酸鋁脅迫土壤中耐鋁大豆根際不同部位細菌群落結構、功能及其對促生菌富集作用的研究

文鐘靈，楊旻愷，陳星雨，郝晨宇，任然，儲淑娟，韓洪葦，林紅燕，陸桂華，戚金亮，楊永華

酸鋁脅迫土壤中耐鋁大豆根際不同部位細菌群落結構、功能及其對促生菌富集作用的研究

文鐘靈，楊旻愷，陳星雨，郝晨宇，任然，儲淑娟，韓洪葦，林紅燕，陸桂華，戚金亮，楊永華

南京大學植物分子生物學研究所，醫(yī)藥生物技術國家重點實驗室，生命科學學院，南京 210023

針對酸性土壤中影響作物生產(chǎn)的主要限制因子(pH及其鋁毒)，選用耐酸鋁且具有固氮能力的豆科作物是改良該類土壤、促進農業(yè)生產(chǎn)的有效措施之一，至于其所關聯(lián)的根際微生物是否起到相應的促進作用，一直為國內外學者所關注和探究。為此，本研究以鋁耐受型大豆品種基因型(BX10)和鋁敏感型大豆品種基因型(BD2)為材料,以酸性紅壤為生長介質,采樣部位按照土層到根系的距離由遠到近的順序劃分為：根外對照土(bulk soil, BS)、兩側根際土(rhizospheric soil at two sides, SRH)、刷后根際土(rhizospheric soil after brush, BRH)和沖洗后的根際土(rhizospheric soil after wash, WRH)。利用Illumina MiSeq對16S rRNA基因擴增產(chǎn)物的高變區(qū)V4進行高通量測序，研究了不同耐鋁基因型大豆根際細菌群落的結構、功能與分子遺傳多樣性的差異性作用。結果表明，各處理間大豆根際細菌群落的alpha多樣性無顯著性差異，beta多樣性差異也均不顯著。PCA和PCoA分析可見BRH和WRH部位的物種組成較為一致，而BS和SRH部位具有相似的物種組成，說明植物生長主要影響根際的BRH及WRH部位的微生物，對SRH影響較小。對各分類水平物種組成和豐度進行比較，門分類水平三元圖表明兩個基因型大豆均在WRH部位富集藍細菌門(Cyanobacteria)細菌；統(tǒng)計分析表明鋁耐受型大豆(BX10)根部對于增強植物抗逆性的植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)有富集作用，這些富集的細菌包括藍細菌門、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)等，以及部分與固氮和耐鋁的功能相關的屬種。另對同一個基因型大豆不同采樣部位間進行比較分析，結果顯示土壤不同采樣部位可以選擇性富集不同的PGPR物種。此外，16S rDNA的同源蛋白簇(clusters of orthologous groups of proteins, COG)功能預測分析的結果表明，多個COG包括COG0347、COG1348、COG1433、COG2710、COG3870、COG4656、COG5420、COG5456和COG5554均可能與固氮直接相關；BD2相比于BX10，結果顯示在BRH和WRH部位似乎均更易富集固氮直接相關的COG，其可能的原因尚待進一步研究。

酸性土壤；耐鋁大豆；根際；細菌群落；植物根際促生菌

在糧食和土地與人口增長之間的矛盾日益尖銳的今天，傳統(tǒng)的耕作栽培技術已經(jīng)根本無法滿足人們的需求，為了促進農業(yè)生產(chǎn)，選用何種適宜的農作物一直是國內外所關注的問題。大豆是世界上重要的蛋白質和油源，在酸性土壤中大量栽培。由于大豆的生物固氮能力，其可以作為優(yōu)良的輪作和間作作物，以提高土壤肥力和結構[1]。全球可耕地的50%為酸性土壤，在中國酸性土壤約占土地總面積的20%[2]。大多數(shù)酸性土壤中，植物生長受到以下幾個因素的限制，包括鋁的毒性水平，以及一些必需元素的如氮(N)、磷(P)和一些微量營養(yǎng)素的不足，導致作物產(chǎn)量低[3]。氮元素是植株生長必需的大量營養(yǎng)元素，自然界的氮主要以氮氣形式存在，無法被植株直接利用[4]，豆科植物與根瘤菌之間所形成的共生固氮體系具有較強的共生固氮能力，這種能力使豆科植物成為自然界氮輸入的重要來源，同時也成為人類食物中蛋白質的重要來源[5]。鋁是酸性土壤作物生產(chǎn)的主要限制因子之一(pH<5)[6]，酸性土壤條件下，鋁以有活性的毒性的形式釋放到土壤溶液中，達到能抑制根系生長或損傷根的水平，進而抑制水分和礦物質的吸收，降低根系活力，降低葉片光合作用，抑制大豆生長[7,8]。植物對鋁毒害的抗性機制很多，如有機物的滲出、根際pH的變化、細胞壁的交換性結合等[9]。植物可以釋放有機酸、酚類化合物、多肽和其他化合物作為根系分泌物，減少酸性土壤中的鋁毒害。有機酸能螯合有毒鋁元素和活化磷元素，鋁毒害和磷缺乏均可激活有機酸的外排[10]，大量證據(jù)表明根系有機酸分泌是植物耐鋁的主要機制[11]。

