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    硒化蒲公英多糖的制備、結(jié)構(gòu)表征及益生菌促增殖活性

    2021-05-19 02:22:20王麗波高婧宇李騰飛李蓮玉張洪龑徐雅琴
    食品科學(xué) 2021年7期
    關(guān)鍵詞:酸乳淀粉酶蒲公英

    王麗波,高婧宇,李騰飛,李蓮玉,劉 博,張洪龑,楊 昱,徐雅琴

    (東北農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)

    微量元素硒(Se)對(duì)生命活動(dòng)有重要的作用,具有抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、保護(hù)視覺器官、延緩衰老、預(yù)防和治療心血管疾病等活性[1]。硒多糖是一類由硒和多糖結(jié)合而成的重要有機(jī)硒,相比無機(jī)硒,硒多糖的毒性更小,副作用更小[2],且兼具多糖類生物活性,如抗氧化、降血脂、降血糖和抗炎活性等,能夠直接影響人體的生理功能。有研究報(bào)道,硒化修飾可改善多糖的生物活性:曾素娟等[3]對(duì)比了紅芪多糖和硒化紅芪多糖對(duì)口腔癌細(xì)胞SCC25增殖的抑制作用,結(jié)果表明各濃度多糖對(duì)SCC25細(xì)胞增殖的抑制作用均呈時(shí)間依賴性,且在相同條件下,硒化紅芪多糖對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用更強(qiáng);Liu Xuegui等[4]研究了苜蓿中多糖和硒化多糖的抗氧化活性,結(jié)果表明,硒化多糖對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基和2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)陽離子自由基的清除能力強(qiáng)于原多糖,在質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí),硒化多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力與VC相近,表明多糖經(jīng)硒化修飾后具有更好的抗氧化活性。

    蒲公英(Taraxacum mongolicumHand.-Mazz.)是一種藥食同源植物,有“天然抗生素”的美譽(yù),含有多糖、萜類、酚酸、黃酮、香豆素等成分[5]。在上述化合物中,多糖是重要的功能性物質(zhì),已有研究表明蒲公英多糖具有抗炎、抗氧化、抑菌、抗腫瘤、降血糖、抗凝血等功效[6]。如Huang Dan等[7]研究了蒲公英多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力,結(jié)果顯示,當(dāng)質(zhì)量濃度為1.4 mg/mL時(shí),多糖對(duì)DPPH自由基的清除率最高,可達(dá)89.33%,半抑制質(zhì)量濃度為0.51 mg/mL,表明蒲公英多糖具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除活性;李雪石等[8]研究蒲公英多糖對(duì)鏈脲佐菌素致糖尿病模型大鼠餐后血糖水平的影響,測定其血清胰島素水平、葡萄糖灌輸率、以及對(duì)α-糖苷酶體外活性的影響,結(jié)果表明蒲公英多糖具有降低餐后血糖的作用,且作用機(jī)制研究表明,蒲公英多糖可抑制小腸對(duì)麥芽糖的水解和對(duì)葡萄糖的吸收。目前,對(duì)蒲公英多糖的相關(guān)研究尚處于初級(jí)階段,鮮見有關(guān)蒲公英多糖硒化修飾的研究報(bào)道。

    本實(shí)驗(yàn)以蒲公英根為原料,采用硝酸-亞硒酸鈉法制備硒化蒲公英多糖(selenized dandelion root polysaccharide,Se-DRP)。利用高效液相色譜、氣相色譜、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)等多種方法表征多糖結(jié)構(gòu),測定Se-DRP對(duì)益生菌增殖的促進(jìn)作用以及對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用。旨在通過對(duì)Se-DRP結(jié)構(gòu)和活性的研究,探索蒲公英多糖的新應(yīng)用領(lǐng)域,為硒化多糖的深入研究及蒲公英資源開發(fā)提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    蒲公英根購自黑龍江省哈爾濱市藥材店,磨成粉后封袋密封保存,備用。

    纖維素酶(≥50 U/g) 北京奧博興生物科技有限公司;硝酸、亞硒酸鈉、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品、甲醇、三氟乙酸、吡啶、醋酸酐、氯仿、冰醋酸(色譜純) 美國Sigma公司;植物乳桿菌10665、嗜酸乳桿菌 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;大孔吸附樹脂D101、Sephadex G-100 南開大學(xué)化工廠;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    LC-AFS6500型液相色譜原子熒光聯(lián)用儀 北京海光儀器有限公司;WFJ-7200型可見分光光度計(jì)、UV-2700雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;ALPHA-T型傅里葉變換紅外光譜儀、AVANCEIII 400兆NMR波譜儀 德國Bruker公司;2695/2414高效液相色譜儀 沃特世科技(上海)有限公司;GC-2010 plus氣相色譜儀 日本島津公司。

