<0.05)，與CON組相比，各試驗(yàn)組乳酸含量均顯著提高(P<0.05)，且LAB+CE組達(dá)到最高。各試驗(yàn)組乙酸含量均顯著高于CON組(P<0.05)，且LAB+CE組達(dá)到最高。

表4 LAB和CE對SR與ML混貯的發(fā)酵品質(zhì)影響

2.4 青貯飼料微生物群落變化

由表5可知，混貯后CON組、LAB組、CE組、LAB+CE組的LAB菌落數(shù)分別為7.33、8.02、7.98和8.75 lg(CFU/g)。大腸桿菌菌落數(shù)除CON組為2.21 lg(CFU/g)外，其余各組均低于檢測水平[<2.00 lg(CFU/g)]。酵母菌菌落數(shù)在各試驗(yàn)組中均低于檢測水平[<2.00 lg(CFU/g)]，但在CON組中檢測值為3.04 lg(CFU/g)。LAB組和LAB+CE組均未檢測到霉菌，且CON組和CE組霉菌菌落數(shù)均低于檢測水平[<2.00 lg(CFU/g)]。

2.5 LAB和CE對SR與ML混貯體外發(fā)酵產(chǎn)氣量影響

由表5可知，隨發(fā)酵時(shí)間延長各組產(chǎn)氣量均呈現(xiàn)上升趨勢。與CON組相比，發(fā)酵2 h時(shí)LAB組產(chǎn)氣量顯著升高(P<0.05)，而其他組無顯著變化(P>0.05)。發(fā)酵4 h后，各試驗(yàn)組產(chǎn)氣量均較CON組升高，且LAB+CE組產(chǎn)氣量在各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于CON組(P<0.05)。與CON組相比，各試驗(yàn)組快速發(fā)酵部分產(chǎn)氣量(a)和慢速發(fā)酵部分產(chǎn)氣量(b)均較CON組顯著增加(P<0.05)，且LAB+CE組達(dá)到最高。除CE組外，其他各試驗(yàn)組潛在產(chǎn)氣量(a+b)均顯著高于CON組(P<0.05)，且LAB+CE組最高。此外，LAB組和CE組有效產(chǎn)氣速率(c)均較CON組顯著降低(P<0.05)，但LAB+CE組無顯著變化(P>0.05)。

表5 LAB和CE對SR與ML混貯的微生物群落影響

表6 LAB和CE對SR與ML混貯的產(chǎn)氣量及產(chǎn)氣參數(shù)的影響

2.6 LAB和CE對SR與ML混貯體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)影響

由表7可知，LAB組和CE組發(fā)酵液中乙酸、丙酸和丁酸含量均較CON組顯著升高(P<0.05)，但各試驗(yàn)間差異不顯著(P>0.05)。與CON組相比，各試驗(yàn)組發(fā)酵液中總揮發(fā)性脂肪酸含量顯著提高(P<0.05)，且LAB+CE組產(chǎn)量最高。各試驗(yàn)組乙酸/丙酸均較CON組顯著降低(P<0.05)，且LAB組達(dá)到最低。

表7 LAB和CE對SR與ML混貯體外瘤胃發(fā)酵特性的影響

3 討 論

3.1 LAB和CE對SR與ML混貯飼料化學(xué)組成的影響

本試驗(yàn)中，LAB組和LAB+CE組DM含量均較CON組顯著升高，原因可能是由于LAB在混貯過程中能產(chǎn)生更多的乳酸，從而導(dǎo)致pH快速降低，抑制不良微生物生長，進(jìn)而減小DM流失[21]。各試驗(yàn)組WSC含量均較CON組降低，原因可能是由于LAB在混貯發(fā)酵過程中會消耗大量的WSC，從而促進(jìn)LAB快速生長與繁殖，進(jìn)而促進(jìn)有機(jī)酸的產(chǎn)生。王力生等[22]研究指出添加微生物制劑能夠顯著降低筍殼青貯中WSC含量，與本研究結(jié)果一致。NDF和ADF是反映飼料中纖維質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)。由于ADF在動物體內(nèi)很難消化吸收，所以ADF含量越低，說明混貯發(fā)酵質(zhì)量越高[23]。本試驗(yàn)中，LAB+CE組中NDF和ADF含量較CON組顯著降低。一方面可能是由于CE添加促進(jìn)了SR和ML混貯中纖維的降解；另一方面可能是由于LAB在混貯發(fā)酵過程中會降解碳水化合物產(chǎn)生CO2，從而導(dǎo)致纖維含量降低。這與趙華等[24]試驗(yàn)結(jié)果相符。同時(shí)Mu等[25]指出，CE與LAB混合添加對高水分莧菜和稻草混合青貯的化學(xué)成分、細(xì)菌群落及有氧穩(wěn)定性均好于單一添加LAB。以上研究結(jié)果表明LAB和CE添加能夠提高SR和ML混貯的營養(yǎng)價(jià)值。