根際是根的表面和貼近根的周圍的土層，一般指離根軸表面數(shù)毫米范圍之內，是土壤–根系–微生物相互作用的微區(qū)域。根際有益微生物，主要是指對植物生長發(fā)育具有直接或間接促進作用的或對植物根際有害微生物具有拮抗作用的土壤微生物，其中植物根際促生菌(plant growth promoting rhizoba-cteria, PGPR)可以改變土壤中無效礦質元素的形態(tài)，使其更容易被植物吸收利用[12]。

本研究使用的大豆品種為鋁耐受型大豆Baxi 10 (BX10)和鋁敏感型大豆Bendi 2 (BD2)，BX10大豆起源于巴西，比起源于中國廣東的BD2大豆更耐鋁[13]。前者在Al3+處理下受到的根系生長抑制作用比后者輕[14]。這兩個大豆基因型因其不同的耐鋁性而受到廣泛的研究。之前的研究表明，與鋁敏感型大豆BD2相比，鋁耐受型大豆BX10具有更大的檸檬酸鹽流出速率和產(chǎn)量，磷脂脂肪酸在不同時期也存在差異。此外，BX10根際土壤中革蘭氏陰性菌(GN)和革蘭氏陽性菌(GP)的比值與BD2相比存在變化[15,16]。那么，除了植物有機酸分泌這一常見抗酸鋁策略外，鋁耐受型大豆BX10和鋁敏感型大豆BD2的根際會不會通過對于不同微生物的富集(例如各種PGPR)，成為BX10在酸性土壤中獲得更好生長狀態(tài)的又一因素呢？因此，本研究通過對土壤根際微生物的16S rDNA(V4可變區(qū))擴增子進行測序分析，試圖分析BX10和BD2對根際微生物群落和微生物代謝活動的影響，探討大豆根際的不同部位與大豆根際微生物群落之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 植物、土壤材料及取樣方法

本研究選擇兩個基因型的大豆((L.) Merr.)：BX10 (Baxi 10，耐鋁基因型)和BD2 (Bendi 2，鋁敏感基因型)[13]。種植前，我們對大豆種子使用95%乙醇消毒30 s，2.5%次氯酸鈉消毒5 min，并使用無菌水沖洗3~5遍。酸性土壤(pH 4.43，交換性鋁含量為1.45 cmol/kg)取自中國科學院江西鷹潭紅壤生態(tài)試驗站(28.208° N，116.937° E)[17]。本研究中使用的根際箱的具體規(guī)格與本課題組之前報道的一致，專利申請公布號為CN 102175487 A[15,16]。根際箱的具體標準為長200 mm、寬150 mm、深200 mm，在中部種植大豆時，用尼龍薄膜將根際箱分為5個部分，以限制根而不限制水分和營養(yǎng)[18]。本研究在開花期采集土壤樣品(種植后60天)，采樣方法沿用前人的研究并稍作了修改[19,20]。根據(jù)采樣部位到根系的距離由遠到近的土層分為4個部分：根外對照土(bulk soil, BS)、兩側根際土(rhizospheric soil at two sides, SRH)、刷后根際土(rhizospheric soil after brush, BRH)和沖洗后的根際土(rhizospheric soil after wash, WRH)：用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗后，在4000×下離心10 min收集)。所有這些樣本在–80℃下保存用于提取DNA。

