微流控腸道芯片研究進展

李英潔 張 琛 王 蕾 車煉強*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，成都 2611130；2.中國科學(xué)院過程工程研究所，生化工程國家重點實驗室，北京 2100089；3.山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 2250101)

動物試驗為營養(yǎng)與醫(yī)學(xué)研究做出了巨大貢獻。適宜的動物試驗?zāi)Ｐ?如壞死性腸炎仔豬模型、肥胖和糖尿病小鼠模型等)已被廣泛用于研究疾病發(fā)生機制及藥物或營養(yǎng)干預(yù)效果評估[1-2]，然而，體內(nèi)試驗受外部環(huán)境、個體差異、個體內(nèi)多器官復(fù)雜相互作用影響，只能在一定程度上反映試驗因素下動物的整體情況，不能反映試驗因素對特定器官的作用[3]。20世紀(jì)60年代，Russell等[4]提出針對動物試驗的“3Rs”原理，即“Replacement、Reduction、Refinement”：采用非生命體替代試驗動物、減少動物數(shù)量至最低限度、不斷改進動物試驗以提高動物福利，基于此涌現(xiàn)出了大量體外試驗?zāi)Ｐ?，如組織培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)及微流控技術(shù)等。

微流控芯片又稱芯片實驗室，是一種在微米尺度空間對流體進行操控的試驗技術(shù)，能將生物、化學(xué)等實驗室基本功能微縮到幾平方厘米的芯片上[5]；微流控技術(shù)具有高通量性、簡易性、快速性等優(yōu)勢，使其成為體外試驗中最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)。本文將基于微流控芯片平臺，綜述微流控腸道芯片技術(shù)的研究歷史與應(yīng)用進展。

1 微流控芯片的研究歷史

1990年，瑞士科學(xué)家Manz等[6]提出“小型化學(xué)平板芯片分析系統(tǒng)”概念，并命名為“微全分析系統(tǒng)(micro total analysis system，μTAS)”，微流控芯片即微全分析系統(tǒng)中的主要分支技術(shù)；1993年，Harrison等[7]采用微機械加工技術(shù)，研制出微流控芯片化學(xué)分析系統(tǒng)，此次改進為微流控芯片技術(shù)的長遠發(fā)展奠定了基礎(chǔ)；1994年，Verpoorte等[8]證實微流控芯片能夠?qū)崿F(xiàn)微全分析，并利用光刻膠技術(shù)對芯片構(gòu)造進行了改善。1995年，Woolley等[9]在微流控芯片上成功實現(xiàn)了準(zhǔn)確率高達97%的DNA測序，昭示了利用微流控芯片進行高速、高通量DNA測序的可行性；同年，集DNA分離、測序、PCR、受體結(jié)合、酶聯(lián)免疫分析于一體的微流控芯片研究成功，標(biāo)志著微流控技術(shù)可促進研究快速即時、檢驗自動化與集成化[10]。

我國微流控芯片研究始于1996年[11]。2003年，周小棉等[12]利用微流控芯片平臺完成SARS病毒基因反轉(zhuǎn)錄多重PCR檢測；龔海洋等[13]、洪承呂等[14]利用生物芯片技術(shù)進行營養(yǎng)代謝機理研究，分析營養(yǎng)與腫瘤相關(guān)基因、心腦血管疾病關(guān)系等；侯威[15]、侯宇等[16]分別基于仿生肺芯片技術(shù)闡明癌癥機理；汪萌等[17]則構(gòu)建起以微流控為基礎(chǔ)的輸卵管芯片，輔助研究受精和早期胚胎發(fā)育過程。

