重組耐熱β-葡萄糖苷酶的固定化及其對黃酮糖苷的定向轉(zhuǎn)化

解靜聰，徐 浩，張 寧，楊 靜，趙 劍

(中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室；國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點實驗室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇 南京 210042)

黃酮類化合物是一類在自然界中廣泛存在的次級代謝產(chǎn)物，其母核結(jié)構(gòu)為2-苯基色原酮。目前較為常見的黃酮類化合物主要是黃酮醇類、黃酮類以及異黃酮類。據(jù)報道，黃酮類化合物具有廣泛的生物活性，在抗腫瘤、降血糖、抗病毒、抗衰老、保護心腦血管、免疫調(diào)節(jié)和預(yù)防骨質(zhì)疏松等方面具有顯著的功效[1]，已成為目前研究的熱點。作為次級代謝產(chǎn)物，黃酮類化合物常與葡萄糖等單糖以O(shè)-糖苷形式存在于植物體內(nèi)，因此從植物原料中提取獲得的黃酮類化合物通常為黃酮糖苷。研究表明，黃酮苷元的生物活性及生物利用率顯著高于黃酮糖苷[2]，如銀杏黃酮苷元的抗氧化功效是黃酮糖苷的7倍[3]。黃芩素(黃芩苷元)較其糖苷形式黃芩苷更易被人體吸收[4]。槲皮素是一種黃酮醇，具有抑制多種腫瘤細胞生長，同時抑制腫瘤血管生成的功效[5-7]。大豆苷元是最為常見的一種異黃酮，在大豆中含量較高，其對多種癌細胞具有抗增殖和抗轉(zhuǎn)移功能[8]。同時，大豆苷元對心腦血管也具有顯著的保護作用[9]。淫羊藿素是一種特殊的異戊烯基黃酮醇，同時也是淫羊藿黃酮中的稀有組分，具有廣泛的生物活性。淫羊藿素對肝癌、乳腺癌、膀胱癌及結(jié)腸癌等腫瘤細胞增殖具有顯著的抑制作用[10-13]。生物酶法具有選擇性強、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點，目前已被應(yīng)用于黃酮糖苷的糖基脫除轉(zhuǎn)化[14-15]。

目前，制約生物酶大規(guī)模應(yīng)用的瓶頸之一是其使用成本過高。酶的固定化技術(shù)不僅保證了生物酶本身高效專一的優(yōu)勢，而且可以實現(xiàn)酶蛋白多次重復(fù)回收，可控連續(xù)化反應(yīng)，以及高穩(wěn)定性貯存的目標(biāo)[16]，提高了生物酶的利用率，降低了酶使用成本，能夠有效地節(jié)省酶制備的能源和資源，符合可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的要求。作者所在實驗室的前期研究中，從極端嗜熱微生物燃球形菌IgnisphaeraaggregansDSM17230的基因組中克隆了一種耐熱β-葡萄糖苷酶基因IgagBgl1，并在大腸桿菌中實現(xiàn)了高效異源表達，該重組耐熱β-葡萄糖苷酶能夠有效地轉(zhuǎn)化多種黃酮糖苷，生成生物活性更強的黃酮苷元。本研究對耐熱β-葡萄糖苷酶的固定化及其性能，以及對黃酮糖苷的轉(zhuǎn)化展開了研究，以期進一步提高酶的穩(wěn)定性，實現(xiàn)對重組酶的多次重復(fù)使用，從而降低重組酶在黃酮糖苷生物轉(zhuǎn)化方面的使用成本。

1 實 驗

1.1 原料、試劑和儀器

對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(pNPG)購自Sigma公司，異槲皮素、槲皮素、大豆苷、大豆苷元、淫羊藿次苷I以及淫羊藿素的標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于99.5%)均購自于中國科學(xué)院成都生物研究所。海藻酸鈉、氯化鈣和戊二醛等試劑均為分析純。重組耐熱β-葡萄糖苷酶(2 000 U/mL,pH值6.0)由本實驗制備純化濃縮并保存于-20 ℃。

HH-2數(shù)控水浴鍋，上海維誠公司；Synergy HTX全波段讀板機，美國BioTek公司；Avanti JXN-30冷凍離心機，美國Beckman Coulter公司。