1.2 DNA提取及16S rDNA擴增子測序信息

使用PowerSoil DNA分離試劑盒(MoBio Labo-ratories Inc, USA)提取DNA，操作流程與先前研究一致[21,22]。提取DNA后在1%瓊脂糖凝膠上評估DNA樣本的質量，并使用Qubit熒光計(Qubit 2.0, Invitrogen, USA)對樣本進行量化，以盡量減少微生物群落調查中的可變性[23]。對提取后基因組DNA進行檢測，確保每份DNA樣品的濃度皆大于0.4 ng/μL[23]。采用改良后的雙端達到250 nt的高通量測序，使用引物515F(5?-GTGCCAGCMGCCGC-GGTAA-3?)和806R (5?-GGACTACHVGGGTWTCT-AAT-3?)擴增V4區(qū)[24,25]。進行PCR擴增和PCR產(chǎn)物純化的步驟方法如之前文章所述[22,26]。通過華大基因有限公司(中國武漢)在Illumina MiSeq平臺上進行高通量測序。共24個測序數(shù)據(jù)已上傳NCBI，SRA編號為PRJNA 613772 (接收后自動釋放)。

1.3 alpha多樣性及beta多樣性分析

本研究使用Rank-Abundance曲線來解釋物種豐度/均勻度。采用Venn圖和Pan/Core分析方法計算多個樣本中共有/共享的OTU數(shù)目。根據(jù)OTUs和物種注釋結果進行alpha和beta多樣性分析。為了分析環(huán)境中微生物物種多樣性的復雜性，本研究采用alpha多樣性來反映群落豐富度(sobs指數(shù)、Chao指數(shù)和Ace指數(shù))、群落多樣性(Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù))和群落覆蓋度(Coverage指數(shù))，而beta多樣性分析采用QIIME (v1.8.0)計算，然后用不同的距離矩陣對樣本的物種復雜度差異進行評價和對比[27,28]。本研究使用主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)和主坐標分析(Principal Co-ordinates Analysis, PCoA)來研究樣本群落組成的相似性或差異性。三元圖結果分析參照Bulgarelli等人提出的方法[29]。

1.4 功能預測分析和統(tǒng)計分析

16S rDNA的COG功能預測分析分類通過PICRUSt軟件在I-Sanger平臺上進行(http://www. i-sanger.com)。相似性分析(the analysis of similarities，ANOSIM)和置換多因素方差分析(permutational mul-tivariate analysis of variance, PERMANOVA，又稱Adonis分析)使用I-Sanger平臺，利用silva128/16S數(shù)據(jù)庫(http://www.arb-silva.de)根據(jù)最小樣本數(shù)序列對樣本進行抽平。在統(tǒng)計分析中，顯著性差異主要使用單因素方差分析(one-way ANOVA)。整個16S rDNA測序結果的數(shù)據(jù)分析參照了劉永鑫等人介紹的方法[30]。

2 結果與分析

2.1 BX10和BD2根際細菌群落的alpha多樣性總體無差異

在這項研究中，根際箱的設計和使用與本課題組之前的報道一致[15,16]。24個樣品的測序片段總數(shù)為892,331，平均每個樣品約37,180個片段，范圍從36,311~40,950不等。各樣本序列平均長度約為253 bp。Rank-Abundance曲線比較光滑，說明24個樣品的豐度和均勻度較高，測序深度和質量均滿足要求，說明OTU覆蓋了根相關細菌群落中足夠的可檢測物種(附圖1)。Pan分析和Core分析發(fā)現(xiàn)所有樣品共有的物種數(shù)為472，而所有樣品所含物種總數(shù)為3697(附圖2)。

為了比較分析BX10和BD2根際細菌群落的alpha多樣性，研究首先分析了不同alpha多樣性指數(shù)的稀釋曲線。稀釋曲線表明，測序數(shù)據(jù)量合理，數(shù)據(jù)量大，覆蓋率足夠，足以反映絕大多數(shù)微生物多樣性信息。圖1顯示了6個不同alpha多樣性指數(shù)的結果。sobs、Chao和Ace指數(shù)(圖1，A~C)和覆蓋指數(shù)(圖1F)的結果表明，各樣本的群落豐富度和群落覆蓋度無顯著性差異。雖然Shannon指數(shù)(1D)在各樣本間無顯著差異，Simpson指數(shù)(1E)的結果表明，BX_16FWRH的群落多樣性低于BD_16FWRH。