2 微流控腸道芯片

與其他試驗?zāi)Ｐ拖啾?，細胞模型在預(yù)測吸收、分泌和免疫功能等方面更為準(zhǔn)確，可為動物研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[18]。迄今為止，多種細胞已在芯片上成功建模，如人結(jié)腸癌細胞、人臍靜脈內(nèi)皮細胞、肝細胞和牛內(nèi)皮細胞等。腸道體外模型的構(gòu)建對深入探究營養(yǎng)吸收、腸道細胞與微生物間互作以及藥物代謝機制至關(guān)重要，與機體免疫和營養(yǎng)代謝密切相關(guān)的微流控腸道芯片，已成為當(dāng)前研究熱點和前沿。不同微流控腸道芯片的功能及優(yōu)缺點見表1。

2.1 微流控腸道芯片結(jié)構(gòu)

微流控腸道芯片利用僅幾立方厘米的體積即可實現(xiàn)細胞培養(yǎng)、試劑添加以及酸堿度、溫度等物化條件調(diào)節(jié)[23]。微流控腸道芯片主體由細胞操作部件和流體控制部件組成[5]，細胞操作部件包括試劑進樣、細胞培養(yǎng)單元；流體控制部件以多孔道蠕動泵為主，用于控制試劑在細胞培養(yǎng)部件間的流動。芯片結(jié)構(gòu)如圖1所示。

PDMS：聚二甲基硅氧烷 polydimethylsiloxane；PC：聚碳酸酯 polycarbonate。

芯片上下框架由2張聚碳酸酯(polycarbonate，PC)板組成，通過4個螺絲固定，既有效保證裝置氣密性，又方便拆卸。根據(jù)腸道組織的生理特征，細胞培養(yǎng)單元通常由2張平行對齊的聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)膜組成[24]。PDMS膜呈直徑為30 mm的圓柱體，柱高分別與腸上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞的平均直徑相同。通過軟光刻技術(shù)構(gòu)建起薄膜柱體中寬0.8 mm、高0.2 mm、長18 mm的微通道[25]以及連接外界進、出樣孔和微通道的孔洞(直徑為1 mm)(圖1-a)。此外，每個PDMS膜中心都有直徑為5 mm的圓柱狀孔洞，當(dāng)2張PDMS膜垂直重疊時，即可形成1個圓柱形密閉空間，此空間經(jīng)徑跡蝕孔膜隔離，一分為二，形成單獨的上、下2層細胞小室。徑跡蝕孔膜的正反面都覆有細胞外基質(zhì)以支持細胞生長，膜上每隔10 μm即有1個1 μm的孔隙，為腸上皮細胞-血管內(nèi)皮細胞間的物質(zhì)交換提供可能，形成腸道-組織界面(圖1-b)。

微流控腸道芯片通常在外部泵體的支持下實現(xiàn)流體循環(huán)，即利用蠕動泵或注射泵將適于細胞生長的培養(yǎng)基以適宜流速從外界導(dǎo)入或?qū)С黾毎囵B(yǎng)單元，以此模擬體液的持續(xù)流動，與此同時還對培養(yǎng)細胞施加了與機體腸腔一致的剪切力[26](圖1-c)；培養(yǎng)基的持續(xù)導(dǎo)入為細胞提供營養(yǎng)并清除其代謝廢物，同時也以培養(yǎng)基為載體精確控制營養(yǎng)素、生長因子、藥物甚至毒素添加，使量化屏障功能、藥物或營養(yǎng)素的吸收成為可能。除此之外，當(dāng)外界泵體向真空的微通道中以不同速率導(dǎo)入氣體時，會對徑跡蝕孔膜施加大小不一的壓強，導(dǎo)致附著在膜上的細胞層因受機械力作用發(fā)生變形[27]，從而潛在控制徑跡蝕孔膜波動，模擬腸道蠕動現(xiàn)象。

2.2 微流控腸道芯片材料

細胞操作單元的材質(zhì)能直接影響細胞生長情況。硅(silicon，Si)和二氧化硅(silicon dioxide，SiO2)是制作微流控芯片最常見的原料，而隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，性能更優(yōu)、成本更低、加工更易的高聚化合物材料如聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)、聚碳酸酯、環(huán)烯烴共聚物(copolymers of cycloolefin，COC)及PDMS逐漸成為它們的替代物。微流控芯片材料及其性能如表2所示。

