降解園林廢棄物專用固體復(fù)合菌的構(gòu)建及其堆肥效應(yīng)研究

付冰妍, 孫向陽(yáng), 余克非, 李素艷

北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 北京 100083

近年來(lái)，全國(guó)各地城市綠化面積不斷增加，園林廢棄物已成為城市固體廢棄物的重要組成部分[1-3]. 在園林廢棄物的處理方法中，生物堆肥法因能耗低、降解率高、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[4-5]. 相較于單一菌劑而言，復(fù)合菌劑產(chǎn)酶具有多樣性，在各種酶的相互協(xié)同作用下有利于加快園林廢棄物的降解[6]，此外，復(fù)合菌劑中不同菌株的環(huán)境適應(yīng)性有所差異，致使其能夠更好地適應(yīng)堆肥過(guò)程中極端的環(huán)境變化，發(fā)揮更大的作用. 但過(guò)去關(guān)于復(fù)合菌劑的研究主要集中于液體菌劑，液體菌劑存在研制需嚴(yán)格無(wú)菌操作條件、產(chǎn)品不便于存儲(chǔ)運(yùn)輸?shù)热毕輀7]，因此，嘗試制備固體菌劑替代液體菌劑. 固體菌劑不僅能夠彌補(bǔ)液體菌劑在研制和存儲(chǔ)方面的不足，還具有成本較低、工藝相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[8-9]，因而選用固體菌劑作為微生物制劑用于園林廢棄物堆肥具有明顯的優(yōu)越性. 但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于固體復(fù)合菌劑制備的研究尚不充分[10-12]，而固體復(fù)合菌劑的應(yīng)用又大多以抑制植物病蟲害或促進(jìn)植物生長(zhǎng)等方面的研究為主[13]，鮮見(jiàn)園林廢棄物堆肥方面的研究. 鑒于此，該研究利用前期獲得的兩株可降解木質(zhì)素和纖維素的固體菌劑——芽孢桿菌(Bacillussp.)B01和B02，在此基礎(chǔ)上將其混配成固體復(fù)合菌劑，以木質(zhì)素和纖維素降解率為指標(biāo)，探究固體復(fù)合菌劑的接種濃度和比例最佳值，構(gòu)建可高效降解園林廢棄物的固體復(fù)合菌系，并進(jìn)一步研究其在堆肥過(guò)程中的應(yīng)用效果，旨在為園林廢棄物專用固體復(fù)合菌劑的制備及其在堆肥過(guò)程中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1供試菌株

芽孢桿菌B01和B02均分離自腐熟堆肥，筆者所在實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏，菌落形態(tài)見(jiàn)圖1.

圖1 芽孢桿菌B01和B02的菌落形態(tài)

1.1.2培養(yǎng)基

種子液培養(yǎng)基[14]：采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水 1 000 mL，瓊脂20 g).

B01固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：35%麥麩、45%米糠、6%乳糖、6%黃豆粉、8%硅藻土.

B02固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：25%麥麩、50%米糠、7%乳糖、7%黃豆粉、11%硅藻土.

1.1.3堆肥原材料

堆肥原料取自北京植物園香山堆肥廠的枯枝落葉，并測(cè)定其基本理化性質(zhì). 堆肥原材料pH為5.87，電導(dǎo)率(EC)為0.79 mS/cm，腐殖質(zhì)含量為32.97 g/kg，種子發(fā)芽指數(shù)為53.69%.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1單一菌株固體菌劑的制備

向500 mL錐形瓶中加入50 g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，在121 ℃條件下滅菌20 min. 將B01和B02按照15%接種量分別接入其相應(yīng)的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于恒溫(37 ℃)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，烘箱烘干，即制得固體菌劑B01、B02. 此時(shí)，B01和B02固態(tài)發(fā)酵物活菌體數(shù)分別可達(dá)到2.6×1010和4.5×109CFU/g.

1.2.2單一菌株液體菌劑的制備

向250 mL錐形瓶中裝入50 mL種子液培養(yǎng)基，將B01和B02單菌落分別接入其中，在恒溫振蕩器 (37 ℃，200 r/min)中分別培養(yǎng)60和49 h，即制得液體菌劑B01、B02. 此時(shí)B01和B02液態(tài)發(fā)酵活菌體數(shù)分別可達(dá)1.0×1010和1.0×109CFU/mL.