2.2 BX10和BD2根際細菌群落beta多樣性無顯著性差異

Venn圖顯示，每個樣品的OTU數(shù)相似，而BX10和BD2中BS、SRH、BRH和WRH的總共享OTU分別為1581和1582 (附圖3)。此外，BX_16FSRH、BX_16FBRH、BX_16FWRH、BD_16FWRH、BD_16FBRH和BD_16FWRH共有OTU數(shù)目為1437個。通過OTU繪制的PCA和PCoA圖，對比檢測花期BX10和BD2的BS、SRH、BRH和WRH樣品之間OTU組成的差異(圖2)。主成分分析PCA圖表明，同一技術重復的樣品聚為一組，同一取樣部位不同基因型大豆之間未顯著區(qū)分(圖2A)。基于Bray Curtis的主坐標分析PCoA圖表也得到了相同的結果(圖2B)，且BX_16FBRH、BX_16FWRH和BD_16FWRH聚集更緊密?；趙eighted Unifrac距離的PCoA與基于Bray Curtis的PCoA圖表相似，而基于unweighted Unifrac距離的PCoA圖顯示在BX10和BD2根際細菌群落中，BS和SRH距離較近，而BRH和WRH更可能聚集在一個組中(附圖4)。

圖1 Alpha多樣性的箱型圖

A：sobs指數(shù)的alpha多樣性的箱型圖；B：Chao指數(shù)的alpha多樣性的箱型圖；C：Ace指數(shù)的alpha多樣性的箱型圖；D：Shannon指數(shù)的alpha多樣性的箱型圖；E：Simpson指數(shù)的alpha多樣性的箱型圖；F：Coverage指數(shù)的alpha多樣性的箱型圖。BX和BD分別代表耐鋁大豆BX10和鋁敏感大豆BD2；F代表花期；BS、SRH、BRH和WRH分別代表根圍土、兩側根際土、刷后根際土和沖洗后根際土；顯著性檢驗采用單因素方差分析，*表示BX10和BD2組之間存在顯著差異(<0.05)。

圖2 細菌群落豐度的主成分分析和主坐標分析圖

A：細菌群落OTU豐度基于歐氏距離的主成分分析圖；B：細菌群落OTU豐度基于Bray-Curtis距離的主坐標分析圖。詳細處理信息同圖1。

ANOSIM和Adonis分析的結果表明，同一采樣部位，BX10和BD2根際細菌群落的beta多樣性在統(tǒng)計學意義上仍無顯著差異(>0.05)；同時，BX10的4個不同采樣部位之間以及BD2的4個不同采樣部位之間的根際細菌群落beta多樣也均無顯著差異(>0.05) (表1)。

2.3 大豆基因型和采樣部位影響了根際細菌群落各分類水平的組成

根據(jù)樣品的分類分析結果，可以直觀地了解每個樣品在不同的分類層次(門、綱、目、科、屬、種)的細菌群落組成和豐度。本研究首先選取了相對豐富最高的13個主要門分類水平物種進行作圖比較(圖3)。如圖所示，豐度最高的6個門分別是變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微桿菌門(Verrucomicrobia)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)。并且，藍細菌門(Cyanobacteria)在不同采樣部位差異明顯，特別是WRH部位極高(圖3)。

以3個根際采樣部位繪制的三元圖的結果表明，兩種基因型大豆的根部微生物群落，都存在藍細菌門在WRH部位富集的情況(圖4)。因為藍細菌門的豐度在WRH部位的豐度為17.05%和18.92%，其他部位平均豐度僅為3.5%，證明測序結果并未被植物葉綠體嚴重干擾，故藍細菌門豐度數(shù)據(jù)是可信的。

屬分類水平物種組成豐度分析表明，各樣本之間，根瘤菌屬()的豐度無顯著性差異。伯克氏菌屬()在BX_16FBRH中豐度高于所有其他樣品。此外，還存在嗜酸棲熱菌屬()在BD_16FBS顯著高于其他樣本，以及粘液細菌屬()存在BX_16FBRH>BX_ 16FSRH，BD_16FBRH>BD_16FSRH的現(xiàn)象，即在FBSH這個部位對屬存在富集作用(附表1)。