表2 微流控芯片材料及其性能

PDMS遵守以下原則：1)無毒性，不影響細胞正常生長；2)光學(xué)特性良好，使細胞觀察和檢測更加直觀；3)可塑性強，簡化芯片制作過程；4)PDMS材料間具有黏附性，能增強微流控芯片裝置的氣密性[32-33]；5)氣體滲透性，為芯片內(nèi)細胞創(chuàng)造適宜的氣體環(huán)境[34]。結(jié)合表1，PDMS較其他材料更優(yōu)，且加工簡便，成本更低，是微流控芯片制作常用材料。

2.3 微流控腸道芯片的優(yōu)勢

2.3.1 動態(tài)仿生

在機體中，細胞總是受相鄰細胞、細胞外基質(zhì)、細胞因子或機械力作用，但無論是傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)或Transwell及3D培養(yǎng)技術(shù)，均無法充分還原位于體內(nèi)環(huán)境時的細胞形態(tài)與功能[35-36]。例如，培養(yǎng)在Transwell小室中的腸上皮細胞呈扁平狀，腸絨毛無法分化，腸道分泌功能受到抑制[37]，如圖2-a所示。隨著3D培養(yǎng)技術(shù)的改進，水凝膠細胞培養(yǎng)模型逐漸被用于試驗研究[38-39]，在此培養(yǎng)條件下，細胞雖能形成正常形態(tài)，但仍不能發(fā)揮正常功能[40]。同時，Bein等[41]報道，在靜態(tài)體系中，細胞-微生物共培養(yǎng)不能超過1 d；故無論是2D還是3D細胞培養(yǎng)模式都無法模擬腸道微生態(tài)，更無法保證預(yù)期試驗效果。

傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)模型由于無法充分模擬腸道關(guān)鍵特征，限制了特定生理條件下的腸道功能研究；而微流控腸道芯片由外部泵體介導(dǎo)培養(yǎng)基的循環(huán)流動，高度模擬腸道細胞所處的動態(tài)體液環(huán)境以及所受剪切力。泵體介導(dǎo)的氣體壓強還深入模擬了腸道蠕動樣運動，即在機械力的作用下，芯片中的腸細胞能自發(fā)形成絨毛結(jié)構(gòu)；如圖2-b所示，使用微流控腸道芯片培養(yǎng)時，腸絨毛上分別排布著吸收細胞、杯狀細胞、腸內(nèi)分泌細胞以及潘氏細胞，這與體內(nèi)生理環(huán)境下觀察到的絨毛結(jié)構(gòu)一致[42]；在自發(fā)形成絨毛結(jié)構(gòu)的條件下，芯片中的腸細胞能進一步分化，發(fā)揮黏液分泌功能。

圖2 細胞生長狀況示意圖

2.3.2 生理仿生

傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)只局限于1種細胞，而體內(nèi)環(huán)境下，腸道總是與毛細血管發(fā)生物質(zhì)交換，微流控腸道芯片中徑跡蝕孔膜的微孔允許細胞間發(fā)生物質(zhì)交換，實現(xiàn)了腸上皮細胞與血管內(nèi)皮細胞的共培養(yǎng)[43]，對研究腸道屏障、吸收以及分泌功能具有重要意義。

動物胃腸道含有的共生菌群稱為微生物群，其與免疫調(diào)節(jié)、屏障功能、組織再生以及疾病發(fā)生等密切相關(guān)[44]。此外，腸道微生物菌群還會影響藥物的吸收與代謝[45]。因此，在腸上皮細胞和微生物群之間建立穩(wěn)定的共生關(guān)系對于研究炎癥疾病至關(guān)重要，但以往的研究模型通常因為細菌過度生長而未能成功[46]。微流控腸道芯片通道內(nèi)培養(yǎng)基的流動性為腸道-微生物共培養(yǎng)提供了可能性(圖3)，在動態(tài)培養(yǎng)條件下，細胞-微生物可在與體內(nèi)環(huán)境相似的條件下共培養(yǎng)1周以上[41]，為腸道微生物研究提供新途徑。