1.2 固定化重組酶制備方法及單因素試驗優(yōu)化

配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(1%、 1.5%、 2%、 2.5%和3%)的海藻酸鈉溶液，取1 mLβ-葡萄糖酶液(酶活力2 000 U/mL，pH值6.0)分別添加到100 mL不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)海藻酸鈉溶液中，充分混勻。再向混合溶液中加入戊二醛并充分混勻，于4 ℃下靜置2 h。此時混合溶液中β-葡萄糖酶酶活力約為20 U/mL。將混合溶液緩慢滴入500 mL氯化鈣溶液中，將過濾得到的顆粒置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的氯化鈣溶液中硬化，再將過濾所得顆粒于4 ℃下置于0.025%的戊二醛溶液中進行2.5 h再交聯(lián)。以25 mmol/L 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液(pH值6.0)沖洗過濾所得顆粒。吸干顆粒表面水分后，進行真空干燥獲得固定化酶顆粒[17-19]。

優(yōu)化重組酶固定化條件的單因素設(shè)計：在制備重組酶固定化顆粒過程中，向海藻酸鈉-耐熱β-葡萄糖酶混合溶液中添加戊二醛，戊二醛的最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、 0.5%、 1%、 1.25%、 1.5%和2%；將海藻酸鈉-耐熱β-葡萄糖酶-戊二醛混合溶液滴加至氯化鈣溶液中，氯化鈣溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、 1.5%、 2%、 2.5%、 3%和3.5%；所形成的酶固定化顆粒被置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的氯化鈣溶液中硬化，硬化時間分別為1、 1.5、 2、 2.5、 3、 3.5和4 h。

1.3 游離酶、固定化酶的活力測定

在170 μL去離子水中加入10 μL 500 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液(pH值3.0～8.0)及10 μL 20 mmol/LpNPG溶液，在95 ℃水浴鍋中孵育10 min后，再加入0.15 μgβ-葡萄糖苷酶(游離)或0.3 mg不同條件下制得的固定化酶顆粒，反應(yīng)10 min后加入600 μL 1 mol/L 碳酸鈉溶液，終止反應(yīng)并顯色。離心后取上清液在405 nm下測定吸光度值。酶活力定義為在最適酶反應(yīng)條件下，每分鐘水解pNPG釋放1 μmol對硝基苯酚所需的游離酶(或固定化酶)的量為1個游離酶(或固定化酶)活力[20]。

酶的固定化率以載體顆粒上所固定的酶的酶活作為評價指標(biāo)，在最適酶反應(yīng)條件下，固定化酶顯示的酶活性與固定化體系中所添加游離酶的總活性的比值即為固定化酶的固定化率。

1.4 酶學(xué)性質(zhì)的測定

1.4.1最適反應(yīng)pH值和最適反應(yīng)溫度 最適酶反應(yīng)pH值測定：檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液pH值在 3.0～8.0 范圍內(nèi)，95 ℃條件下，在1.3節(jié)所述酶活力測定體系下檢測游離酶和固定化酶的最適反應(yīng)pH值。以不同反應(yīng)pH值下測得最大酶活力值作為相對酶活力100%。

最適酶反應(yīng)溫度測定：在50～100 ℃范圍內(nèi)，每隔5 ℃在1.3節(jié)所述酶活力測定體系下檢測游離酶和固定化酶的酶活力。以不同反應(yīng)溫度下測得最大酶活力值作為相對酶活力100%。

1.4.2熱穩(wěn)定性測定 將游離酶和固定化酶分別置于20 mmol/L pH值6.0緩沖溶液中，于90 ℃條件下水浴孵育3 h，在孵育10、 20、 40、 60、 80、 100、 140和180 min后分別取樣，置于冰浴中。以置于20 mmol/L pH值6.0緩沖溶液冰浴的游離酶和固定化酶為對照(相對酶活力100%)，在1.3節(jié)所述酶活力測定體系下，測定不同孵育時間的游離酶和固定化酶的酶活力。其他條件下的酶活力情況以酶活力損失率表示。

1.4.3酸堿穩(wěn)定性測定 將游離酶和固定化酶分別置于不同pH值(3.0～8.0)的20 mmol/L緩沖溶液中，然后置于70 ℃條件下水浴孵育1 h后在冰浴下保存，在1.3節(jié)所述酶活力測定體系下，分別對游離酶和固定化酶樣品的酶活力進行測定。以不同pH值緩沖液冰浴下保存的游離酶和固定化酶樣品的酶活力值作為對照，其他條件下的酶活力情況以酶活力損失率表示。