3.2 LAB和CE對SR與ML混貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響

在混貯發(fā)酵過程中，梭菌等不良微生物的存在會抑制LAB生長，促進(jìn)丁酸產(chǎn)生，引起乳酸發(fā)酵路線出現(xiàn)偏離，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解為NH3-N，進(jìn)而引起飼料營養(yǎng)流失[26]。本試驗(yàn)中，LAB+CE組NH3-N含量較CON組顯著降低，原因可能是添加CE能夠?qū)⒗w維降解為WSC，從而為LAB生長提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)乳酸產(chǎn)生，進(jìn)而抑制梭菌等不良微生物在混貯飼料中生長。此外，本研究中LAB組、CE組和LAB+CE組均為未檢測到丁酸也證實(shí)了這一假設(shè)。

pH是評價(jià)青貯發(fā)酵質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)，其變化取決于青貯DM、化學(xué)成分和青貯周期。Nishino等[27]研究發(fā)現(xiàn)添加LAB可顯著降低全混合日糧青貯的pH，從而提高其發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性。本試驗(yàn)中，各試驗(yàn)組間pH均低于4.00，原因可能是接種LAB增加了初始乳酸菌數(shù)量，從而促進(jìn)乳酸產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致pH下降[28]。Zhang等[29]試驗(yàn)結(jié)果表明添加干酪乳桿菌能夠降低羊草青貯的pH，這與本研究結(jié)果相似。同時(shí)，Liu等[30]評估了添加劑對全混合日糧青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)添加干酪乳桿菌和纖維素酶的全混合日糧青貯中乳酸含量達(dá)到3.8%(DM)，這與本試驗(yàn)中添加LAB和CE混貯產(chǎn)生的乳酸含量(4.12% DM)相近。Nishino等[31]在水分含量較高(85.5%)的豚草青貯飼料中觀察到較高的乙酸含量(5.64 g/kg DM)。與此不同，本研究中3個(gè)試驗(yàn)組的乙酸含量較低。這種差異可能是由于混貯飼料中的細(xì)菌群落來自不同的環(huán)境、自身特性或原料上的微生物數(shù)量不同所致[32]。然而，菌酶協(xié)同改善飼料混貯發(fā)酵品質(zhì)的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

一般來說，是否需要向青貯飼料中加入添加劑取決于附著在青貯飼料上的微生物數(shù)量和種類[33]。對于保存較好的混貯飼料，混貯時(shí)LAB的菌落數(shù)至少達(dá)到1×105CFU/g[34]。然而，在原料中觀察到SR的LAB菌落數(shù)僅為2.3 lg(CFU/g)。ML的LAB菌落數(shù)低于2.00 lg(CFU/g)，且不良微生物數(shù)量較高，這可能影響發(fā)酵品質(zhì)。為保證混貯飼料快速發(fā)酵并抑制有害微生物的生長，在青貯飼料發(fā)酵的早期階段，需要通過加入添加劑，如LAB或CE，提高LAB發(fā)酵能力，使其主導(dǎo)微生物發(fā)酵。

3.3 LAB和CE對SR與ML混貯體外瘤胃發(fā)酵特性的影響

混貯經(jīng)瘤胃微生物發(fā)酵后的產(chǎn)氣量是評價(jià)混貯可發(fā)酵程度的重要指標(biāo)，因?yàn)榛熨A后飼料產(chǎn)氣量與養(yǎng)分可消化程度呈正相關(guān)[35]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，LAB+CE組體外產(chǎn)氣量較對照組顯著升高，說明LAB和CE添加具有提高SR和ML混貯體外瘤胃消化率的潛力。一般來說，穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境是保證瘤胃功能正常的必要條件，而pH則是反映瘤胃內(nèi)部環(huán)境的主要指標(biāo)，當(dāng)pH不在正常范圍內(nèi)時(shí)，瘤胃微生物的活性就會受到影響[36]。本試驗(yàn)中，LAB+CE組和CE組發(fā)酵液pH顯著降低，但仍處于正常范圍內(nèi)，說明瘤胃發(fā)酵環(huán)境處于穩(wěn)定狀態(tài)，能促進(jìn)微生物的生長和代謝。本研究中瘤胃pH下降可能主要因?yàn)閂FA的產(chǎn)生，且隨著在混貯中添加LAB和CE，VFA含量顯著提高，進(jìn)而導(dǎo)致pH呈降低趨勢。LAB+CE組VFA含量增加的原因可能是由于LAB和CE添加促進(jìn)了混貯飼料中碳水化合物在瘤胃中的降解，進(jìn)而改善瘤胃發(fā)酵。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，LAB與CE組合添加可提高SR和ML混貯飼料乳酸和粗蛋白質(zhì)含量，降低NH3-N含量和pH，從而提高其營養(yǎng)價(jià)值。此外，SR和ML混貯中添加LAB和CE后其體外瘤胃發(fā)酵特性也得到改善。因此，LAB和CE混合添加可大幅改善SR和ML混貯品質(zhì)，使其具有應(yīng)用在奶牛生產(chǎn)中的潛力。