響應(yīng)面法優(yōu)化同步提取黑蒜中多酚與黃酮的工藝及抗氧化活性的測定

鄭清，陳寶印，楊磊，張美蘭，王永強，王瀟瀟

(鹽城工學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051)

黑蒜(black garlic)，是將新鮮大蒜置于高溫、高濕環(huán)境中，因新鮮大蒜自身組織發(fā)生物化變化而形成的大蒜深加工產(chǎn)品，黑蒜的營養(yǎng)成分較新鮮大蒜發(fā)生明顯變化，多糖、蛋白質(zhì)、多酚和氨基酸等含量隨著發(fā)酵時間的增加先上升再緩慢下降，均高于新鮮大蒜的含量[1]。

黑蒜中含有豐富的生物活性物質(zhì)，如低聚糖、多酚、氨基酸等，此類生物活性物質(zhì)賦予黑蒜優(yōu)異的抗氧化、抑菌消炎、增強免疫力等生理功能。黑蒜中的多酚類化合物是指分子結(jié)構(gòu)中含有若干個酚羥基的植物成分的總稱，主要包括黃酮類、酚酸類、單寧類、花色苷類等物質(zhì)。黃酮類化合物是多酚的代謝產(chǎn)物，包含苯環(huán)與酮環(huán)結(jié)構(gòu)的一類化合物，可以分為黃酮類、異黃酮類、黃烷酮類、黃酮醇類等。黑蒜中的多酚類化合物和黃酮類化合物之間存在較多相似的物化性質(zhì)[2-5]。黑蒜中含有的多酚類、黃酮類化合物使得黑蒜具有較強的生物活性，同時展現(xiàn)出良好的保健和藥理作用[6-7]，如殺菌、防流感、腹瀉、強精護肝等作用。

黑蒜中所含的多酚類和黃酮類物質(zhì)經(jīng)物理提取法、化學(xué)提取法等方法均能獲得較高的提取率。黃佳佳等以多酚提取率為評價指標，采用超聲輔助提取技術(shù)對黑蒜中多酚的提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，當提取液中乙醇濃度為20%，料液比為1∶20，超聲頻率為80 kHz，提取時間為40 min時，提取率為(6.15±0.50) mg/g。目前黑蒜中活性成分的研究僅以單一目標物的得率為指標對提取工藝進行優(yōu)化，導(dǎo)致黑蒜中其他活性物質(zhì)的提取效果無法兼顧[8-9]，無法實現(xiàn)黑蒜資源的高效開發(fā)，因此本研究同時以黑蒜中多酚類、黃酮類為優(yōu)化指標，從而實現(xiàn)黑蒜資源的高效、綜合利用。同時，為黑蒜多酚類、黃酮的分離純化和深入研究提供了基礎(chǔ)，并為黑蒜多酚、黃酮類物質(zhì)的生理活性研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

黑蒜：山東軒逸食品有限公司；沒食子酸：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；福林酚、蘆丁、DPPH：上海源葉生物科技有限公司；亞硝酸鈉、水楊酸：上海申翔化學(xué)試劑有限公司；硝酸鋁、硫酸亞鐵：上海山浦化工有限公司；氫氧化鈉：江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、甲醇、水楊酸、抗壞血酸：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1000Y粉碎機 鉑歐五金廠；AE240電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；SB-5200DT超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；GENIUS 16K-M臺式高速離心機 長沙鑫奧儀器儀表有限公司；755S紫外可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；HH-3數(shù)顯恒溫水浴鍋、DHG-9140電熱恒溫鼓風干燥箱 金壇市岸頭科輝儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 原材料的預(yù)處理

取一定量的黑蒜，切成薄片狀，將其放入電熱鼓風干燥箱中60 ℃烘干至恒重，用萬能粉碎機粉碎后過篩，將不同粒度的黑蒜粉放入干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 提取工藝

稱取經(jīng)預(yù)處理的原料(1.00+0.02)g放置于250 mL的錐形瓶中，于30 ℃按一定比例的料液比加入提取溶劑，在規(guī)定的時間進行超聲波輔助提取，提取后經(jīng)離心分離。

1.2.3 黑蒜總多酚含量的測定

以沒食子酸為標準品，用福林酚顯色法處理后，測其在760 nm波長處的吸光度，以沒食子酸含量C(mg/mL)為橫坐標，以對應(yīng)的吸光度值A(chǔ)為縱坐標，制作標準曲線[10]。得到?jīng)]食子酸含量Y(mg/mL)與吸光度A的線性回歸方程為y=13.534x+0.0436，R2=0.9950，對照沒食子酸標準曲線得出提取液中多酚質(zhì)量濃度，最后計算出黑蒜提取液中多酚含量，其公式為：