1.2.3篩選最佳固體復(fù)合菌劑正交試驗(yàn)

按照固體復(fù)合菌劑接種量1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%及復(fù)合比例(B01∶B02)10∶0、7.5∶2.5、5∶5、2.5∶7.5、0∶10接入園林廢棄物中進(jìn)行好氧堆肥試驗(yàn)，共計(jì)25組處理，每組處理均做3個(gè)平行. 在每個(gè)錐形瓶中加入80 g未滅菌的園林廢棄物，然后將各處理組依次加入園林廢棄物中，振蕩搖勻后用自來(lái)水調(diào)節(jié)含水率為60%～65%，置于25～50 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 發(fā)酵周期為28 d，于第28天取樣，測(cè)定樣品中木質(zhì)素、纖維素含量，計(jì)算每組處理的木質(zhì)素、纖維素降解率，并以降解率為指標(biāo)，選出最佳固體復(fù)合菌劑.

1.2.4堆肥驗(yàn)證試驗(yàn)

試驗(yàn)共設(shè)置3個(gè)處理，包括CK(不添加菌劑)、LB012(接種液體復(fù)合菌劑)、SB012(接種固體復(fù)合菌劑)，其中，SB012處理組按照最佳配比添加固體菌劑，同時(shí)設(shè)置SB012和LB012兩組處理添加菌劑的活菌數(shù)相同，每組處理均做3個(gè)平行. 于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行好氧堆肥試驗(yàn)，堆肥試驗(yàn)周期為28 d，模擬堆肥過(guò)程中的溫度變化，1～5 d內(nèi)將溫度從25 ℃升至50 ℃，5～8 d內(nèi)溫度始終保持在50 ℃，18～28 d內(nèi)將溫度從50 ℃降至25 ℃. 此外，該培養(yǎng)箱能夠自動(dòng)通氣，每2 d翻堆(用玻璃棒上下攪拌)一次，每4 d取樣一次，樣品分成2份，其中一份風(fēng)干備用，另一份存放于4 ℃冰箱中待用.

1.3 指標(biāo)測(cè)定及方法

pH、EC測(cè)定以水肥質(zhì)量比10∶1浸提，采用pH計(jì)和電導(dǎo)率儀測(cè)定[15]. 測(cè)定種子發(fā)芽指數(shù)(GI)時(shí)，吸取5 mL浸提液(水肥質(zhì)量比10∶1浸提)，加到鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放置20粒小白菜種子，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，計(jì)算GI值. 腐殖質(zhì)含量采用焦磷酸鈉浸提-K2Cr2O7容量法測(cè)定；胡敏酸、富里酸含量采用焦磷酸鈉提取-重鉻酸鉀法測(cè)定；木質(zhì)素含量采用濃硫酸水解法測(cè)定；纖維素含量采用硝酸乙醇法測(cè)定[16-17].

2 結(jié)果與討論

2.1 篩選最佳固體復(fù)合菌劑正交試驗(yàn)結(jié)果

木質(zhì)纖維素是園林廢棄物的主要成分，其降解率是評(píng)價(jià)堆肥腐熟程度的重要指標(biāo)，因此該試驗(yàn)選用L25(5)6正交表，探究不同復(fù)合比例和復(fù)合菌劑接種濃度對(duì)木質(zhì)素、纖維素降解率的影響，從而篩選出最佳固體復(fù)合菌劑，結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 木質(zhì)素和纖維素降解率正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析

2.2 堆肥試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1堆肥腐熟過(guò)程中的pH和EC變化分析

堆肥過(guò)程中pH的變化情況如圖2所示. 堆肥原材料的pH為5.87，而3組處理堆肥產(chǎn)品的pH在8.10～8.40之間，可以看出在堆肥過(guò)程中pH總體呈上升趨勢(shì)，這與田赟等[19]的研究結(jié)果一致. 各處理的pH變化趨勢(shì)基本一致，均呈先上升后下降的趨勢(shì). 這是因?yàn)樵诙逊食跗谖⑸锎罅糠纸庥袡C(jī)質(zhì)產(chǎn)生NH3，致使pH上升；此后硝化作用增強(qiáng)，同時(shí)氨化作用減弱，氨氣揮發(fā)，致使pH下降[20]. 堆肥結(jié)束時(shí)，各堆體的pH從大到小依次為L(zhǎng)B012、CK、SB012，只有SB012處理組的pH同時(shí)達(dá)到了GB 31755—2015《綠化植物廢棄物處置和應(yīng)用技術(shù)規(guī)程》和LY/T 2700—2016《花木栽培基質(zhì)》的標(biāo)準(zhǔn)限值.

