鐵皮石斛SEP基因克隆與表達(dá)的研究

懂陳文華， 鄒玉順， 趙銀河

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院， 昆明 650201)

在擬南芥中，SEPALLATA1(SEP1),SEP1、SEP2、SEP3和SEP4被命名為E-class MADS-box基因[2-3,5-6]。研究表明SEP類SEP1、SEP2、SEP3和SEP4基因不僅在擬南芥花發(fā)育早期表達(dá),還參與四輪花器官的發(fā)育，如果這些基因都突變,四輪花器官變成苞片,表明SEP類基因?qū)ㄆ鞴偬卣鞯恼{(diào)控起重要作用[2-3,5-7]。

圖1 SEP-A全長(zhǎng)基因的電泳

鐵皮石斛為石斛之極品，野生“鐵皮石斛”， 因其表皮呈鐵綠色而得名。鐵皮石斛具有獨(dú)特的藥用價(jià)值，研究發(fā)現(xiàn)石斛有增強(qiáng)體質(zhì)、清熱止痛、強(qiáng)筋健骨、降低血糖、抑制腫瘤、明亮眼目、潤(rùn)養(yǎng)肌膚、延年益壽等功效，被列為“中華九大仙草”之首，民間稱其“救命仙草”。其花器官有特異性，主要產(chǎn)地在云南。本研究以鐵皮石斛花序作為材料，參考張雪梅等[8]的方法進(jìn)行。

1 材料與方法

1.1 材 料

采用材料為鐵皮石斛(Dendrobiumcandidum)花器官，培養(yǎng)液的配置及所需設(shè)備參照文獻(xiàn)[8]。

1.2 方 法

1.2.1RNA的提取

選用TransZol Plant，試劑盒參考張雪梅等[8]的方法，提取鐵皮石斛花器官的RNA，嚴(yán)格按照試劑盒進(jìn)行。

1.2.2特異性引物設(shè)計(jì)

3′-RACE引物參照張雪梅等[8]的方法進(jìn)行。

總之，高職院校應(yīng)當(dāng)確立體育教育在質(zhì)量立校戰(zhàn)略中的應(yīng)有地位，深刻認(rèn)識(shí)并充分發(fā)揮體育教育在人才培養(yǎng)中的重要作用，使每一位學(xué)生都能具備積極的體育精神、良好的運(yùn)動(dòng)能力和健康的運(yùn)動(dòng)行為，促進(jìn)學(xué)生全面發(fā)展。

SEP-A-F 5-AGGGAGAGAAAGAGAAAGAAAT-3；

SEP-A-R 5-ACAAGCCACACAAGTGCATAA-3；

SEP-B-F 5-TGAAAAGTGAGCGAACCAGA-3；

SEP-B-R 5- AACATAATAAGGTAGCAAACAAGAA-3；

1.2.3cDNA的合成

按SMART RACE cDNA Amplication Kit操作流程進(jìn)行，具體方法參考文獻(xiàn)[8]

1.2.4電泳檢測(cè)，割膠回收目的片段

取5 μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆，克隆方法參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，隨機(jī)篩選白色菌落，送北京華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5SEP1基因的表達(dá)

選用TransZol Plant(TransGen Biotech，Beijing，code#ET 121-01)分別提取幼葉、花萼、花瓣、唇瓣以及合蕊柱的RNA，然后進(jìn)行cDNA合成和RT-PCR,其引物序列如下：

SEP-A-F 5-ATCACTCAAGTTAGCACACAGCAA-3；

SEP-A-R 5-CTTAACTTCCACCTAGAGATGTCGT-3；

SEP-B-F 5-AGTAATCAGACAGCCCATCAGC-3；

SEP-B-R 5-TTGGAGCAGTCGTTGGTG-3；

PCR反應(yīng)條件與克隆該基因一樣，參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 RACE的結(jié)果