式中：W為多酚提取量，mg/g；C為福林酚法測定的提取液質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為黑蒜粉末質(zhì)量，g。

1.2.4 黑蒜總黃酮含量的測定

黃酮含量的測定方法：以蘆丁為標準品，用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法處理后，在510 nm波長處測其吸光度[11]，以蘆丁含量C(mg/mL)為橫坐標，以對應(yīng)的吸光度值A(chǔ)為縱坐標，制作標準曲線。 得到蘆丁含量Y(mg/mL)與吸光度A的線性回歸方程為 y=1.1417x-0.0044，R2=0.9937，由標準曲線得出黃酮質(zhì)量濃度，計算得出黃酮含量，公式如下：

式中：W為黃酮提取量，mg/g；C為黑蒜提取液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V為待測液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為黑蒜粉末質(zhì)量，g。

1.2.5 單因素實驗

以黑蒜為原料，利用超聲輔助溶劑浸取法對黑蒜的多酚與黃酮進行提取。

1.2.5.1 溶劑及體積分數(shù)的選擇

準確稱取粒徑大小為100目的黑蒜干粉1.00 g放入離心管中，按料液比為1∶20分別加入體積分數(shù)為20%、40%、60%、80%、100%的甲醇、乙醇、丙酮溶液，超聲提取40 min，3000 r/min離心分離15 min，吸取上清液，測定其多酚、黃酮提取量，確定最佳提取溶劑及體積分數(shù)。

1.2.5.2 超聲時間的選擇

準確稱取粒徑大小為100目的黑蒜干粉1.00 g放入離心管中，按料液比為1∶20加入體積分數(shù)為60%的丙酮溶液，分別超聲提取20，40，60，80，100 min，3000 r/min離心分離15 min，吸取上清液，測定其多酚、黃酮提取量，確定最佳提取時間。

1.2.5.3 料液比的選擇

準確稱取粒徑大小為100目的黑蒜干粉1.00 g放入離心管中，分別按料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入體積分數(shù)為60%丙酮溶液，超聲提取40 min，3000 r/min離心分離15 min，吸取上清液，測定其多酚、黃酮提取量，確定最佳料液比。

1.2.5.4 粒徑大小的選擇

準確稱取粒徑大小分別為20，40，60，80，100目黑蒜干粉1.00 g放入離心管中，按料液比為1∶20加入體積分數(shù)為60%的提取溶劑，超聲提取40 min，3000 r/min離心分離15 min，吸取上清液，測定其多酚、黃酮提取量，確定最佳粒徑大小。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化黑蒜中多酚及黃酮同步提取工藝

根據(jù)單因素結(jié)果，利用Design-Expert 8.0軟件中Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理，以黑蒜中多酚、黃酮提取量為響應(yīng)值，以溶劑濃度、超聲時間、料液比、粒徑大小4個因素3個水平進行響應(yīng)面實驗設(shè)計，見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素水平及編碼值Table 1 The factors and levels of Box-Behnken design

1.2.7 黑蒜體外抗氧化能力的測定

取最優(yōu)工藝下黑蒜提取液分別稀釋至多酚和黃酮總濃度為2，4，6，8，10，12 μg/mL，測定黑蒜提取液對DPPH自由基的清除能力，黑蒜提取液中多酚和黃銅總濃度為40，80，120，160，200，240 μg/mL時測定黑蒜提取液對羥自由基和超氧陰離子的清除能力。

1.2.7.1 黑蒜提取液對DPPH自由基的清除能力

參照趙聰[12]的方法略有改動，取一定濃度的黑蒜提取液2 mL，加入2 mL， 0.2 mmol/L 的DPPH溶液搖勻，置于暗處反應(yīng)30 min，測定其在517 nm波長處的吸光度A1；取黑蒜提取液2 mL，加入2 mL無水乙醇搖勻，測定吸光度A0；分別取蒸餾水和0.2 mmol/L DPPH溶液各2 mL充分搖勻，測定吸光度A2。以樣品濃度對DPPH自由基的清除率繪制曲線，計算清除DPPH自由基的IC50值。以蒸餾水調(diào)零，以同濃度的Vc做陽性對照。