圖3 腸道細胞和微生物共培養(yǎng)

微流控芯片在仿生性上還有以下優(yōu)勢：1)芯片形成的密閉空間相對獨立，符合機體生理環(huán)境；2)芯片用于培養(yǎng)細胞的通道間隙極小，可達到微米級別，與細胞大小相匹配[47]；3)芯片導(dǎo)熱性良好，細胞能在更佳的溫度條件下生長；4)相較常規(guī)培養(yǎng)方法，微流控芯片中的細胞黏附性更強[48]，更貼近于體內(nèi)環(huán)境。

2.3.3 精準(zhǔn)可控和可重復(fù)性

微流控腸道芯片以微升級流速向其微米級通道通入營養(yǎng)物質(zhì)，在保證細胞正常生長的同時，可依托進樣孔實時添加藥物、營養(yǎng)素或更改酸堿度、溫度等單一或綜合處理因素，實現(xiàn)試驗條件和處理時間的精確可控性，從而提高微流控腸道芯片的可重復(fù)性[49]。

2.3.4 試驗周期短

由于微流控芯片具有強大的仿生性，故腸道細胞增殖分化迅速。通常，腸上皮細胞在傳統(tǒng)培養(yǎng)方式下需要5～7 d才能形成完整細胞單層，而在微流控芯片中只需2 d即能形成[25]。

微流控腸道芯片能為腸道上皮細胞提供動態(tài)環(huán)境及相應(yīng)的剪切力，模擬腸道蠕動，促使細胞分化、形成絨毛結(jié)構(gòu)。在此培養(yǎng)條件下，芯片能構(gòu)建細胞-細胞界面，實現(xiàn)細胞-微生物共培養(yǎng)并維持數(shù)天至數(shù)周。然而，受制于微流控芯片設(shè)計、傳感器、微量檢測等技術(shù)發(fā)展限制，微流控腸道芯片還存在仿生性不完善、低含量芯片樣本采集和實時檢測困難等問題，仍需進一步完善和發(fā)展。體外試驗?zāi)Ｐ蛢?yōu)缺點對比如表3所示。

表3 體外試驗?zāi)Ｐ蛢?yōu)缺點對比

3 微流控腸道芯片應(yīng)用進展

目前微流控腸道芯片主要應(yīng)用于新藥物開發(fā)、腸道病理、功能營養(yǎng)及微生物研究等醫(yī)學(xué)與營養(yǎng)領(lǐng)域[54-56]。醫(yī)學(xué)研究中藥物開發(fā)難度大，然而動物試驗和傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)技術(shù)在藥物篩選上效率欠佳，通常開發(fā)一種新藥物需10～15年時間[57]；微流控腸道芯片的發(fā)展則為新藥物的快速開發(fā)提供了新的方案。

微流控腸道芯片已進入生物化學(xué)實驗室用于構(gòu)建疾病相關(guān)模型。例如，炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)主要是由于腸上皮細胞對微生物群系發(fā)生異常免疫反應(yīng)造成[58]；Kim等[27]首次在微流控芯片上實現(xiàn)了鼠李糖乳桿菌GG株(LactobacillusrhamnosusGG，LGG)與腸上皮細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)LGG能抑制絨毛鈍化和屏障缺失，增強腸上皮細胞完整性和功能發(fā)揮，但用Transwell培養(yǎng)方法卻導(dǎo)致細胞大量凋亡；此外，益生菌VSL#3、非致病性大腸桿菌和致病性大腸桿菌已成功應(yīng)用于微流控腸道芯片的長期共培養(yǎng)，對探究IBD發(fā)生機理和治療方法發(fā)揮了重要作用[59]。同時，Villenave等[60]向微流控腸道芯片中添加柯薩奇B1病毒(CVB1)感染腸上皮細胞，發(fā)現(xiàn)細胞因子、淋巴細胞的變化趨勢與以往研究一致，證實腸道芯片是腸道病毒感染機制研究的適宜體外模型。