對(duì)鐵皮石斛不同發(fā)育時(shí)期的花序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[8]，分離出 943 bpSEP-AMADS-box全長(zhǎng)cDNA(如圖1)，包含有完整的編碼框，編碼243個(gè)氨基酸，包含有編碼框5′和3′UTR；同樣分離出1 021 bpSEP-BMADS-box全長(zhǎng)cDNA(如圖2)，包含有完整的編碼框，編碼227個(gè)氨基酸，包含有編碼框5′和3′UTR。

2.2 序列比對(duì)

獲得SEPA基因cDNA 全長(zhǎng)為 926 bp,包含有編碼框,81 bp 5′UTR和161 bp 3′UTR的非翻譯區(qū),具有完整的開(kāi)放閱讀框 (ORF)681 bp,編碼227氨基酸，該基因序列起始密碼子為ATG，如圖3。SEPB基因cDNA 全長(zhǎng)為954 bp,包含有編碼框,39 bp 5′UTR和127 bp 3′UTR的非翻譯區(qū),具有完整的開(kāi)放閱讀框 (ORF) 774 bp,編碼243氨基酸，該基因序列起始密碼子為ATG，如圖4。

2.3 SEP1基因在各個(gè)花器官的表達(dá)

用SEP-A基因靠近3′端的特異引物對(duì)鐵皮石斛開(kāi)花前合蕊柱、唇瓣、花瓣、花萼和幼葉的cDNA模板進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果如圖5，說(shuō)明SEP-A基因在合蕊柱和唇瓣中表達(dá)。

用SEP-B基因靠近3′端的特異引物對(duì)鐵皮石斛開(kāi)花前不同發(fā)育時(shí)期的合蕊柱、唇瓣、花瓣、花萼和幼葉的cDNA模板進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果如圖6，說(shuō)明SEP-B基因在唇瓣、花萼和幼葉中表達(dá)。

圖2 SEP-B全長(zhǎng)基因的電泳

圖3 SEP-A基因的核苷酸序列和編碼的氨基酸序列

3 討 論

本研究以鐵皮石斛為材料分離出SEP-A和SEP-B基因，確定其全長(zhǎng)cDNA序列分別為962 bp和954 bp，編碼227個(gè)和243個(gè)氨基酸。獲得的序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白質(zhì)屬于典型的MADS-box，與從其他植物提取出的SEP基因的同源性很高[3]，因此，具有MADS-box結(jié)構(gòu)域特性和功能[5]。

SEP類基因?qū)儆贓類基因,在高等真雙子葉植物擬南芥中，E-class MADS-box基因包括SEP1、SEP2、SEP3和SEP4，主要參與四輪花器官的發(fā)育[5-6]。從意大利紅門(mén)蘭分離的3個(gè)AGL6 MADS-box基因OIcomP8201,OIcomP 1386和OIcomP 4335，OIcomP 8201和OIcomP 1386主要在唇瓣和花萼中表達(dá)，OIcomP 4335主要在子房和花萼中表達(dá)[9-10]。而在鐵皮石斛中還沒(méi)有研究過(guò)，從鐵皮石斛中分離的基因通過(guò)分析，該基因與其他物種中分離出來(lái)的SEP1的基因同源性很高[10]。在表達(dá)模式上SEP-A主要在合蕊柱和唇瓣中都表達(dá)，SEP-B主要在唇瓣、花萼和幼葉中表達(dá)，可能與蘭科比較復(fù)雜的花器官結(jié)構(gòu)有關(guān)系。

SEP作為膠著蛋白可以與 A、B、C、D類MADS-box蛋白質(zhì)互作，蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的“四元體模型”(FQM)的形成[3,5-6,10]。關(guān)于蛋白的作用關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

圖4 SEP-B基因的核苷酸序列和編碼的氨基酸序列

注：1、2、3、4、5分別為幼葉、花萼、花瓣、唇瓣和合蕊柱。