1.2.7.2 黑蒜提取液對羥自由基的清除能力

參照趙鵬雲(yún)[13]的方法略有改動，取1.8 mmol/L FeSO4、1.8 mmol/L水楊酸-乙醇溶液及樣品溶液各1 mL混勻，再加入1 mL 的1.76 mmo1/L H2O2溶液，在37 ℃下恒溫反應(yīng)30 min，測定其在510 nm處的吸光度值A(chǔ)1；取樣品溶液1 mL、乙醇3 mL混勻，測定其在510 nm處的吸光度值A(chǔ)0；以蒸餾水代替樣品溶液測定不加抗氧化劑溶液體系在510 nm處的吸光度值A(chǔ)2。按下式計算不同濃度樣品溶液對羥自由基的清除率，以樣品濃度對羥自由基的清除率繪制曲線，計算清除羥自由基的IC50值。以蒸餾水調(diào)零，以同濃度的Vc做陽性對照。

1.2.7.3 黑蒜提取液對超氧陰離子的清除能力

參照袁磊等[14]的方法略有改動，取Tris-HCl緩沖液4.5 mL、樣品液1 mL及25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.4 mL，混勻后于25 ℃水浴反應(yīng)，在4 min時，向體系中加入8 mmol/L的鹽酸1 mL終止反應(yīng)，在波長320 nm處測定吸光度值A(chǔ)1。實驗中以無水乙醇代替鄰苯三酚溶液的吸光值為A0，以蒸餾水代替樣品溶液的吸光值為A2。按下式計算不同濃度樣品溶液對超氧陰離子的清除率，以樣品濃度對超氧陰離子的清除率繪制曲線，計算清除超氧陰離子的IC50值。以蒸餾水調(diào)零，以同濃度的Vc做陽性對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果采用3次平行實驗的平均值±標準偏差來表示，同時使用SPSS處理軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 不同溶劑及體積分數(shù)對黑蒜中多酚、黃酮提取量的影響

由圖1～圖3可知，隨著溶劑體積分數(shù)的增大，甲醇、乙醇提取多酚的量逐漸減少，丙酮提取多酚的量先增加后減少，可能的原因是黑蒜中多酚類物質(zhì)極性較大，隨著溶劑體積分數(shù)的增加，提取劑極性減小，從而導(dǎo)致對多酚的提取率下降，溶劑體積分數(shù)增加的同時會使其他非極性物質(zhì)與多酚競爭性地溶出，也會使多酚提取量減少；隨著溶劑體積分數(shù)的增大，黃酮提取量先增加后減少，可能的原因是隨著溶劑體積分數(shù)的增大，使黃酮類物質(zhì)與蛋白質(zhì)、多糖等之間的氫鍵遭到破壞，從而使黃酮溶出，當體積分數(shù)繼續(xù)增大時，高濃度溶劑會使蛋白質(zhì)凝固，不利于黃酮溶出。40%丙酮對黑蒜多酚提取效果最好，60%乙醇對黑蒜黃酮提取效果最好。當提取液為40%的丙酮時，黑蒜提取液中多酚和黃酮含量分別為12.41 mg/g和0.36 mg/g，提取液中多酚和黃酮的含量明顯高于40%的甲醇和乙醇提取溶液，綜合考慮，選取丙酮作為提取劑，以體積分數(shù)40%為優(yōu)化中心。

圖1 甲醇體積分數(shù)對多酚、黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of methanol volume fraction on the extraction amount of polyphenols and flavonoids

圖2 乙醇體積分數(shù)對多酚、黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the extraction amount of polyphenols and flavonoids

圖3 丙酮體積分數(shù)對多酚、黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of acetone volume fraction on the extraction amount of polyphenols and flavonoids

2.1.2 超聲時間對黑蒜中多酚、黃酮提取量的影響

由圖4可知，多酚提取量隨著提取時間的增加逐漸增加，可能是時間較短多酚不能完全提取，隨著時間的增加，溶出物逐漸增多；黃酮提取量隨著提取時間的增加先減少后增加，可能的原因是隨著提取時間的增加，超聲過程中黃酮具有的酚羥基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使提取率下降，提取時間繼續(xù)增加，黃酮類物質(zhì)溶出量增多。因此選取80 min為優(yōu)化中心。

圖4 超聲時間對多酚、黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction amount of polyphenols and flavonoids

2.1.3 料液比對黑蒜中多酚、黃酮提取量的影響

由圖5可知，料液比逐漸增加時，多酚、黃酮提取量先增加后減少，可能的原因是在一定范圍內(nèi)增大料液比，黑蒜多酚、黃酮溶質(zhì)間的濃度差增大，有利于物質(zhì)溶出，因此使提取量增加，達到峰值后，料液比繼續(xù)增大會使其他物質(zhì)溶出增多，對多酚，黃酮的溶出形成競爭性抑制，從而阻止多酚、黃酮的溶出，因此選取料液比1∶25為優(yōu)化中心。