表3 木質(zhì)素和纖維素降解率正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

圖2 堆肥過(guò)程中pH的變化情況

堆肥過(guò)程中EC的變化情況如圖3所示. 由圖3可見(jiàn)，各處理組的EC變化趨勢(shì)大致相同，均呈現(xiàn)出先上升、后降低、再上升、最后緩慢下降的趨勢(shì). 這是因?yàn)槌跗诙逊试显谖⑸锏姆纸庀?，產(chǎn)生大量小分子物質(zhì)致使EC上升，隨后由于NH3的揮發(fā)以及硝化細(xì)菌礦化產(chǎn)生NO3-，致使EC呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，最后隨著堆肥腐殖化進(jìn)程和芳構(gòu)化程度的提高，各處理組的EC開始緩慢下降. 堆肥結(jié)束時(shí)，CK、LB012、SB012三組處理的EC分別為0.75、0.74、0.77 mS/cm，均達(dá)到了Garcia等[21]提出的堆肥電導(dǎo)率的標(biāo)準(zhǔn)(<4 mS/cm)，而CK和LB012處理組EC偏低主要是因?yàn)槎洋w內(nèi)物質(zhì)未被完全分解.

圖3 堆肥過(guò)程中EC的變化情況

2.2.2堆肥過(guò)程中腐殖質(zhì)含量及其組成的變化特征

由圖4可見(jiàn)，堆肥過(guò)程中，各處理組的腐殖質(zhì)含量均呈先下降后上升的趨勢(shì). 這是因?yàn)槎逊食跗诟迟|(zhì)中分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的物質(zhì)被微生物大量降解，致使其分解速率大于合成速率，腐殖質(zhì)總含量呈下降趨勢(shì). 隨著堆肥的進(jìn)行，易降解的有機(jī)物減少，微生物開始利用難降解的木質(zhì)素、纖維素作為碳源，同時(shí)，也逐漸生成了穩(wěn)定性高、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的腐殖質(zhì)，致使腐殖質(zhì)總含量增加. 堆肥結(jié)束時(shí)，LB012、SB012兩個(gè)處理組的腐殖質(zhì)含量分別為34.80、36.99 g/kg，與未堆肥前的物料相比，分別提高了5.55%、12.19%；而CK處理組的腐殖質(zhì)含量為31.98 g/kg，較未堆肥前的物料降低了3%. 與LB012和CK處理相比，SB012處理組可使腐殖質(zhì)含量提高6.29%和15.67%，說(shuō)明添加固體復(fù)合菌劑SB012提高了堆肥產(chǎn)品中腐殖質(zhì)含量. 這主要是因?yàn)楦迟|(zhì)的形成與微生物及其分泌的酶關(guān)系十分密切，而固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶量一般比液態(tài)發(fā)酵高出2～3倍[22]，添加固體復(fù)合菌劑SB012更有利于將木質(zhì)纖維素類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成腐殖質(zhì)前體物質(zhì)，促進(jìn)腐殖質(zhì)合成.

圖4 堆肥過(guò)程中腐殖質(zhì)、胡敏酸、富里酸含量的變化

胡敏酸和富里酸是腐殖質(zhì)的重要組分，在堆肥進(jìn)程中二者同時(shí)存在自身的分解與合成過(guò)程，其含量的變化會(huì)影響腐殖質(zhì)的質(zhì)量，各處理組胡敏酸和富里酸含量的變化情況見(jiàn)圖4. 可以看出，堆肥原材料中富里酸含量高于胡敏酸含量，隨著堆肥過(guò)程的推進(jìn)，胡敏酸含量呈先下降后上升、總體表現(xiàn)為上升的趨勢(shì)，而富里酸含量呈先上升后下降、整體呈下降的趨勢(shì)，這與XIAO等[23]的研究結(jié)果一致. 堆肥結(jié)束時(shí)，LB012、SB012、CK三組處理的胡敏酸含量較初期的增幅分別達(dá)34.87%、55.60%、15.40%，富里酸含量較初期的降幅分別達(dá)18.92%、24.04%、18.42%. 從胡敏酸含量的增加趨勢(shì)和富里酸含量的降低趨勢(shì)可以看出，各處理對(duì)二者形成的影響有明顯差異，SB012處理組能夠更好地促進(jìn)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的富里酸向結(jié)構(gòu)復(fù)雜的胡敏酸轉(zhuǎn)化，從而提高腐殖質(zhì)的質(zhì)量.

腐殖化系數(shù)(HI)為胡敏酸與富里酸含量的比值，是評(píng)價(jià)堆肥腐殖化水平的重要標(biāo)準(zhǔn)[24]. 由圖5可知，各處理的HI總體均表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，有別于其他兩個(gè)處理組的是，在第12天以后SB012處理組的HI出現(xiàn)了大幅增加階段，這說(shuō)明與不添加菌劑(CK)和添加液體復(fù)合菌LB012的處理相比，添加固體復(fù)合菌劑SB012能夠促進(jìn)胡敏酸的合成，提高堆肥腐殖化系數(shù). 堆肥結(jié)束后，LB012、SB012、CK處理組的HI分別為1.39、1.71、1.18，與LB012和CK處理組相比，SB012處理組使HI提高了23.02%和44.92%. 而鄭衛(wèi)聰?shù)萚25]研究表明，在為期30 d的堆肥過(guò)程結(jié)束時(shí)，HI僅達(dá)到1.20. 這說(shuō)明添加固體復(fù)合菌劑SB012能夠提升堆肥腐殖化水平，加速堆肥腐熟進(jìn)程.

