◎ 李文杰,倪建秀,張 聰,陳 濤,陳桂芳
(南京市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測院,江蘇 南京 210036)
能力驗(yàn)證是依據(jù)預(yù)先制定的準(zhǔn)則,采用檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)間比對的方式,評價(jià)參加者的能力[1],它是確保實(shí)驗(yàn)室維持較高的校準(zhǔn)和檢測水平而對其能力進(jìn)行考核、監(jiān)督和確認(rèn)的一種驗(yàn)證活動。參加能力驗(yàn)證計(jì)劃,可以為實(shí)驗(yàn)室提供評價(jià)其出具數(shù)據(jù)可靠性和有效性的客觀證據(jù)。硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗菌藥物,由于其價(jià)格低廉、抗菌效果好,曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)等動物傳染病的預(yù)防和治療。但由于該類抗生素及其代謝物有致畸胎、致突變和致癌的危險(xiǎn)[2-3],因此此類藥物已先后被禁止在治療和飼料中使用[4],但仍有文獻(xiàn)報(bào)道在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中被使用[5]。近年來,農(nóng)業(yè)部、地方政府組織實(shí)施一系列城市例行監(jiān)測、產(chǎn)地監(jiān)督抽查、苗種監(jiān)督抽查、風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警等各類抽檢工作,以保證水產(chǎn)品質(zhì)量安全。因硝基呋喃類原型藥在生物體內(nèi)代謝迅速[6],其代謝產(chǎn)物因和蛋白質(zhì)結(jié)合而保證長時(shí)間穩(wěn)定存在,所以一般以硝基呋喃類藥物代謝物為目標(biāo)分析物,來達(dá)到檢測硝基呋喃類藥物殘留量的目的。硝基呋喃類代謝物殘留量測定常用的方法有液相色譜法[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-11]。為加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范管理,提高檢驗(yàn)檢測技術(shù)水平,本實(shí)驗(yàn)室近年來多次參加部省級能力驗(yàn)證。本文以參加2016年農(nóng)業(yè)部辦公廳組織的水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量能力驗(yàn)證[12]為例,采用《水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(農(nóng)業(yè)部783號公告-1-2006),對水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量進(jìn)行測定,以評價(jià)檢測數(shù)據(jù)的可靠性和有效性。
Agilent 6460C超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(配有ESI離子源,Agilent公司)、Allegra X-30R 臺式高速冷凍離心機(jī)(貝克曼公司)、KS 501振蕩器(IKA公司)、BP211D電子天平(感量0.000 01 g,賽多利斯公司)、PL602E電子天平(感量0.01 g,梅特勒公司)、MV5全自動濃縮儀(萊伯泰科公司)、Synergy超純水儀(默克密理博公司)及0.45 μm GHP萬用膜針式過濾器(Pall公司)。
呋喃唑酮代謝物(AOZ)標(biāo)準(zhǔn)品,純度99.7%,德國Witega公司生產(chǎn);呋喃它酮代謝物(AMOZ)標(biāo)準(zhǔn)品,純度99.5%,德國Witega公司生產(chǎn);呋喃西林代謝物(SEM)標(biāo)準(zhǔn)品,純度99.5%,德國Dr.Ehrenstorfer公司生產(chǎn);呋喃妥因代謝物(AHD)標(biāo)準(zhǔn)品,純度99.7%,德國Dr.Ehrenstorfer公司生產(chǎn);同位素內(nèi)標(biāo)AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM-13C-15N2, 德國Witega公司生產(chǎn);甲醇、乙酸乙酯、二甲基亞砜,色譜純,Tedia公司生產(chǎn);2-硝基苯甲醛,Sigma-aldrich公司生產(chǎn);實(shí)驗(yàn)用水為Millipore系統(tǒng)所制超純水。
準(zhǔn)確稱取上述適量的標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇分別配制成100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)貯備液,再準(zhǔn)確吸取AOZ、AMOZ、SEM、AHD相應(yīng)的體積用甲醇配制成50 ng·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,吸取AOZ-D4,AMOZ-D5,AHD-13C3,SEM-13C-15N2相應(yīng)的體積用甲醇配制成50 ng·mL-1混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液,標(biāo)準(zhǔn)溶液均置于-20 ℃保存。
0.2 mol·L-1鹽酸溶液:量取濃鹽酸(ρ=1.19 g·mL-1)1.67 mL用水稀釋至100 mL。
