LysR型轉(zhuǎn)錄因子 STM0859對鼠傷寒沙門菌環(huán)境耐受性的調(diào)控作用

馬忠梅，寧程程，李 娜，季春暉， 孟慶玲，喬 軍，張星星，才學(xué)鵬

(1. 石河子大學(xué) 動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003； 2. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所， 新疆石河子 832000；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730046)

鼠傷寒沙門菌(Salmonellaentericasubspecies enterica serovartyphimurium，ST)是一種重要的人獸共患革蘭氏陰性致病菌。人和動物感染該菌后，可引起胃腸炎、敗血癥以及流產(chǎn)等臨床癥狀[1]。ST在世界范圍內(nèi)流行，廣泛存在于自然界中[2]，嚴(yán)重危害畜禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[3]。同時(shí)，作為一種重要的食源性病原菌，該菌可通過動物性食品感染人類，引起食物中毒，給全球食品安全和公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重威脅[4]。ST可以在低溫、高滲、酸性等應(yīng)激環(huán)境下生存，并在一定條件下形成生物被膜來抵抗體內(nèi)外的不利環(huán)境，增強(qiáng)其生存能力[5]。

研究發(fā)現(xiàn)，為適應(yīng)復(fù)雜多變的環(huán)境，ST需要眾多的轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)特定基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。LysR蛋白家族是在原核生物中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子家族，與細(xì)菌群體感應(yīng)、毒力、生物活性控制、生物被膜形成和細(xì)胞分裂等的調(diào)控相關(guān)[6]。生物信息學(xué)分析顯示，ST- STM0859蛋白為新型LysR家族轉(zhuǎn)錄因子。然而，至今國內(nèi)外尚未開展ST- STM0859對ST基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的研究。因此，開展ST-STM0859生物學(xué)功能研究對于揭示ST基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制具有重要科學(xué) 價(jià)值。

λ-Red同源重組技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種基因敲除技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的基因敲除[7]。為了探究LysR家族轉(zhuǎn)錄因子 STM0859對ST環(huán)境應(yīng)激的調(diào)控作用，本研究利用λ-Red同源重組技術(shù)敲除ST-STM0859基因，并檢測分析STM0859基因缺失株對不同脅迫環(huán)境的適應(yīng)能力，探究 STM0859對ST環(huán)境應(yīng)激的調(diào)控作用，為揭示 STM0859調(diào)控ST基因表達(dá)的分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

ST-SL1344強(qiáng)毒株、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、質(zhì)粒pKD46、pKD3和pCP20由石河子大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；TaqDNA聚合酶、dNTPs、pMD19-T載體、T4DNA Ligase和DNA Marker均購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒均購自天根公司；LB肉湯培養(yǎng)基和SS瓊脂培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素、氯霉素均購自北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、蛋白胨和酵母浸出物均購自英國Oxoid生物有限公司；L-阿拉伯糖購自Sigma公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank登錄的STM0859基因序列(登錄號：FQ312003.1)，通過Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)以pKD3質(zhì)粒為模板，5′端含有50 bp的STM0859同源左右臂，3′端與pKD3質(zhì)粒上氯霉素抗性基因同源互補(bǔ)的引物R1和R2；檢測pKD46的特異性引物R3和R4；pCP20驗(yàn)證引物R5和R6；缺失株構(gòu)建后驗(yàn)證及測序引物R7和R8；引物均由北京華大基因生物公司合成(表 1)。

表1 構(gòu)建 STM0859基因缺失株的特異性引物Table 1 Specific primers for construction of STM0859 gene deletion strain of ST

1.3 打靶基因的擴(kuò)增

以pKD3為模板，R1/R2為引物，擴(kuò)增用于敲除STM0859基因的打靶片段。PCR反應(yīng)體系如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，67 ℃退火50 s，72 ℃延伸80 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收，并與pMD19-T(simple)載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR篩選陽性克隆，測序驗(yàn)證。

1.4 ST-SL1344感受態(tài)細(xì)胞的制備及pKD46質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化

挑取ST-SL1344單菌落接種于20 mL LB液體培養(yǎng)基，置于37 ℃，180 r/min過夜培養(yǎng)。以1∶100轉(zhuǎn)接入LB培養(yǎng)基，使OD600達(dá)到 0.4～0.6，制備感受態(tài)細(xì)胞。提取pKD46質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化至ST-SL1344感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子PCR鑒定，作為同源重組的宿主菌。