營養(yǎng)是保證人類和動物健康的前提。瑞士“NutriChip”項目旨在利用微流控腸道芯片，對乳制品在腸道中的消化、吸收、代謝規(guī)律進行研究[64]。Ramadan等[65]報道，“NutriChip”微流控裝置結(jié)合免疫熒光顯微鏡，可實時監(jiān)測細胞對促炎癥因子(如脂多糖)的反應(yīng)，篩選出乳制品抗炎性成分。

4 微流控腸道芯片在動物營養(yǎng)研究中的潛在應(yīng)用價值

目前動物營養(yǎng)研究大多基于動物模型、細胞系或原代分離細胞模型開展研究。以豬為例，豬營養(yǎng)研究依靠動物試驗探究營養(yǎng)與生長發(fā)育或健康關(guān)系，闡述活體生理系統(tǒng)的復(fù)雜代謝特征和免疫反應(yīng)等，這類研究涉及動物飼養(yǎng)試驗的高成本付出、操作性及倫理問題，且在體試驗的機制探索研究往往較難控制；同時，2018年非洲豬瘟爆發(fā)使得動物飼養(yǎng)試驗更加難以開展；此外，動物試驗、傳統(tǒng)單層培養(yǎng)皿或Transwell腸細胞培養(yǎng)均難以可視化展現(xiàn)器官如腸道的代謝及增殖分化過程。過去豬營養(yǎng)調(diào)控腸道功能研究中最常用的細胞系是豬小腸上皮細胞(IPEC-J2)；Karimi等[66]利用IPEC-J2建立大腸桿菌炎癥模型，發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌可改善大腸桿菌引起的腸漏；毛湘冰等[67]用異亮氨酸處理IPEC-J2，結(jié)果顯示提高了細胞中黏液蛋白2(mucin 2)、閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)和閉合蛋白(occludin)的基因表達量，為飼糧添加異亮氨酸提高斷奶仔豬的腸道功能提供研究基礎(chǔ)；除此之外，建立腸道干細胞培養(yǎng)模型也可探究多種營養(yǎng)素(如谷氨酸、蛋氨酸和鋅等)對腸道功能損傷修復(fù)的分子機制[68-70]。然而，以上細胞試驗皆采用傳統(tǒng)靜態(tài)模式，在此條件下細胞為單層細胞，仿生性差，無法行使正常生理功能。相反，微流控腸道芯片在高度模擬腸道生理特征即體液流動和蠕動運動的條件下，反映營養(yǎng)素等試驗因素對腸道的獨立效應(yīng)[71]；微流控腸道芯片的動態(tài)仿生性、生理仿生性使其能深度模擬機體細胞形態(tài)和功能，實現(xiàn)微生物-腸道共培養(yǎng)，體現(xiàn)兩者真實的互作效應(yīng)；因此，相比傳統(tǒng)單層細胞培養(yǎng)，微流控腸道芯片的開發(fā)與利用對于動物營養(yǎng)學(xué)研究方法的充實顯得十分必要。

5 小結(jié)與展望

微流控腸道芯片可模擬腸道生理環(huán)境，構(gòu)建腸道-微生物共生界面，為評估藥物干預(yù)或營養(yǎng)處理效果及探究作用機制提供了新的技術(shù)平臺，因此，微流控腸道芯片的開發(fā)與應(yīng)用對于豐富動物營養(yǎng)學(xué)研究方法顯得十分必要。隨著微流控腸道芯片技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建集腸道、肝臟、腎臟、心臟、脂肪等組織器官于一體的微流控裝置——“動物芯片”將成為可能[72]；“動物芯片”可能將獨立的消化、代謝、排泄、內(nèi)分泌、循環(huán)等系統(tǒng)融為一體，具備與動物機體一致的完整生理體系，使得體外研究模型更加貼近于機體內(nèi)在環(huán)境，從而展現(xiàn)藥物或營養(yǎng)素對機體的作用過程。