0.05 mol·L-12-硝基苯甲醛溶液:稱取0.0378 g 2-硝基苯甲醛溶液溶于5 mL二甲基亞砜中,現(xiàn)用現(xiàn)配。
1.0 mol·L-1磷酸氫二鉀溶液:稱取87.1 g磷酸氫二鉀溶液,溶解于500 mL水中。
能力驗(yàn)證樣品:由能力驗(yàn)證技術(shù)支持單位中國水產(chǎn)科學(xué)研究院提供,樣品編號:X46。
1.2.1 樣品前處理
稱取2.0 g(精確至0.01 g)相同基質(zhì)空白樣品于50 mL離心管中,加入50 ng·mL-1混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.08 mL和50 ng·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.04 mL和 0.08 mL,渦旋混合50 s,再加入5 mL鹽酸溶液和 0.15 mL 2-硝基苯甲醛溶液,渦旋振蕩50 s,置于恒溫水浴振蕩器中37 ℃避光振蕩16 h。
取出離心管冷卻至室溫,加入5 mL磷酸氫二鉀溶液,調(diào)節(jié)pH至7.0~7.5,加入4 mL乙酸乙酯,渦旋振蕩5 min,6 000 r·min-1,20 ℃離心5 min,取上清液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中,再加入4 mL乙酸乙酯重復(fù)上述操作,合并上清液于40 ℃下氮?dú)獯蹈?。?zhǔn)確加入1.0 mL甲醇∶水(2 mmol·L-1乙酸銨+0.1%甲酸)(2∶8,V/V)渦旋振蕩30 s,樣液經(jīng)0.45 μm濾膜,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。
1.2.2 液相色譜條件
色譜柱:Zorbax Eclipse Plus C18(3.0 mm×150 mm, 1.8 μm);流動相:A為水(含2 mmol·L-1乙酸銨+0.1%甲酸),B為甲醇;梯度洗脫:0~3 min,80%→30%A,3~11min,30%→10%,11~11.01 min, 10%→80%;流速:0.4 mL·min-1;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。
1.2.3 質(zhì)譜條件
離子源:電噴霧ESI,正離子模式;霧化氣:氮?dú)?;離子噴霧電壓:4 000 V;干燥氣溫度:350 ℃;干燥氣流速:11 L·min-1;霧化氣壓力:45 psi;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測MRM。離子對、質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。
表1 硝基呋喃類代謝物MRM質(zhì)譜參數(shù)表
精密量取5 ng·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.10 mL、 0.20 mL、0.40 mL和50 ng·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.08 mL、0.16 mL、0.20 mL、0.40 mL于7個50 mL離心管中,除不加樣品外,按上述步驟操作。配制成質(zhì)量濃度分別為0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、 8.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1的硝基呋喃類代謝物標(biāo)準(zhǔn)工作液,內(nèi)標(biāo)濃度為4 ng·mL-1,以分析物的相對響應(yīng)值(分析物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比)為縱坐標(biāo),相對濃度(分析物與內(nèi)標(biāo)的濃度比)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子色譜圖見圖1。 結(jié)果表明,硝基呋喃類代謝物在0.5~20 ng·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,見圖2。
圖1 低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子色譜圖
向 空 白 試 樣 中 添 加1.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1的2個不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,每個濃度3個平行,按照1.2方法進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。結(jié)果顯示,本方法在1.0~2.0 μg·kg-1添加范圍內(nèi),回收率范圍為93.4%~107.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%~8.2%,空白基質(zhì)中添加4種藥物回收率及精密度結(jié)果見 表2。
根據(jù)線性回歸方程計(jì)算各組分濃度,SEM未檢出,AOZ、AMOZ和AHD含量分別為3.17 μg·kg-1、 2.49 μg·kg-1和1.58 μg·kg-1(見表3)。
圖2 4種藥物擬合曲線圖
表2 空白基質(zhì)中添加4種藥物回收率及精密度表
表3 能力驗(yàn)證樣品4種藥物含量表
本次能力驗(yàn)證結(jié)果判定為合格的標(biāo)準(zhǔn)為回收率70.00%~120.00%[12]。AOZ、AMOZ和AHD的回收率分別為96.06%、103.75%和87.78%,能力驗(yàn)證結(jié)果判定合格。