種分類水平物種組成豐度分析可以找到8個種(表2)，分別是埃氏慢生根瘤菌()，約氏不動桿菌()，短波單胞菌()，脆假單胞菌()和放射型根瘤菌()，他們屬于變形菌門；氧化假節(jié)桿菌()和甲基營養(yǎng)節(jié)桿菌()屬于放線菌門，淺綠氣球菌()屬于厚壁菌門(Firmicutes)。統(tǒng)計學分析(one-way ANOVA)的結果表明，的豐度在各樣品之間無顯著性差異，在BD_ 16FWRH中的豐度遠高于BD2的其他采樣部位。、、和都發(fā)現(xiàn)在BD_16FBS的豐度遠高于其他樣本，而和的豐度則有BX_ 16FBRH大于BX10其他樣品的情況。

表1 不同樣品細菌群落結構的統(tǒng)計分析

ANOSIM和Adonis基于Bray Curtis距離進行比較。詳細處理信息同圖1。>0.05表明，同一基因型大豆不同取樣部位和同一取樣部位不同基因型大豆的樣品兩兩對比沒有顯著差異。

圖3 各樣本中相對豐富最高的13個主要門水平物種(>1%)

所選的13個主要門水平物種的相對豐度皆大于1%。詳細處理信息同圖1。

圖4 門分類水平3個根際采樣部位三元圖

A：鋁耐受型大豆BX10根際3個采樣部位三元圖；B：鋁敏感型大豆BD2根際3個采樣部位三元圖。詳細處理信息同圖1。

2.4 鋁敏感型大豆BD2富集與固氮直接相關的功能基因

利用PICRUSt軟件進行16S rDNA的COG (clusters of orthologous groups of proteins，同源蛋白簇)功能預測和分析。如附圖5所示，COG功能的分類組成及其豐度在各處理間并無顯著差異。此外存在幾種豐度較高的功能基因，如氨基酸轉運與代謝(amino acid transport and metabolism)、細胞壁/膜/包膜生物發(fā)生(cell wall/membrane/envelope biogenesis)、信號傳導機制(signal transduction mechanism)等。此外，從COG功能的相對豐度進行比較，COG0347、COG1348、COG1433、COG2710、COG3870、COG4656、COG5420、COG5456和COG5554等9個同源蛋白簇均可能與固氮直接相關(表3)。單因素方差分析進行顯著性檢驗表明，相比于BX10，BD2在BRH中富集COG1433和COG3870，而在WRH中富集COG5420和COG5554。

表2 種分類水平物種在各樣本中的相對豐度

精確到種分類水平共找出8個種，屬于變形菌門、放菌門和厚壁菌門。處理信息同圖1。

3 討論

本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，耐鋁大豆BX10和鋁敏感大豆BD2誘導的根際土壤細菌和有機酸與群落功能有所不同[15,16]。具體體現(xiàn)在，根際土壤有機酸分析表明，BX10提高了檸檬酸的濃度，而BD2降低了檸檬酸的濃度；蘋果酸僅在BX10根際土壤中存在。群落水平的生理分析表明，BX10對有機碳底物代謝能力的影響可能大于BD2。序列分析表明，兩種大豆對一些根際細菌有刺激作用，如不動桿菌()、阿米巴假絲酵母()和未培養(yǎng)的蛋白桿菌(uncultured proteobac-terium)。群落水平的生理分析表明，BX10對有機碳底物代謝能力的影響可能大于BD2。不僅如此，兩種大豆不同時期分泌的有機酸不同，且在不同生長時期，真菌/細菌比例及革蘭氏陰性/陽性菌的比例也各不相同。與BD2相比，BX10的磷脂脂肪酸在苗期和開花期具有較高的多樣性，在結莢期有較低的多樣性[15,16]。以上研究揭示了兩種大豆根際細菌可能與其分泌有機酸有關。而本研究的目的，主要是通過分析高通量測序的結果，研究大豆基因型和宿主生態(tài)位(不同采樣部位)對酸性紅壤中大豆根際細菌群落組成和結構的影響。