1.5 打靶片段的電轉(zhuǎn)化

制備SL1344-pKD46感受態(tài)細(xì)胞，將打靶片段轉(zhuǎn)化至SL1344-pKD46感受態(tài)細(xì)胞。電轉(zhuǎn)完成后迅速加入42 ℃預(yù)熱的1 mL SOC培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻后置于37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)2 h，取200 μL菌液涂布于含有Amp和Cm抗性的LB平板(Amp質(zhì)量濃度為100 ng/mL，Cm質(zhì)量濃度為34 ng/mL)，37 ℃恒溫培養(yǎng)，PCR鑒定并篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

1.6 ST- △STM0859缺失株的構(gòu)建與鑒定

制備消除pKD46質(zhì)粒的重組菌ST-△STM0859cat感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)化pCP20質(zhì)粒，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含有Amp和Cm抗性的LB平板，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。PCR鑒定陽性克隆，得到ST-△ STM0859缺失株并進(jìn)行測序驗(yàn)證。

1.7 ST- △STM0859缺失株對環(huán)境應(yīng)激適應(yīng)能力的測定

挑取ST-SL1344和ST-△STM0859單菌落分別接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，調(diào)整菌液濃度使初始菌的OD600≈0.055，于 37 ℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取200 μL菌液測OD600值，連續(xù)測定12 h，觀察其生長速度。以1∶100的比例分別接種于50 mL pH為4、10和含有4%NaCl(%為質(zhì)量體積比)、0.1%H2O(體積分?jǐn)?shù))和3%乙醇(體積分?jǐn)?shù))的BHI液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)；每間隔1 h測其OD600值，繪制生長曲線，觀察 STM0859基因缺失對ST在不同脅迫環(huán)境條件下生長特性的影響。

1.8 STM0859缺失對ST運(yùn)動能力的影響

挑取ST-SL1344和ST-△ STM0859單菌落分別接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，將OD600值調(diào)至1.0，吸取1 μL菌液點(diǎn)樣于LB及pH為4、5和6的0.3%半固體培養(yǎng)基(質(zhì)量體積比)，置于37 ℃靜止培養(yǎng)16 h。通過測量在平板中遷移形成圓圈直徑的大小分析不同pH對其運(yùn)動能力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 打靶基因的擴(kuò)增與pKD46質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化

以pKD3為模板，R1/R2為引物擴(kuò)增大小為1 198 bp的打靶片段，擴(kuò)增產(chǎn)物含有STM0859基因上下游同源臂和Cm抗性基因，條帶大小與預(yù)期一致(圖 1-a)。用特異性引物R3/R4對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，片段大小為1 127 bp，與預(yù)期值大小一致(圖 1-b)，測序結(jié)果證實(shí)pKD46質(zhì)粒電轉(zhuǎn)成功。

2.2 缺失株ST- △ STM0859 的鑒定

將pCP20質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至1344△ STM0859cat感受態(tài)細(xì)胞，用R5/R6引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證(圖2-a)。用檢測引物R7/R8對野生株ST-SL1344和ST-△ STM0859cat攜帶pCP20質(zhì)粒的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，野生株擴(kuò)增出1 146 bp的片段，ST-△ STM0859cat擴(kuò)增出220 bp 片段(圖 2-b)。測序結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)成功構(gòu)建ST-△ STM0859基因缺失株。

2.3 ST- △ STM0859 對不同應(yīng)激環(huán)境的適應(yīng)能力

生長曲線如圖 3所示，以第12小時(shí)為時(shí)間點(diǎn)做差異分析，與親本株ST-SL1344相比，ST-△ STM0859缺失株生長能力與親本株基本一致；在4%NaCl、0.1%H2O2、3%乙醇及pH=10的脅迫環(huán)境中二者生長速度差異不顯著；但在pH=4的酸性應(yīng)激中適應(yīng)能力顯著下降，差異極顯著(P<0.01)。表明STM0859參與ST對酸應(yīng)激環(huán)境耐受的調(diào)控過程。

2.4 ST- △ STM0859 在不同pH半固體中的運(yùn)動能力

運(yùn)動能力檢測結(jié)果顯示，與親本株ST-SL1344相比，ST-△ STM0859缺失株在LB及pH為6的半固體中運(yùn)動能力差異不顯著；但在pH為4時(shí)，ST-△ STM0859缺失株運(yùn)動能力降低(圖 4)，與親本株相比差異極顯著(P<0.01)(圖 5)；提示 STM0859參與對ST在酸性環(huán)境下運(yùn)動能力的調(diào)控。