    1.3 方法

    1.3.1 蒲公英多糖的制備與純化

    采用超聲輔助酶法,以去離子水為提取劑,料液比1∶30(m/V)、超聲功率700 W、超聲時(shí)間40 min、纖維素酶添加量0.8%(以蒲公英質(zhì)量計(jì))的條件下提取多糖。提取液經(jīng)過濾、濃縮、體積分?jǐn)?shù)80%乙醇醇沉、凍干后得到蒲公英粗多糖。

    依次采用D101大孔吸附樹脂(3.5 cm×50 cm)和Sephadex G-100(1.8 cm×40 cm)純化蒲公英粗多糖。先后兩次洗脫條件分別為:1)D101大孔吸附樹脂:多糖上樣量為40 mg,去離子水為洗脫劑,洗脫流速2 mL/min;2)Sephadex G-100:多糖上樣質(zhì)量濃度1.0 mg/mL,去離子水為洗脫劑,洗脫流速0.6 mL/min。采用苯酚硫酸法[9]跟蹤檢測洗脫液,將多糖洗脫峰合并,濃縮、凍干后得到純化蒲公英多糖。

    1.3.2 Se-DRP的制備

    用50 mL體積分?jǐn)?shù)為0.5%的HNO3溶液溶解蒲公英多糖(500 mg),在室溫下攪拌30 min,加入0.5 g Na2SeO3和0.7 g BaCl2,將混合物在60 ℃下攪拌,反應(yīng)4 h。冷卻至室溫后,滴加1 mol/L的NaOH溶液將pH值調(diào)節(jié)至7~8。加入0.5 g Na2SO4除去Ba2+,將反應(yīng)物3 500 r/min離心5 min,取上清液,用流水透析至加入抗壞血酸不顯紅色,再用去離子水透析12 h,濃縮、凍干即得到Se-DRP。

    1.3.3 Se-DRP的理化性質(zhì)測定

    1.3.3.1 成分測定

    采用原子熒光光譜法測定硒含量[10],苯酚硫酸法測定多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)[9],2,4-二硝基水楊酸法測定還原糖含量[11],考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量[12],間羥基聯(lián)苯法測定糖醛酸含量[13]。

    1.3.3.2 分子質(zhì)量測定

    配制質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液(3 000、5 000、10 000、40 000、70 000 Da)和Se-DRP溶液,過0.22 μm的微孔濾膜后采用高效液相色譜儀測定分子質(zhì)量。

    色譜條件:檢測器:2414示差折光檢測器;色譜柱:Ultrahydrogel Linear色譜柱(7.8 mm×300 mm,10 μm);柱溫:(35±0.1)℃;流動(dòng)相:超純水;流速:0.6 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL。

    1.3.3.3 單糖組成測定

    稱取20.0 mg Se-DRP于具塞試管中,加入4.0 mL 4 mol/L的三氟乙酸,密封振蕩5 min,在110 ℃條件下水解8 h。反應(yīng)結(jié)束后,加入4 mL色譜級(jí)甲醇輔助氮吹,除盡三氟乙酸。按照參考文獻(xiàn)[14],將單糖標(biāo)準(zhǔn)品和多糖水解物用糖腈乙?;ㄑ苌幚砗?,利用氣相色譜儀分析單糖組成。

    1.3.4 Se-DRP的結(jié)構(gòu)測定

    1.3.4.1 紫外光譜分析

    配制質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的Se-DRP溶液,在200~400 nm的波長范圍內(nèi)掃描。

    1.3.4.2 傅里葉變換紅外光譜分析

    稱取2.0 mg Se-DRP樣品與KBr固體充分研磨后壓片,在4 000~400 cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)掃描。

    1.3.4.3 NMR分析

    將70.0 mg Se-DRP樣品溶于1 mL的D2O,充分振蕩核磁管使其完全溶解,室溫下采用400 MHz NMR儀測定1D-NMR(1H-NMR、13C-NMR)。