表3 固氮相關COG功能分類統(tǒng)計

處理信息同圖1。顯著性差異檢驗采用單因素方差分析，數(shù)字加粗表示BX10和BD2組之間存在顯著差異(<0.05)。

本研究首先進行alpha多樣性指數(shù)的分析，發(fā)現(xiàn)測序數(shù)據(jù)量合理且群落覆蓋度較好。進行顯著性差異分析發(fā)現(xiàn)除卻BX_16FWRH在simpson指數(shù)上略高于BD_16FWRH外，剩下的各指數(shù)中BX10和BD2在相同采樣部位的alpha多樣性無顯著性差異。甚至相同大豆(BX10或BD)對比不同采樣部位也無顯著性差異。對beta多樣性分析的結果同樣發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在同一采樣部位，BX10和BD2根際細菌群落的beta多樣性在統(tǒng)計學意義上仍無顯著性差異；同一基因型的4個不同取樣部位的樣品也無顯著性差異。

Beta多樣性是Whittaker于1960年提出的，定義為群落組成變化的程度，或群落分化的程度，與環(huán)境的復雜梯度或環(huán)境的模式有關[31]。其不僅可以反映樣本之間的多樣性距離關系，而且還可以反映生物群落之間的分化程度。影響細菌群落的beta多樣性的因素很多，而細微的差別(各樣本在具體某些屬、種等的差異)往往會被掩埋在總體的無差異中。因此本研究中著重對比了各分類水平物種的組成和相對豐度。

本研究發(fā)現(xiàn)藍細菌門在不同采樣部位差異明顯，特別是WRH部位極高。做三個根際采樣部位三元圖發(fā)現(xiàn)，兩種基因型大豆的根部微生物群落，都存在藍細菌門在WRH部位富集的情況，而這些細菌多為PGPR。目前已測序的能夠固氮的微生物主要有：變形菌門、藍細菌門、放線菌門、厚壁菌門、綠彎菌門、綠菌門(Chlorobi)及廣古菌門(Euryar-chaeota)[32~35]。藍細菌門可以作為一種天然的生物肥料，在提高土壤肥力，進而提高植物性能方面發(fā)揮著重要作用。有文獻證實，藍細菌門可以幫助植物在脅迫環(huán)境下獲得更好的形態(tài)、生理生化和抗氧化防御系統(tǒng)屬性(生長特性、產(chǎn)量構成、光合效率，增強一系列酶活等)[36]。也就是說，BX10的根部對于藍細菌，或者說這類可以增強植物抗逆性的PGPR，存在一定的富集作用，而BD2從三元圖上來說也有富集的趨勢，卻在統(tǒng)計學意義上沒有顯著差異，這可以從側面說明BX10，或者說可能是BX10的根系分泌物，增強了植物根部對某些有益菌的富集招募作用。也可能是因為所取樣品重復數(shù)不足，誤差的存在導致了顯著性差異的不顯著。

植物根際微生物群落主要由四種細菌組成：放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門[37~42]。本研究首先對厚壁菌門在不同樣本中的豐度進行比較，結果顯示不同樣本中厚壁菌門豐度無顯著變化，說明厚壁菌門在酸性土壤中豐度較低是一個普遍現(xiàn)象，而不是因為種植的大豆和大豆根系的環(huán)境引起的。芽孢桿菌目(Bacillales)屬于厚壁菌門，且其中很多屬種屬于PGPR，結果表明各樣本之間芽孢桿菌目的豐度無顯著變化。最后對屬分類水平一些主要的豐度有差異的物種進行分析(one-way ANOVA)。其他3種被廣泛報道作為根際微生物群落的主要組成的放線菌門，擬桿菌門和變形菌門也進行了顯著性差異分析，發(fā)現(xiàn)放線菌門在各樣本間無差異，而擬桿菌門的BX_16FWRH和BX_16FBRH的豐度顯著高于BX_16FSRH，變形菌門更是存在BX_16FWRH> BX_16FBRH>BX_16FSRH>BX_16FBS的現(xiàn)象，證明變形菌門受根部影響顯著，呈梯度積累富集。