1.4.4固定化酶重復(fù)使用性能測定 取固定化酶0.3 mg，在1.3節(jié)所述酶活力測定體系下進行反應(yīng)，以冰浴終止反應(yīng)，離心后分離出固定化酶顆粒，再次添加到酶活力測定體系中進行反應(yīng)，循環(huán)使用20次，測定固定化酶顆粒的酶活力，評價其重復(fù)過程中殘余酶活力的變化情況。

所有試驗所得數(shù)據(jù)均為3次平行試驗的平均值。

1.5 固定化酶轉(zhuǎn)化黃酮糖苷生成黃酮苷元

以3種50 g/L黃酮糖苷(異槲皮素、大豆苷和淫羊藿次苷I)分別作為底物，于固定化酶轉(zhuǎn)化黃酮糖苷的反應(yīng)體系中添加20 μL底物，5 μL二甲基亞砜作為助溶劑及475 μL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液(25 mmol/L，pH值7.0)。在酶轉(zhuǎn)化體系中，添加33 mg固定化酶顆粒，在最適酶條件(95 ℃，pH值7.0)下反應(yīng)2 h，分別轉(zhuǎn)化獲得槲皮素、大豆苷元和淫羊藿素。在保溫10、 20、 40、 60、 80、 100和120 min后分別取樣，加入適量甲醇稀釋樣品，進行HPLC檢測并獲得底物的轉(zhuǎn)化率。

1.6 黃酮糖苷的HPLC檢測及其標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

1.6.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 將6種標(biāo)準(zhǔn)品分別配置為1 g/L的母液，稀釋至終質(zhì)量濃度為0.01、 0.02、 0.04、 0.06、 0.08、 0.10、 0.15和0.20 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.6.2異槲皮素和槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 固定相為Waters Symmetry C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇與質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%乙酸水溶液的混合溶液(體積比55 ∶45)，流速為0.8 mL/min,在360 nm處檢測吸光度值。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。異槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=393.894X+2.471，R2=0.997 3；槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=415.461X+1.045，R2=0.993 5。

1.6.3大豆苷和大豆苷元的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 方法與槲皮素類似，只是流動相中甲醇與質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%乙酸水溶液體積比40 ∶60，檢測波長254 nm。大豆苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=385.93X+6.620，R2=0.994 1；大豆苷元的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=499.752X+5.534，R2=0.997 8。

1.6.4淫羊藿次苷I和淫羊藿素的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 固定相為Waters Symmetry C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，經(jīng)乙腈和0.1%乙酸水溶液的混合溶液進行梯度洗脫(0～20 min乙腈和0.1%乙酸水溶液的體積比為70 ∶30～90 ∶10)，流速為0.8 mL/min，檢測波長270 nm。淫羊藿次苷I的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=502.549X+2.192，R2=0.999 1；淫羊藿素的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=587.514X+3.574，R2=0.999 5。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化重組耐熱β-葡萄糖苷酶的條件優(yōu)化

2.1.1海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù) 當(dāng)氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%，顆粒硬化時間為3 h時，考察海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對固定化酶的影響。如表1所示，當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時，固定化效果最好。隨著海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，重組酶固定化的效果呈顯著降低的趨勢。當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于1.5%時，固定化酶顆粒的重組酶回收率較低，這可能是由于低質(zhì)量分?jǐn)?shù)海藻酸鈉形成的凝膠空隙大小不利于重組酶的吸附固定。因此，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%是制備該重組耐熱β-葡萄糖苷酶固定化顆粒的最適條件。

2.1.2氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù) 選擇海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%，其他條件同2.1.1節(jié)，考察氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)對固定化酶的影響，結(jié)果如表1所示。

表1 不同條件對固定化酶的影響

由表1可知，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%和2.5%時，重組酶固定化率較高，固定化效果較好。海藻酸鈉與鈣離子可通過離子交換不可逆地形成海藻酸鈣凝膠，當(dāng)氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于1.5% 時，可能導(dǎo)致凝膠的交聯(lián)作用強度降低，不利于重組酶的吸附固定，特別是當(dāng)氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%時，所制得凝膠顆粒的機械強度顯著低于高濃度氯化鈣溶液中制備的凝膠顆粒?？紤]到固定化效果和機械強度的平衡，選擇氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%。

