超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定沙拉醬中16種喹諾酮類藥物殘留

◎ 黃思聰，楊建濤，黃象金

（肇慶市食品檢驗所，廣東 肇慶 526040）

喹諾酮類藥物是以4-喹諾酮為母核的一類廣譜抗生素，因其價格低廉且抗菌譜廣，廣泛運用于動物及水產(chǎn)養(yǎng)殖[1]。長期攝入喹諾酮類抗生素，會使人體出現(xiàn)過敏反應(yīng)和變態(tài)反應(yīng)，影響免疫系統(tǒng)功能，產(chǎn)生耐藥性，不利于疾病治療[2-3]。目前，世界衛(wèi)生組織（WTO）、歐盟及我國都對喹諾酮類抗生素在養(yǎng)殖方面有著嚴(yán)格的使用標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)我國農(nóng)業(yè)部公告第278號，禁止在產(chǎn)蛋雞中使用達(dá)氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、二氟沙星、沙拉沙星和洛美沙星等各種形式的制劑；頒布于2015年的農(nóng)業(yè)部公告第2292號，則決定對用于食品動物中的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星和諾氟沙星4種原料藥及制劑停止生產(chǎn)、經(jīng)營及使用。

從過往的監(jiān)測數(shù)據(jù)可以得知，雞蛋、雞肉類的喹諾酮類抗生素濫用問題依然突出[4-10]。而針對以雞蛋為重要原材料的沙拉醬，目前并沒有有效的檢測喹諾酮類抗生素的方法或標(biāo)準(zhǔn)。截至2017年，沙拉醬行業(yè)產(chǎn)量約20.2萬t，表觀消費量約18.9萬t[11]。面對如此龐大且不斷增長的消費市場，建立一個單獨和新型的檢測技術(shù)或方法顯得越來越迫切。

目前，測定喹諾酮類抗生素殘留的檢測方法有酶聯(lián)免疫法[12-13]、高效液相色譜法（HPLC）[14-16]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[17-18]。相對于酶聯(lián)免疫法具有較高的檢出限；HPLC靈敏度低，無法提供目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)信息；LC-MS/MS對目標(biāo)物的分離能力強、靈敏度更高、操作方便，更適合對低殘留多組分的同時測定。前處理方法主要有液液萃取法[19]、QuEChERS[20-22]、固相萃取法[22-26]等。

除雞蛋外，沙拉醬中的大量色拉油亦是導(dǎo)致影響檢測結(jié)果的重要因素，因此，選擇一種高效準(zhǔn)確的前處理方法同樣很有必要。本研究運用Captiva EMR-Lipid 固相萃取技術(shù)，對沙拉醬中的16種喹諾酮類抗生素進(jìn)行提取凈化，該技術(shù)具有回收率和準(zhǔn)確率高，分析速度快等優(yōu)點，進(jìn)一步聯(lián)合UPLC-MS/MS法，達(dá)到更加高效準(zhǔn)確地對沙拉醬中喹諾酮類抗生素殘留量的 測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星、司帕沙星、伊諾沙星、吡哌酸、萘啶酸、惡喹酸、西諾沙星和氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，純度均大于97%，德國Dr.Ehrenstorfer公司生產(chǎn)；乙腈、甲醇、甲酸，質(zhì)譜純，美國Merck公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLCH-class/Xevo TQD超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters公司）、XSE205DU電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）、comfortⅡ超純水系統(tǒng)（德國Sartorius公司）、MultiReax多試管振蕩器（德國heidolph公司）、H1750R高速臺式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）、EVA-60全自動濃縮儀（美國Reeko公司）及Captiva EMR-Lipid凈化柱（美國安捷倫公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

嚴(yán)格稱取粉碎混勻后的沙拉醬樣品4.0 g，置入 50 mL離心管中，再精確加入80%乙腈水（含5%甲酸）10 mL及一顆陶瓷均質(zhì)子，渦旋振蕩1 min，振蕩提取2 min，10 000 r·min-1在4 ℃離心5 min，室溫靜置；準(zhǔn)確移取5.0 mL上清液經(jīng)Captiva EMR-Lipid凈化柱凈化，重力自流，輕度負(fù)壓抽干小柱，收集流出液，用40 ℃氮吹濃縮近干，再加入1.0 mL初始流動相復(fù)溶，通過0.22 μm微孔濾膜過濾，最后濾液供UPLC-MS/MS 測定。