利用本課題組之前從酸性紅壤中分離出一株根瘤菌(命名為)的16S rDNA 測序數(shù)據(jù)，在NCBI網(wǎng)站上進行比對發(fā)現(xiàn)和、以及聚為一支。因此本研究也研究了各采樣部位根瘤菌屬的豐度差異，根瘤菌屬屬于變形菌門(Proteobacteria)，α變形菌綱(Alpha-proteobacteria)。我們發(fā)現(xiàn)同一采樣部位兩個基因型相比，根瘤菌屬的豐度無顯著性差異。這也從側面說明根瘤菌在紅壤中含量穩(wěn)定，所以容易被分離鑒定出來。伯克氏菌屬()屬于變形菌門，β變形菌綱(Beta-proteobacteria)，在BX_16FBRH中豐度高于所有其他樣品。伯克氏菌屬被報道與固氮相關，同時也有研究發(fā)現(xiàn)他們之中有的種屬于耐鋁細菌[43,44]。這可能和BX10相比BD2在酸性土壤中擁有較好的生長優(yōu)勢有關。此外，還存在嗜酸棲熱菌屬(屬于放線菌門)在BD_16FBS顯著高于其他樣品的現(xiàn)象。以及粘液細菌屬(屬于擬桿菌門)，存在FBRH在兩個基因型都顯著高于對應的FSRH (即BX_16FBRH>BX_16FSRH, BD_16FBRH>BD_16FSRH)。即在FBSH這個部位對屬存在富集作用。

精確到種分類水平后我們找到8個種，分別進行了統(tǒng)計學分析。我們發(fā)現(xiàn)，的豐度在各樣品之間無顯著性差異，此菌與腐生代謝/食品腐敗相關[45,46]。而在BD_16FWRH中的豐度遠高于BD2的其他采樣部位。，，和都發(fā)現(xiàn)在BD_16FBS的豐度遠高于其他樣本。其中屬于共生固氮菌，它存在于植物的根瘤，甚至可以進入大豆的根瘤內部，發(fā)揮共生固氮作用。生物固氮提供了生物圈65%的可用氮，是世界上固定大氣氮的最大來源[47]；，參與反硝化作用(deni-trification)[48,49]；即可以作為人類的病原菌，也可以幫助植物緩解砷毒害及促進生長[50,51]；是一種在環(huán)境中廣泛傳播的細菌，臨床上這種細菌與動物和人類的不同疾病有關[52]。和的豐度則有BX_16FBRH大于BX10其他樣品的情況。被報道與具有ACC脫氨酶活性的固氮菌序列相似性達到99.132%[53]，則存在二甲基砜和二甲基亞砜還原酶活性，二甲基砜和二甲基亞砜在自然界中主要存在于海洋和土壤中,在植物生長中作為營養(yǎng)物質被吸收[54]。酸桿菌門雖然也是根際微生物群落的重要組成部分，但是精確到分類水平并未找到屬于酸桿菌門的細菌[55]。三代16S rDNA全長測序相比于二代16S rDNA可變區(qū)片段的測序，其更長的讀長的優(yōu)勢無疑也會在今后研究中起到更大的作用。

16S rDNA的功能預測與分析的結果表明，各樣本在16S功能預測上組成和豐度一致。通過單因素方差分析比較了與固氮有直接關系的COG功能基因在各樣本的豐度，研究發(fā)現(xiàn)在根外對照土中，BX10相比BD2富集COG0347和COG1348。這個現(xiàn)象可能是由于實驗誤差引起的，也有可能是因為耐鋁大豆防止功能冗余而產(chǎn)生的對固氮菌的排斥作用，值得進一步分析。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，BD2相比BX10在刷后根際土中富集COG1433和COG3870，在沖洗后的根際土中富集COG5420和COG5554。這可能是因為發(fā)現(xiàn)不同采樣部位不同基因型各富集不同的與固氮有直接關系的COG功能基因鋁敏感型大豆為了在酸鋁環(huán)境中獲得更好生長狀態(tài)的一種補償機制。