圖6 堆肥過(guò)程中木質(zhì)素和纖維素降解率的變化情況

2.2.3不同處理對(duì)堆肥木質(zhì)素和纖維素降解的影響

如圖6所示，3組處理的木質(zhì)素和纖維素降解率的變化趨勢(shì)相近，但SB012和LB012處理組明顯優(yōu)于CK處理組，在堆肥結(jié)束時(shí)，與添加液體復(fù)合菌LB012和不添加菌劑(CK)相比，添加固體復(fù)合菌劑SB012可使木質(zhì)素降解率分別提高7.79%和49.74%，纖維素降解率分別提高5.30%和46.82%，可以看出添加固體復(fù)合菌劑SB012更有利于促進(jìn)木質(zhì)素和纖維素的降解. 這可能是因?yàn)?，B01和B02是從腐熟堆肥中篩出的具有降解木質(zhì)素、纖維素能力的功能菌，使得SB012和LB012兩組處理的木質(zhì)素和纖維素降解率明顯高于CK處理組，并且固體菌劑SB012相較于液體菌劑LB012而言更易與堆肥材料混勻[26]，使微生物均勻地生長(zhǎng)于堆體之間，從而能夠更好地發(fā)揮其降解作用. 此外，由于SB012處理組可更高效地促進(jìn)木質(zhì)纖維素降解，加速堆肥腐殖化進(jìn)程，致使在整個(gè)堆肥周期中SB012處理組的腐殖質(zhì)含量始終高于LB012處理組，而腐殖質(zhì)具有增強(qiáng)細(xì)菌的傳輸分散作用[27]，使B01和B02能夠更好地在堆肥顆粒介質(zhì)中擴(kuò)散，更進(jìn)一步促進(jìn)木質(zhì)素纖維素降解，形成良性循環(huán)，加快堆腐速率.

2.2.4堆肥過(guò)程中種子發(fā)芽指數(shù)(GI)的變化情況

研究表明，GI是較可靠地反映堆肥腐熟度的指標(biāo)，GI大于80%的堆肥產(chǎn)品被認(rèn)為完全腐熟[28-30]. 如圖7所示，各處理組的GI均呈上升趨勢(shì)，除CK處理組外，其他兩個(gè)處理組的GI均在80%以上，其中SB012處理組GI的增速較快，在第16天就達(dá)到了83.54%，相對(duì)LB012處理組提前了4 d. 在堆肥結(jié)束時(shí)，與添加液體復(fù)合菌LB012和不添加菌劑(CK)相比，固體復(fù)合菌劑SB012可使GI分別提高5.34%和30.12%. 這說(shuō)明添加固體復(fù)合菌劑SB012能夠有效提高堆肥效率，降低堆肥產(chǎn)品毒性.

圖7 堆肥過(guò)程中發(fā)芽率指數(shù)值(GI)的變化

3 結(jié)論

a) 在篩選最佳固體復(fù)合菌劑過(guò)程中，通過(guò)正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)合比例和復(fù)合菌劑接種濃度均對(duì)菌劑降解效果有極顯著影響，其中復(fù)合比例是主控因子，其次是復(fù)合菌劑接種濃度. 最終得出最佳固體復(fù)合菌劑是復(fù)合比例(B01∶B02)為7.5∶2.5，復(fù)合菌劑接種濃度為2.5%，在該條件下，木質(zhì)素和纖維素降解率達(dá)到最大值并明顯優(yōu)于其他處理組，此時(shí)，木質(zhì)素降解率可達(dá)21.74%，纖維素降解率可達(dá)38.28%.

b) 堆肥結(jié)束時(shí)，與LB012處理組相比，SB012處理組可使腐殖質(zhì)含量提高6.29%，腐殖化系數(shù)(HI)提高23.02%，木質(zhì)素降解率提高7.79%，纖維素降解率提高5.30%，GI提高5.34%；與CK處理組相比，SB012處理組可使腐殖質(zhì)含量提高15.67%，腐殖化系數(shù)(HI)提高44.92%，木質(zhì)素降解率提高49.74%，纖維素降解率提高46.82%，GI提高30.12%. 堆肥試驗(yàn)結(jié)果表明，向園林廢棄物堆肥中添加固體復(fù)合菌劑SB012在一定程度上能夠促進(jìn)有機(jī)物降解，提高堆肥產(chǎn)品品質(zhì).

致謝：在此感謝北京市教育委員會(huì)生態(tài)修復(fù)工程學(xué)高精尖學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目的資助.