    1.3.5 Se-DRP對(duì)益生菌增殖作用分析

    1.3.5.1 培養(yǎng)基的配制

    MRS肉湯培養(yǎng)基的配制:1 L去離子水中加入10.0 g蛋白胨、10.0 g牛肉膏、5.0 g酵母粉、1.0 mL吐溫-80、2.0 g K2HPO4、5.0 g乙酸鈉、2.0 g檸檬酸二銨、0.20 g MgSO4、0.05 g MnSO4,調(diào)節(jié)pH值至6.5(±0.05)。

    MRS固體培養(yǎng)基的配制:將15.0 g瓊脂加入到MRS肉湯培養(yǎng)基中,制得MRS固體培養(yǎng)基。

    增殖培養(yǎng)基的配制:在MRS肉湯培養(yǎng)基中分別添加不同質(zhì)量濃度(0、5、10、15、20 mg/mL)的Se-DRP,以不含碳源的MRS肉湯培養(yǎng)基為空白對(duì)照,低聚果糖(fructo oligosaccharide,F(xiàn)OS)為陽性對(duì)照。

    1.3.5.2 菌種的活化

    將MRS液體培養(yǎng)基用高壓滅菌鍋滅菌(120 ℃、15 min)。無菌環(huán)境下將植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后,將兩個(gè)菌株分別接種于MRS固體培養(yǎng)基上,37 ℃恒溫培養(yǎng)36 h后,分別挑選兩個(gè)菌種的單個(gè)菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中,同樣條件再培養(yǎng)36 h,得到活化菌種。

    1.3.5.3 Se-DRP對(duì)植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌增殖作用分析

    將10 mL不含碳源的MRS液體培養(yǎng)基高壓滅菌。用無菌水溶解Se-DRP和FOS,過0.22 μm微孔濾膜后分別加入到MRS液體培養(yǎng)基中,使糖的終質(zhì)量濃度為0、5、10、15、20 mg/mL。無菌環(huán)境下接種已活化的實(shí)驗(yàn)菌種,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,測定培養(yǎng)液在600 nm波長處的光密度值(OD600nm)。

    1.3.5.4 益生菌生長曲線的繪制

    取干凈無菌的試管若干,各加入10 mL不含碳源的MRS肉湯培養(yǎng)基,滅菌。將200 mg Se-DRP和FOS樣品用少量無菌水溶解后,過0.22 μm濾膜,無菌條件下分別加入到滅菌的MRS肉湯培養(yǎng)基中,使糖的終質(zhì)量濃度為20 mg/mL。無菌條件下分別接種活化的植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。分別在培養(yǎng)的0、4、8、16、24、32、40、48 h取樣,測定液體培養(yǎng)基pH值和600 nm波長處的光密度值(OD600nm),并繪制生長曲線。

    1.3.6 Se-DRP對(duì)α-淀粉酶活性抑制率的測定

    取1.0 mL多糖溶液(質(zhì)量濃度0.2~4.0 mg/mL)與1.0 mLα-淀粉酶溶液(質(zhì)量濃度0.6 mg/mL)和可溶性淀粉溶液(質(zhì)量濃度2.0 mg/mL)充分混合,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)20 min,結(jié)束后,加入5.0 mL的二硝基水楊酸試劑沸水浴5 min,冷卻至室溫,采用紫外-可見分光光度計(jì)測定540 nm波長處的吸光度。以阿卡波糖為陽性對(duì)照,按下式計(jì)算抑制率[15]。

    式中:Ae為樣品、底物和酶的吸光度;Af為樣品和底物的吸光度;Ag為酶和底物的吸光度;Ai為底物的吸光度。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以3 次結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。采用Origin 8.5軟件繪圖,并用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析,差異顯著性分析方法為鄧肯檢驗(yàn),P<0.05為差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Se-DRP的理化性質(zhì)

    經(jīng)兩步柱層析分離后制得的純化蒲公英多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(94.24±0.48)%。Se-DRP的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(93.47±0.75)%,可知硒化修飾后多糖純度基本沒有變化。成分測定結(jié)果表明,Se-DRP中的硒含量為(190.00±0.43)μg/g,糖醛酸含量為(103.80±0.05)mg/g,還原糖含量為(1.40±0.02)mg/g,不含蛋白質(zhì)。

    Se-DRP的分子質(zhì)量采用高效液相色譜測定(圖1A),Se-DRP的洗脫曲線僅為一個(gè)尖銳對(duì)稱峰,表明其分子質(zhì)量分布范圍較窄,為均一多糖。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖回歸方程lgm=-0.624 4x+13.362(R2=0.992 8),代入Se-DRP保留時(shí)間15.14 min,得到Se-DRP的分子質(zhì)量為8 102 Da。Se-DRP的單糖組成由氣相色譜測定(圖1B),相同條件下通過對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品單糖出峰時(shí)間可確定單糖種類。結(jié)果表明,Se-DRP由半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6 種單糖組成,物質(zhì)的量比為0.64∶0.73∶19.36∶0.84∶1.00∶27.41。