3 討 論

ST在自然界生存過程中，已經(jīng)進(jìn)化出多種對抗不利環(huán)境的應(yīng)激策略[8]，并利用多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)其生存必需基因(如毒素，黏附素和菌毛)的表達(dá)，以達(dá)到適應(yīng)不同應(yīng)激環(huán)境的目的[9]。ST作為一種重要的消化道致病菌，可在胃中低pH環(huán)境中生存，并侵入腸上皮細(xì)胞引起機(jī)體感染。ST被內(nèi)化后，對細(xì)胞中吞噬溶酶體中的低pH內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生抵抗作用，并在巨噬細(xì)胞中生存和繁殖[10]。因此，感知和響應(yīng)pH變化對于ST的生存至關(guān)重要。有研究報(bào)道，ST可在不同生長環(huán)境中活化多個(gè)低pH誘導(dǎo)的存活系統(tǒng)，在對數(shù)期和固定期發(fā)生的誘導(dǎo)型耐受反應(yīng)可以產(chǎn)生不同的酸性休克蛋白，以防止和修復(fù)大分子在極端酸性條件下受損[11]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，在ST上還存在另一種pH形成穩(wěn)態(tài)的耐酸調(diào)控機(jī)制，即氨基酸脫羧酶系統(tǒng)，能在一定條件下抵抗直接的酸脅迫。

LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子是寡聚細(xì)菌轉(zhuǎn)錄因子的不同家族，遺傳進(jìn)化分析顯示該因子在ST菌株間核苷酸序列上具有同源性和保守性的DNA結(jié)合域，可與靶基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)[12]。LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子是目前發(fā)現(xiàn)的重要轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)家族，廣泛存在于大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌，根瘤菌和陰溝腸桿菌等中。已有的研究顯示，LysR家族在細(xì)菌不同的生長環(huán)境中表達(dá)差異顯著，參與調(diào)控細(xì)菌的代謝、群體感應(yīng)、毒力、運(yùn)動性、氧化應(yīng)激反應(yīng)、毒素產(chǎn)生等[13]。研究肺炎克雷伯菌LysR轉(zhuǎn)錄因子oxyRKP時(shí)發(fā)現(xiàn)，oxyRKP參與調(diào)控該菌的氧化應(yīng)激反應(yīng)、最低抑菌濃度及毒力等[14]。鼠傷寒沙門菌LysR轉(zhuǎn)錄因子OxyR、SpvR、LeuO、CysB參與了氧化應(yīng)激、細(xì)菌嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)、半胱氨酸生物合成、毒力因子合成等[15]。Chen等[16]發(fā)現(xiàn)惡臭假單胞菌LysR轉(zhuǎn)錄因子pnpR正調(diào)節(jié)自身的表達(dá)和pnpC1C2DECX1X2操縱子的表達(dá)；然而其在碳源利用中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用。Fu等[17]發(fā)現(xiàn)，在嗜水鏈球菌中，LysR轉(zhuǎn)錄因子參與了其耐藥性的調(diào)節(jié)。提示LysR型轉(zhuǎn)錄因子對細(xì)菌不同基因的表達(dá)發(fā)揮不同的調(diào)控作用。STM0859蛋白屬于ST -LysR家族轉(zhuǎn)錄因子，其蛋白二級結(jié)構(gòu)含有1個(gè)DNA底物結(jié)合域和1個(gè)由螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋構(gòu)成的HTH-18結(jié)構(gòu)域。序列比較發(fā)現(xiàn)，其N端含有1個(gè)H-T-H超二級結(jié)構(gòu)域，C端具有1個(gè)PBP2配體結(jié)合域，與大腸桿菌和不動桿菌LysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相似。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，利用λ-Red同源重組技術(shù)成功構(gòu)建ST-△ STM0859缺失株，檢測分析ST-△ STM0859在不同脅迫環(huán)境下的生長情況。與親本株相比，在pH為4的酸性環(huán)境下，ST-△ STM0859的生長及運(yùn)動能力明顯降低(P<0.01)，表明ST- STM0859參與ST對酸應(yīng)激的適應(yīng)性調(diào)控，為深入揭示ST-STM0859介導(dǎo)酸調(diào)控的分子機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。