1.3.2 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取喹諾酮類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別溶解于甲醇中，并定容至100 mL，最后配制成100 μg·mL-1質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）； 流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為甲醇；流速 0.35 mL·min-1；進(jìn)樣量2.0 μL；柱溫35 ℃。梯度洗脫 程 序：0～1 min，95%流 動 相A；1～4 min，95%→65%流動相A；4～7 min，65%→5%流動相A；7～7.1 min，5%→95%流動相A；7.1～10 min，95%流動相A。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧離子源（ESI），正離子掃描；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；碰撞氣：氬氣，純度＞99.999%；脫溶劑氣溫度：550 ℃；脫溶劑氣：氮氣，流速1000 L·h-1；毛細(xì)管電壓：1.0 kV。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)6次，結(jié)果表示為平均值，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將濃度為1.0 μg·mL-1的喹諾酮類抗生素單標(biāo)通過質(zhì)譜端蠕動泵進(jìn)樣。在正離子模式下，通過一級質(zhì)譜掃描（MS1 Scan），調(diào)節(jié)毛細(xì)管電壓（Capilary）、脫溶劑氣流量、脫溶劑氣溫度以獲取穩(wěn)定的、響應(yīng)強度最大的[M+H]+分子離子，以確定母離子；通過子離子掃描模式（Daughter Scan）在50～400 m/z范圍內(nèi)找出豐度較強的碎片離子，選擇豐度最強的碎片離子為定量離子，優(yōu)化后的碰撞能量（Collision）、錐孔電壓（Cone）等參數(shù)如表1所示。

表1 分析物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、保留時間及質(zhì)譜參數(shù)表

2.2 提取溶劑的選擇

根據(jù)喹諾酮類抗生素的極性，結(jié)合Captiva EMRLipid前處理方法，分別選擇甲醇、乙腈、酸化乙腈和EDTA-Mcllvaine緩沖溶液作為提取溶劑，比較空白沙拉醬加標(biāo)回收實驗提取效果。結(jié)果表明，由于沙拉醬的脂肪含量高達(dá)76.2%，乙腈具有較強的提取能力，對喹諾酮類抗生素的提取效果最好，結(jié)合Captiva EMRLipid方法可有效去除蛋白質(zhì)和脂肪；根據(jù)喹諾酮類化合物易溶于酸性或堿性溶液的特質(zhì)，因此在本實驗中分別采用1%、2%和5%的甲酸乙腈進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲酸濃度為5%時，蛋白沉淀效果最好；對5%的甲酸乙腈進(jìn)一步添加20%的水，樣品分散和目標(biāo)物釋放更快更徹底，同時可以更好地活化Captiva EMR-Lipid柱。因而本實驗選用80%乙腈水（含5%的甲酸）作為提取溶劑。

2.3 流動相的選擇

采 用Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）作為分析柱，考察甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-10 mmol·L-1乙酸銨和乙腈-10 mmol·L-1乙酸銨流動相對喹諾酮類抗生素的分離效果及其質(zhì)譜響應(yīng)情況。結(jié)果表明，在ESI源正離子模式下，流動相中添加甲酸，通過幫助溶液中的正離子質(zhì)子化，進(jìn)而產(chǎn)生更強的電噴霧信號，提高目標(biāo)物質(zhì)檢測的靈敏度，且峰形良好，故選用0.1%甲酸水作為水相；另外，使用甲醇相對乙腈，分離效果和響應(yīng)強度更佳。綜合分析，采用甲醇-0.1%甲酸水為流動相時，喹諾酮類抗生素的質(zhì)譜響應(yīng)值較高，且經(jīng)梯度洗脫后能夠有效分離（見圖1）。因此選擇甲醇-0.1%甲酸水作為流動相。

2.4 樣品凈化方法的選擇

使用QuEChERS-EMR-Lipid（以下簡稱Q-EL）和Captica EMR-Lipid（以下簡稱C-EL）兩種提取凈化方式分別對濃度為1.0 μg·kg-1、20.0 μg·kg-1、 100.0 μg·kg-1的3組加標(biāo)樣品進(jìn)行測定，每個添加水平測定6次，對結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，Q-EL法的加標(biāo)回收率為47.5%～103.0%，RSD值為1.1%～10.9%；C-EL法的加標(biāo)回收率為72.5%～104.0%，RSD為1.3%～7.5%。這是因為在凈化過程中，Q-EL法是先對目標(biāo)物中的脂質(zhì)進(jìn)行選擇性萃取，去除多余的水分從而改善對目標(biāo)物的分配，但由于其除脂作用依靠的是無水MgSO4，MgSO4遇水會結(jié)塊，影響環(huán)丙沙星、培氟沙星、依諾沙星、諾氟沙星和吡哌酸這幾種藥物的凈化效果，導(dǎo)致回收率偏低；而C-EL法由于采取體積排阻和疏水相相互作用捕獲脂類，將體積較大的分析物排阻出去，可以最大限度地減少離子抑制對目標(biāo)分析物的影響。