    圖1 Se-DRP液相色譜(A)和氣相色譜(B)圖Fig.1 Liquid chromatogram (A) and gas chromatogram (B) of Se-DRP

    2.2 Se-DRP結(jié)構(gòu)

    2.2.1 紫外光譜分析

    由圖2A可知,Se-DRP在260 nm和280 nm波長處均沒有吸收峰,表明Se-DRP中不存在蛋白質(zhì)和核酸等成分。

    2.2.2 傅里葉變換紅外光譜分析

    紅外光譜是分析多糖結(jié)構(gòu)有利的工具,可根據(jù)多糖的特征吸收峰鑒定多糖的結(jié)構(gòu)。Se-DRP的傅里葉變換紅外光譜見圖2B,3 389.51、2 936.71 cm-1波長處對(duì)應(yīng)的吸收峰分別是由O—H、C—H的伸縮振動(dòng)引起的[16],1 745.46 cm-1波長處的吸收峰是由C=O的伸縮振動(dòng)引起的,1 608.33 cm-1波長處的吸收峰是由羧酸中C=O伸縮振動(dòng)引起的[17-18],1 424.08 cm-1波長處的吸收峰是C—H的彎曲振動(dòng)峰[19],1 251.24 cm-1波長處的吸收峰是C—O糖苷鍵的振動(dòng)峰,1 106.98 cm-1和1 026.99 cm-1之間的吸收峰表明有吡喃糖存在,834.16 cm-1波長處的吸收峰表明多糖結(jié)構(gòu)中有α-糖苷鍵[20],759.89 cm-1和638.48 cm-1處的峰歸因于Se=O的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)[19,21]。

    圖2 Se-DRP的紫外光譜圖(A)和傅里葉變換紅外光譜圖(B)Fig.2 Ultraviolet absorption spectrum (A) and Fourier transform infrared spectrum (B) of Se-DRP

    2.2.3 NMR分析

    多糖結(jié)構(gòu)中的糖殘基數(shù)目、糖環(huán)構(gòu)型、異頭構(gòu)型、連接位置等信息可通過NMR分析獲得。1H-NMR和13C-NMR譜圖中多糖的典型信號(hào)分別集中在δH3.0~5.5和δC60~110范圍內(nèi),根據(jù)δH4.0~5.5異頭質(zhì)子和δC90~110異頭碳的共振信號(hào),可判斷多糖的異頭構(gòu)型(α-、β-構(gòu)型)和糖環(huán)構(gòu)型(吡喃糖和呋喃糖)。一般來說,α-構(gòu)型異頭氫質(zhì)子的δ大于5.0,而β-構(gòu)型異頭氫質(zhì)子的δ小于5.0;呋喃糖的C2和C4在δ82~84間有信號(hào),吡喃糖C3和C5的δ一般小于80[22]。

    由圖3A可知,Se-DRP在異頭氫的共振區(qū)域范圍內(nèi)共有6 個(gè)信號(hào)峰,δ分別為4.40、4.56、4.90、5.03、5.18、5.37,確定為3 個(gè)α-構(gòu)型異頭氫質(zhì)子和3 個(gè)β-構(gòu)型異頭氫質(zhì)子[22]。同時(shí)在13C NMR譜圖(圖3B)中,在異頭碳的共振區(qū)域范圍內(nèi),對(duì)應(yīng)有6 個(gè)信號(hào)峰,δ分別為99.54、100.41、103.23、103.68、107.43、109.25。結(jié)合譜圖及文獻(xiàn)[17,23-24],將δ進(jìn)行歸屬,確定組成Se-DRP的主要糖殘基有→6)-β-D-葡萄糖-(1→(H1/C1~H6/C6位移值分別為4.40/103.23、3.43/69.90、3.63/74.29、4.01/70.57、3.95/76.98、3.67/67.94)、→3)-β-D-半乳糖-(1→(H1/C1~H6/C6化學(xué)位移分別為4.56/103.68、3.46/69.90、3.66/79.03、3.43/72.61、3.63/74.29、3.72/61.27)、→5)-α-L-阿拉伯糖-(1→(H1/C1~H5/C5化學(xué)位移分別為5.03/109.25、4.16/81.35、3.87/76.58、4.07/83.85、3.67/68.47)和→4)-α-D-半乳糖醛酸-(1→(H1/C1~H5/C5化學(xué)位移分別為5.37/99.54、3.63/71.41、3.85/73.70、3.74/79.03、4.17/70.57,C6為170.78)。根據(jù)文獻(xiàn)[25-26],δ4.90/107.43和δ5.18/100.41分別歸屬于β-甘露糖和α-鼠李糖。