2.1.3顆粒硬化時間 固定化凝膠顆粒的硬化是外部溶液中鈣離子逐漸置換凝膠內(nèi)部鈉離子，形成內(nèi)部交聯(lián)體系的過程。選擇海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%、氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%，其他條件同2.1.1節(jié)，考察顆粒硬化時間對固定化酶的影響，結(jié)果如表1所示。重組酶的固定化率隨顆粒硬化時間的延長呈先增加后基本不變的趨勢，硬化時間為2.5 h時達到最佳值。這可能是由于孵育時間過短，凝膠中離子交換不夠徹底，導(dǎo)致交聯(lián)體系穩(wěn)定性不足，影響了重組酶的吸附和固定，最終導(dǎo)致了凝膠顆粒中重組酶固定化率偏低的結(jié)果。因此，選擇顆粒硬化時間為2.5 h。

2.1.4戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù) 戊二醛是酶固定化中常用的交聯(lián)劑，其兩端的醛基活性較強，可促進載體和重組酶交聯(lián)狀態(tài)的形成，提高凝膠顆粒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%、氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%和顆粒硬化時間2.5 h條件下，考察戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對固定化酶的影響，結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，重組酶固定化后的固定化率隨戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高顯著提高，當(dāng)戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到1.25%時，凝膠顆粒對酶的固定化效果達到最佳；隨著戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的繼續(xù)升高，固定化效果無顯著提高。特別是當(dāng)戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高至2.0%時，反而顯著降低了固定化酶的固定化率。因此，選擇戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.25%。

由此可見，重組耐熱β-葡萄糖苷酶固定化的較佳條件為：在pH值6.0，室溫條件下，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%，戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.25%，硬化時間為2.5 h。在此條件下，酶固定化率可達62.5%。

2.2 固定化酶與游離酶的酶學(xué)性質(zhì)比較

2.2.1固定化酶的最適反應(yīng)pH值和溫度 固定化重組酶是期望其在保有游離酶優(yōu)異性質(zhì)的同時，在酶穩(wěn)定性和酶重復(fù)使用等方面有所提高，達到降低酶使用成本的最終目的。因此，固定化重組酶的酶學(xué)性質(zhì)也是評價其固定化效果的重要因素。

根據(jù)2.1節(jié)較優(yōu)固定化條件，制備獲得了重組耐熱β-葡萄糖苷酶的固定化酶。將固定化酶分別置于95 ℃的不同pH值緩沖溶液體系中，測酶的活力和穩(wěn)定性，結(jié)果如圖1(a)所示。固定化酶較游離酶的最適合反應(yīng)pH值向中性略有偏移。同時，固定化酶相比游離酶具有更寬的適應(yīng)范圍。這是因為固定化載體上的負電荷可能改變了重組酶表面水化層的電荷分布，使得酶分子在堿性條件也下顯示出較高的酶活力。

圖1 固定化酶的最適反應(yīng)pH值(a)和最適反應(yīng)溫度(b)

在游離酶與固定化酶各自最適pH值，測定游離酶與固定化酶的最適反應(yīng)溫度，結(jié)果如圖1(b)所示。與游離酶相比，固定化酶的最適反應(yīng)溫度為95 ℃，與游離酶相比未顯示出顯著的變化。當(dāng)反應(yīng)溫度在60～100 ℃之間，固定化酶的相對酶活力均高于游離酶，可能是酶分子與海藻酸鈣凝膠的交聯(lián)作用提高了酶分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，使得固定化酶在高溫條件下穩(wěn)定性優(yōu)于游離酶，從而提高了固定化酶在高溫條件下的催化性能。

2.2.2固定化酶的熱穩(wěn)定性 將固定化酶置于pH值6.0緩沖溶液中，按照1.4.2節(jié)操作測固定化酶在90 ℃條件下的熱穩(wěn)定性，結(jié)果見圖2。固定化酶較游離酶顯示出更好的熱穩(wěn)定性，在90 ℃下保溫3 h 后酶活力損失率為10%左右，在相同條件下游離酶的酶活力損失率約為28%，可能是酶分子與固定化介質(zhì)之間的多點交聯(lián)，穩(wěn)定了酶分子的三維結(jié)構(gòu)，從而增強了酶蛋白天然構(gòu)象的穩(wěn)定性，延緩了高溫條件下酶蛋白的失活過程。