因而相對Q-EL法，使用C-EL法的可靠性和穩(wěn)定性更高，可以達(dá)到更好的凈化效果，回收率更高，精密度更理想。不同的處理方法平均回收率和精密度見表2。

圖1 喹諾酮類抗生素提取離子總離子流圖

表2 不同的處理方法平均回收率和精密度表（n=6）

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的消除

采用UPLC-MS/MS分析樣品時，基質(zhì)效應(yīng)是影響定量結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素。因而為消除 UPLC-MS/MS法測定沙拉醬基質(zhì)中喹諾酮類抗生素的基質(zhì)效應(yīng)，采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，分別對純?nèi)軇┮约安缓繕?biāo)物的空白沙拉醬樣品的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行分析，按式（1）計算基質(zhì)效應(yīng)ME值。

式（1）中，Sm為空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，Ss為純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。若ME＞0，表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng)；若ME＜0，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)測定結(jié)果見表3。

表3 基質(zhì)效應(yīng)表（n=6）

由表3可知，在純?nèi)軇┖筒缓繕?biāo)物的空白沙拉醬樣品兩種基質(zhì)中分別加入1 μg·kg-1、10 μg·kg-1、25 μg·kg-1、50 μg·kg-1、100 μg·kg-1和200 μg·kg-1的喹諾酮類抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述Captica EMRLipid固相萃取-UPLC-MS/MS法測定目標(biāo)物質(zhì)譜響應(yīng)強度，重復(fù)測定6次，取6次平均響應(yīng)值分別制得基質(zhì)匹配曲線和溶劑標(biāo)曲線，得出ME值為-0.3%～9.8%，表明在0.1～200.0 μg·kg-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，采用Captica EMR-Lipid固相萃取-UPLCMS/MS法測定沙拉醬中喹諾酮類抗生素時存在基質(zhì)干擾，表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng)。本實驗采用基質(zhì)匹配方法消除基質(zhì)效應(yīng)影響，對16種化合物均采用基質(zhì)匹配外標(biāo)校正的方法，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.6 線性范圍、檢出限與定量限

按 照0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、 10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1和200.0 ng·mL-1共8個質(zhì)量濃度對喹諾酮類抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行配制，使用UPLC-MS/MS法測定，橫坐標(biāo)（x）表示目標(biāo)物質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)（y）表示質(zhì)譜響應(yīng)值，據(jù)此繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以信噪比S/N=3結(jié)合空白基質(zhì)噪音響應(yīng)確定方法的檢出限（LOD）為 0.5 μg·kg-1，以信噪比S/N=10確定方法的定量限（LOQ）為2.0 μg·kg-1。由表1可知，在0.5～200.0 ng·mL-1范圍內(nèi)，喹諾酮類抗生素質(zhì)量濃度與其質(zhì)譜響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.996 5。

2.7 加標(biāo)回收率和精密度

對不含目標(biāo)物的空白沙拉醬樣品，依次添加 1.0 μg·kg-1、20.0 μg·kg-1、100.0 μg·kg-1的16種喹諾酮類抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液，同樣使用上述UPLC-MS/MS法對每個添加水平進(jìn)行6次測定，進(jìn)一步計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），由表2可知，在1.0～100.0 μg·kg-1加標(biāo)范圍內(nèi)，喹諾酮類抗生素的平均加標(biāo)回收率為72.5%～104.0%，RSD為1.3%～7.5%，測定結(jié)果達(dá)到方法學(xué)的要求，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和良好的精密度。

2.8 實際樣品分析

按本研究所建立的Captica EMR-Lipid固相萃取-UPLC-MS/MS法測定20份市售沙拉醬中喹諾酮類抗生素殘留量，均未檢出氧氟沙星、恩諾沙星等16種喹諾酮類抗生素的殘留。

3 結(jié)論

本研究采用Captica EMR-Lipid技術(shù)提取凈化沙拉醬中的氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星、司帕沙星、依諾沙星、吡哌酸、萘啶酸、惡喹酸、西諾沙星和氟甲喹，成功建立UPLC-MS/MS法同時測定沙拉醬中喹諾酮類抗生素的方法。該方法前處理過程簡單、靈敏度和準(zhǔn)確度高、分離效果好，可為沙拉醬中喹諾酮類抗生素殘留檢測及確證提供新的方向；同時對進(jìn)一步加強我國食品檢測技術(shù)能力，彌補該領(lǐng)域食品檢測技術(shù)的空白及保障食品安全具有十分重大的意義。