    圖3 Se-DRP的1D NMR譜Fig.3 1D NMR spectra of Se-DRP

    2.3 Se-DRP對(duì)益生菌增殖的促進(jìn)作用

    益生菌是腸道中一類對(duì)宿主有益,通過維持宿主腸道微生態(tài)平衡,從而對(duì)宿主產(chǎn)生確切健康功效的微生物總稱。雙歧桿菌和乳桿菌是兩類主要益生菌,約占腸道細(xì)菌總數(shù)的25%,包括長雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌10665等[27-28]。研究表明,益生菌有預(yù)防和治療腸道疾病、刺激免疫功能、降低膽固醇和心血管病風(fēng)險(xiǎn)、抗腫瘤、抗癌及抑制病原菌的作用[29]。益生元是一種刺激細(xì)菌生長的化合物,它與機(jī)體的健康有關(guān),能夠降低由微生物區(qū)系改變介導(dǎo)的疾病風(fēng)險(xiǎn)[30]。目前,F(xiàn)OS是公認(rèn)的最有利于益生菌增殖的碳源[31],對(duì)乳桿菌等益生菌具有較好的增殖促進(jìn)作用。如王鑫[32]以FOS為陽性對(duì)照,研究了菜籽多糖及其修飾產(chǎn)物對(duì)嗜酸乳桿菌的益生作用,結(jié)果表明FOS及多糖均具有一定的增殖促進(jìn)作用,且FOS的作用更強(qiáng)。Huang Fei等[33]研究了發(fā)酵前后龍眼果肉多糖對(duì)植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌的益生活性,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后多糖弱于陽性對(duì)照FOS對(duì)菌種的促增殖活性。因此,本實(shí)驗(yàn)采用FOS作陽性對(duì)照,研究Se-DRP對(duì)植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌的促生長作用。

    2.3.1 Se-DRP對(duì)益生菌的促生長作用

    培養(yǎng)液的光密度值(OD600nm)可以衡量菌體數(shù)量變化,OD600nm越大,表示菌液中所含有的菌體數(shù)目越多。由圖4A、B可知,在多糖質(zhì)量濃度5~20 mg/mL范圍內(nèi),植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌的數(shù)量都隨Se-DRP質(zhì)量濃度的增加而增加,表明Se-DRP對(duì)兩個(gè)菌種均有一定的增殖促進(jìn)作用,且菌種的增殖和Se-DRP質(zhì)量濃度之間呈劑量依賴性。當(dāng)質(zhì)量濃度到達(dá)15 mg/mL后,菌種數(shù)量增長趨勢相對(duì)變緩。此外,相同條件下,Se-DRP對(duì)兩個(gè)菌種的促生長作用均弱于FOS。

    圖4 Se-DRP對(duì)植物乳桿菌10665(A)和嗜酸乳桿菌(B)的促增殖活性Fig.4 Effect of Se-DRP on promoting the proliferation of Lactobacillus plantarum 10665 (A) and Lactobacillus acidophilus (B)

    2.3.2 益生菌的生長曲線

    多糖作為碳源在被益生菌代謝利用的過程中,會(huì)被分解為一些單糖,而這些單糖可作為益生元提供能源物質(zhì),促進(jìn)益生菌的生長。同時(shí),益生菌利用多糖代謝會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸,營造酸性環(huán)境,并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,菌體產(chǎn)生的酸不斷增加,培養(yǎng)液的pH值也下降。所以通過測定培養(yǎng)液中pH值的變化,可掌握菌體的增殖狀況[34]。

    由圖5A、B可知,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,接種植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌的Se-DRP和FOS液體培養(yǎng)基OD600nm均明顯上升,在培養(yǎng)36 h后,OD600nm基本維持穩(wěn)定,說明菌落總數(shù)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長不斷增加,在培養(yǎng)36 h后,菌種的生長趨于穩(wěn)定。Se-DRP對(duì)益生菌增殖的促進(jìn)作用可能與其低分子質(zhì)量關(guān)系較大。王霄[35]對(duì)比了菜籽多糖及其酶解產(chǎn)物對(duì)益生菌的增殖促進(jìn)作用,研究結(jié)果表明,酶解后分子質(zhì)量為7 184 Da的多糖對(duì)益生菌生長促進(jìn)作用強(qiáng)于酶解前分子質(zhì)量為52 485 Da的多糖,表明低分子質(zhì)量的多糖可被益生菌更好地利用[36]。