綜上所述，各樣本在alpha多樣性，beta多樣性上無顯著性差異。在同一個基因型大豆不同采樣部位間比較分析表明存在不同部位選擇性富集不同的PGPR的現(xiàn)象。PCA和PCoA分析說明植物生長主要影響根際的BRH及WRH部位的微生物，對SRH部位影響較小，而BRH及WRH部位距離植物根的物理距離相對更近。門分類水平物種豐度進行比較表明，WRH部位存在富集藍細菌門的現(xiàn)象。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)BX10根部對于增強植物抗逆性的PGPR有富集作用，包括藍細菌門、擬桿菌門和變形菌門等，其中部分屬種還與固氮和耐鋁的功能相關，這也能部分解釋為什么BX10可以在酸性紅壤中獲得更好的生長狀態(tài)。最后，16S rDNA的COG功能預測和分析的結果表明，鋁敏感型大豆BD2對于與固氮相關的功能基因存在富集作用，這可能與BD2為了在酸鋁環(huán)境中生長的補償機制相關，還有待進一步研究證實。

附加材料詳見文章電子版www.chinagene.cn。

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Bacterial composition, function and the enrichment of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) in differential rhizosphere compartments of Al-tolerant soybean in acidic soil

Zhongling Wen, Minkai Yang, Xingyu Chen, Chenyu Hao, Ran Ren, Shujuan Chu, Hongwei Han, Hongyan Lin, Guihua Lu, Jinliang Qi, Yonghua Yang

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Low pH with aluminum (Al) toxicity are the main limiting factors affecting crop production in acidic soil. Selection of legume crops with acid tolerance and nitrogen-fixation ability should be one of the effective measures to improve soil quality and promote agricultural production. The role of the rhizosphere microorganisms in this process has raised concerns among the research community. In this study, BX10 (Al-tolerant soybean) and BD2 (Al-sensitive soybean) were selected as plant materials. Acidic soil was used as growth medium. The soil layers from the outside to the inside of the root are bulk soil (BS), rhizosphere soil at two sides (SRH), rhizosphere soil after brushing (BRH) and rhizosphere soil after washing (WRH), respectively. High-throughput sequencing of 16S rDNA amplicons of the V4 region using the Illumina MiSeq platform was performed to compare the differences of structure, function and molecular genetic diversity of rhizosphere bacterial community of different genotypes of soybean.The results showed that there was no significant difference in alpha diversity and beta diversity in rhizosphere bacterial community among the treatments. PCA and PCoA analysis showed that BRH and WRH had similar species composition, while BS and SRH also had similar species composition, which indicated that plant mainly affected the rhizosphere bacterial community on sampling compartments BRH and WRH. The composition and abundance of rhizosphere bacterial community among the treatments were then compared at different taxonomic levels. The ternary diagram of phylum level showed that Cyanobacteria were enriched in WRH. Statistical analysis showed that the roots of Al-tolerant soybean BX10 had an enrichment effect on plant growth promoting rhizobacteria (PGPR), which included Cyanobacteria, Bacteroides, Proteobacteria and some genera and species related to the function of nitrogen fixation and aluminum tolerance. The rhizosphere bacterial community from different sampling compartments of the same genotype soybean also were selectively enriched in different PGPR. In addition, the functional prediction analysis showed that there was no significant difference in the classification and abundance of COG (clusters of orthologous groups of proteins) function among different treatments. Several COGs might be directly related to nitrogen fixation, including COG0347, COG1348, COG1433, COG2710, COG3870, COG4656, COG5420, COG5456 and COG5554.Al-sensitive soybean BD2 was more likely to be enriched in these COGs than BX10 in BRH and WRH, and the possible reason remains to be further investigated in the future.

acidic soil; aluminum-tolerant soybean; rhizosphere; bacterial community; PGPR

2020-11-30;

2020-12-29

國家重點研發(fā)計劃項目(編號：2016YFD0101005)、國家自然科學基金項目(編號：31870495, 31372140)、教育部創(chuàng)新團隊項目(編號：IRT_14R27)資助[Supported by the National Key Research and Development Program of China (No. 2016YFD0101005), the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31870495, 31372140), and the Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University from the Ministry of Education of China (No. IRT_14R27)]

文鐘靈，博士研究生，研究方向：土壤分子微生物學。E-mail: DG1730028@smail.nju.edu.cn

楊旻愷，博士研究生，研究方向：土壤分子微生物學。E-mail: minkaiyang@163.com

文鐘靈和楊旻愷并列第一作者。

楊永華，教授，博士生導師，研究方向：分子代謝與生物技術安全。E-mail: yangyh@nju.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-409

2021/1/28 10:45:54

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20210127.1604.002.html

(責任編委: 孔凡江)