圖2 固定化酶的熱穩(wěn)定性

2.2.3固定化酶的酸堿穩(wěn)定性 將固定化酶分別置于95 ℃的不同pH值緩沖溶液體系中，測酶的酸堿穩(wěn)定性，結(jié)果見圖3。固定化酶的酸堿穩(wěn)定性變化趨勢與游離酶一致，但固定化酶的酶損失率在pH值3.5～8.0條件下均略低于游離酶?？赡苁怯捎诤Ｔ逅徕c凝膠對酶分子表面水化層的穩(wěn)定性具有增強作用。

2.2.4固定化酶的重復(fù)使用性能 固定化酶經(jīng)過10次重復(fù)使用后，其殘余酶活力如圖4所示，固定化酶仍能保留75%左右的殘余酶活力。重復(fù)使用20次后，雖然殘余酶活力顯著下降，但仍能保留55%以上的殘余酶活力。重復(fù)使用后固定化酶活力下降的原因可能是，固定化酶顆粒在最適反應(yīng)溫度和終止反應(yīng)溫度之間反復(fù)變化，影響了固定化酶與介質(zhì)之間交聯(lián)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，使得酶分子從固定化介質(zhì)中釋放出來，從而導(dǎo)致其固定化酶活力的降低。

圖4 固定化酶重復(fù)使用的穩(wěn)定性Fig.4 The reusable stability of the immobilized enzyme

2.3 固定化酶轉(zhuǎn)化黃酮糖苷生成黃酮苷元性能的比較

異槲皮素、大豆苷及淫羊藿次苷I經(jīng)固定化酶轉(zhuǎn)化為槲皮素、大豆苷元和淫羊藿素的時效曲線見圖5。

由圖5可知，2 g/L異槲皮素經(jīng)固定化酶轉(zhuǎn)化 100 min后，幾乎完全轉(zhuǎn)化為1.294 g/L的槲皮素，摩爾轉(zhuǎn)化率為99.37%。2 g/L大豆苷經(jīng)固定化酶轉(zhuǎn)化 80 min 后，得1.455 g/L的大豆苷元，摩爾轉(zhuǎn)化率為97.21%。2 g/L淫羊藿次苷I經(jīng)固定化酶轉(zhuǎn)化 120 min 后，生成1.427 g/L的淫羊藿素，其摩爾轉(zhuǎn)化率為97.93%。固定化酶對3種黃酮糖苷均具有好的轉(zhuǎn)化能力，槲皮素、大豆苷元及淫羊藿素的產(chǎn)率分別為0.776、 1.091和0.714 g/(L·h)。

圖5 異槲皮素(a)、大豆苷 (b)及淫羊藿次苷I (c)的酶轉(zhuǎn)化時效曲線

3 結(jié) 論

3.1采用包埋交聯(lián)法固定化重組耐熱β-葡萄糖苷酶，通過單因素試驗得到最優(yōu)制備條件為：在pH值6.0，室溫條件下，酶活力20 U/mL，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%，氯化鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%，戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.25%，硬化時間2.5 h，固定化酶顆粒的酶活力為0.64 U/mg，酶固定化率可達62.5%。

3.2酶學(xué)性質(zhì)測試結(jié)果表明：固定化酶與游離酶的最適反應(yīng)溫度均為95 ℃，固定化酶和游離酶分別在pH值7.0和6.5時具有最高酶反應(yīng)效率。固定化酶在90 ℃下保溫3 h后，仍具有90%左右的殘余酶活力，重復(fù)使用10次后仍具有75%左右的殘余酶活力。

3.3在95 ℃，pH值7.0條件下，添加固定化酶顆粒33 mg，異槲皮素、大豆苷以及淫羊藿次苷I這3種黃酮糖苷分別在100、 80和120 min內(nèi)能夠高效轉(zhuǎn)化，生成活性更強的黃酮苷元槲皮素、大豆苷元和淫羊藿素，其摩爾轉(zhuǎn)化率分別為99.37%、 97.21%和97.93%，其產(chǎn)率分別為0.776、 1.091和0.714 g/(L·h)。