    從培養(yǎng)液pH值與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系曲線可知,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌在Se-DRP培養(yǎng)基和FOS培養(yǎng)基中的pH值均呈下降趨勢,在培養(yǎng)36 h后,pH值趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)橐嫔L過程中分泌的糖苷酶能夠?qū)⒍嗵撬獬蓡误w,然后通過代謝將單體降解成短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸和乳酸)和氣體,從而導(dǎo)致發(fā)酵液的pH值明顯降低。但隨著培養(yǎng)時(shí)間延長,培養(yǎng)基中的碳源基本被消耗,所以益生菌的生長變緩,發(fā)酵液的pH值也趨于穩(wěn)定[37]。

    綜上,Se-DRP對(duì)植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌具有良好的增殖促進(jìn)作用,可視為潛在的益生元。

    圖5 植物乳桿菌10665(A)和嗜酸乳桿菌(B)的生長曲線Fig.5 Growth and acid production curves of Lactobacillus plantarum 10665 (A)and Lactobacillus acidophilus (B) in the presence and absence of Se-DRP

    2.4 Se-DRP對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用

    α-淀粉酶抑制劑通過抑制小腸中糖類水解酶的活性,減少淀粉類食物中葡萄糖的釋放,延緩碳水化合物的吸收。因此,天然的α-淀粉酶抑制劑可作為口服降糖藥。如圖6所示,在質(zhì)量濃度0~1.0 mg/mL范圍內(nèi),Se-DRP和阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率均隨質(zhì)量濃度的增加而增加,當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí),Se-DRP和阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率分別為(48.34±0.96)%和(77.47±1.07)%。隨后二者對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率保持平穩(wěn)。在質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí),Se-DRP的抑制率為(52.34±1.45)%,低于阿卡波糖的抑制率((79.94±1.24)%)。這是由于多糖在低質(zhì)量濃度時(shí),酶過量,每個(gè)多糖分子都可以和酶分子結(jié)合,抑制酶的活性,當(dāng)濃度達(dá)到一定值時(shí),所有的酶分子都已和多糖結(jié)合,再增加多糖的質(zhì)量濃度,抑制率不再明顯升高[38]。

    萬艷娟等[39]報(bào)道了質(zhì)量濃度2.00 mg/mL的南瓜多糖對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率為2.50%。王文武等[38]研究了海藻多糖對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用,結(jié)果顯示,隨著多糖質(zhì)量濃度的增加,其活性抑制率也不斷提高,當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到10.00 mg/mL時(shí),其對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率不再增加,半抑制質(zhì)量濃度為2.85 mg/mL??梢奡e-DRP對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用強(qiáng)于南瓜多糖和海藻多糖,可應(yīng)用于碳水化合物消化調(diào)節(jié)、食品升糖指數(shù)控制。

    圖6 Se-DRP對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of Se-DRP on α-amylase activity

    3 結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)制備了硒含量為(190.00±0.43)μg/g的Se-DRP,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(93.47±0.75)%,由6 種單糖組成,分子質(zhì)量8 102 Da。Se-DRP具有多糖特征吸收峰,主要糖殘基為→6)-β-D-葡萄糖-(1→、→5)-α-L-阿拉伯糖-(1→、→4)-α-D-半乳糖醛酸-(1→和→3)-β-D-半乳糖-(1→。在Se-DRP質(zhì)量濃度為5~20 mg/mL范圍內(nèi),隨多糖Se-DRP質(zhì)量濃度的增加,對(duì)植物乳桿菌10665和嗜酸乳桿菌的生長促進(jìn)作用顯著增強(qiáng),同時(shí)產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物,說明Se-DRP可被益生菌利用,是潛在的低分子質(zhì)量多糖類益生元。在質(zhì)量濃度為0~1.0 mg/mL范圍內(nèi),Se-DRP對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率和質(zhì)量濃度之間呈劑量依賴性,質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí),Se-DRP的抑制率可達(dá)(48.34±0.96)%,表明Se-DRP可作為天然的α-淀粉酶抑制劑應(yīng)用于降血糖藥物或功能性食品。

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