圖5 料液比對多酚、黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the extraction amount of polyphenols and flavonoids

續(xù) 表

續(xù) 表

2.1.4 粒徑大小對黑蒜中多酚、黃酮提取量的影響

由圖6可知，隨著粒徑的減小，多酚、黃酮的提取量先增加后減少，可能的原因是隨著粒徑的減小，比表面積增加，有利于多酚、黃酮的充分溶出，當粒徑增加到80目時，黑蒜粉在溶劑中容易粘結(jié)成塊，不宜分散，導(dǎo)致提取量減少。當黑蒜粒徑為60目時，黑蒜取液中多酚和黃酮含量分別為7.78 mg/g和1.00 mg/g，因此選取60目為優(yōu)化中心。

圖6 粒徑大小對多酚、黃酮提取量的影響Fig.6 Effect of particle size on the extraction amount of polyphenols and flavonoids

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化多酚與黃酮的提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析及結(jié)果

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以丙酮為溶劑，選用丙酮濃度(A)、超聲時間(B)、料液比(C)、粒徑大小(D)為自變量，以總多酚、總黃酮為響應(yīng)值進行優(yōu)化響應(yīng)面。實驗方案及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗

用Design Expert 8.0對表2中數(shù)據(jù)進行回歸分析，結(jié)果見表3。

表3 多酚提取量回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model of polyphenol extraction amount

多酚提取量回歸方程為：Y1=12.70+0.63A+1.84B+0.079C+0.25D+0.41AB+0.67AC-0.29AD+0.29BC-0.078BD-0.22CD-1.57A2-0.34B2-1.39C2-0.59D2。

(1)

2.2.3 黃酮提取量回歸模型方差分析

黑蒜黃酮提取量的二次回歸模型方差分析見表4，該模型 P<0.0001(差異極顯著)，回歸系數(shù) R2=0.9588，表明該模型可以95%的匹配數(shù)據(jù)，因此該回歸模型可用于黑蒜黃酮提取工藝條件的預(yù)測和分析。丙酮體積分數(shù)、提取時間、料液比、粒徑大小均對提取效果影響極為顯著；交互因素AB、AC及A2、B2、C2、D2對黑蒜黃酮提取量影響極為顯著。綜合分析各因素P值和F值，可得影響黑蒜黃酮提取量的因素主次為：提取時間>料液比>丙酮體積分數(shù)>粒徑大小，各交互因素中對黑蒜黃酮提取量影響程度最大的為AB，影響程度最小的為AD。

表4 總黃酮提取量回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model of flavonoid extraction amount

黃酮提取量回歸方程為：Y2=1.65+0.059A+0.23B+0.12C+0.047D+0.13AB+0.072AC-0.009937AD-0.065BC-0.067BD+0.023CD-0.18A2-0.099B2-0.21C2-0.11D2。

(2)

對上述兩個回歸模型進行方差分析，見表3和表4。方差分析中，模型的一次項A，B，D，交互項AB、AC、AD、BC，二次項A2、B2、C2、D2對多酚提取率的影響是極顯著的(P<0.01)，交互項CD對酚提取率的影響是顯著的(P<0.05)。在方程(2)中A，B，C，D，交互項AB、AC，二次項A2、B2、C2、D2對黃酮提取率影響是極顯著的(P<0.01)，交互項BC、BD對黃酮提取率的影響是顯著的(P<0.05)。由方差分析結(jié)果可以看出，兩個二次回歸方程整體模型極顯著(P<0.01)，Y1的回歸系數(shù)R2=0.9305，Y2的R2=0.9588，失擬項都不顯著，說明兩個方程擬合較好，數(shù)學(xué)模型穩(wěn)定，可以對不同提取條件下黑蒜的多酚、黃酮提取率結(jié)果進行預(yù)測。

綜合分析各因素的P值和F值，可得影響黑蒜多酚提取量的因素主次為：超聲時間>丙酮體積分數(shù)>粒徑大小>料液比，各交互因素中對黑蒜多酚提取量影響程度最大的為AC，影響程度最小的為BD。可得影響黑蒜黃酮提取量的因素主次為：超聲時間>料液比>丙酮體積分數(shù)>粒徑大小。

2.2.4 響應(yīng)面回歸模型驗證

綜合考慮黑蒜多酚、黃酮提取得率，對響應(yīng)曲面二次回歸方程優(yōu)化結(jié)果進行分析，通過對回歸方程及三維響應(yīng)面圖的綜合分析，得出黑蒜多酚、黃酮的最優(yōu)提取工藝條件為：丙酮體積分數(shù)60%、提取時間96.46 min、料液比1∶24.92、粒徑大小60.91目。為了方便驗證模型的有效性，取丙酮體積分數(shù)60%、提取時間96 min、料液比1∶25、粒徑大小60目，在此工藝條件下得到多酚、黃酮提取量分別為13.31 mg/g和1.71 mg/g(實驗3次取平均值)，響應(yīng)面模型預(yù)測值分別為13.36 g/mg和1.75 g/mg，實驗驗證值與預(yù)測值非常接近，該二次回歸模型能有效地反映各因素對黑蒜多酚、黃酮提取量的影響，該回歸方程可行有效。

2.3 黑蒜提取物抗氧化性比較

2.3.1 黑蒜提取液對DPPH自由基清除能力的測定

黑蒜提取液對DPPH自由基的清除能力見圖7。

圖7 黑蒜提取液和Vc對DPPH自由基的清除能力Fig.7 The scavenging ability of black garlic extract and VC on DPPH free radical注：“*”表示差異顯著(P<0.05)，“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

由圖7可知，黑蒜提取液對DPPH自由基的清除能力很強，且高于同濃度的Vc。黑蒜提取液中多酚、黃酮總濃度和Vc濃度從2 μg/mL增加到12 μg/mL時，其去除DPPH自由基的能力分別從5.5%和2.3%增加到31.7%和16.1%。黑蒜多酚、黃酮和Vc清除DPPH自由基的IC50值分別為18.29 μg/mL和36.32 μg/mL。

2.3.2 黑蒜提取液對羥基自由基清除能力的測定

黑蒜提取液對羥基自由基的清除能力見圖8。

圖8 黑蒜提取液和Vc對羥基自由基的清除能力Fig.8 The scavenging ability of black garlic extract and VC on hydroxyl free radical注：“*”表示差異顯著(P<0. 05)，“**”表示差異極顯著(P<0. 01)。

由圖8可知，黑蒜提取液對羥基自由基有很強的清除能力，且清除能力遠遠高于同濃度的Vc。黑蒜提取液和Vc對羥基自由基的清除能力與其濃度呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。黑蒜提取液中多酚、黃酮總濃度和Vc濃度從40 μg/mL增加到240 μg/mL時，其清除羥基自由基的能力分別從10.2%和2.6%增加到88.0%和16.3%。黑蒜多酚、黃酮和Vc清除羥基自由基的IC50值分別為142 μg/mL和794 μg/mL。

2.3.3 黑蒜提取液對超氧陰離子清除能力的測定

黑蒜提取液對超氧陰離子的清除能力見圖9。

由圖9可知，黑蒜提取液對超氧陰離子有較強的清除能力，且清除能力遠遠高于同濃度的Vc，黑蒜提取液和Vc對超氧陰離子的清除能力與其濃度呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。黑蒜提取液中多酚、黃酮總濃度和Vc濃度從40 μg/mL增加到240 μg/mL時，其清除超氧陰離子的能力分別從8.71%和6.3%增加到57.6%和37.8%。黑蒜多酚、黃酮和Vc清除超氧陰離子的IC50值分別為224 μg/mL和330 μg/mL。

3 結(jié)論

本研究在單因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化同步提取黑蒜中多酚和黃酮，得到最優(yōu)提取工藝條件為：丙酮體積分數(shù)60%、提取時間96 min、料液比1∶25、粒徑大小60目。多酚、黃酮提取量分別為13.31 mg/g和1.71 mg/g，與理論值13.36 mg/g和1.75 mg/g接近。

本研究采用體外抗氧化評價模型，以Vc對照評價黑蒜提取液具有良好的DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子清除能力，隨著黑蒜提取物濃度的增加，其抗氧化能力亦不斷提高。黑蒜提取液中多酚、黃酮總濃度和Vc濃度從2 μg/mL增加到12 μg/mL時，其清除DPPH自由基的能力從5.5%增加到31.7%；黑蒜提取液中多酚、黃酮總濃度和Vc濃度從40 μg/mL增加到240 μg/mL時，其清除羥基自由基的能力從10.2%增加到88.0%；其清除超氧陰離子的能力從8.71%增加到57.6%。在相同濃度下，黑蒜提取物的DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子的清除能力均高于Vc。本研究為黑蒜資源的高附加值開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。