外周血與尿沉渣microRNA-145 表達(dá)與冠心病患者疾病程度的相關(guān)性研究

魏艷勝，張永春，黃陸力，王學(xué)惠，張俊彪，劉輝

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453100）

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，冠心病(coronary atherosclerotic heart disease，CAD)是指因動(dòng)脈粥樣硬化或動(dòng)力性血管痙攣引發(fā)的冠狀動(dòng)脈器質(zhì)性狹窄、阻塞或供血不足，最終導(dǎo)致心肌缺血缺氧(心絞痛)或心肌壞死(心肌梗塞)等心肌機(jī)能障礙的心臟病，嚴(yán)重威脅人群的身體健康，是全球死亡率最高的疾病之一[1,2]。冠心病的診斷主要依賴(lài)典型的臨床癥狀結(jié)合輔助檢查，證實(shí)心肌缺血或冠脈阻塞的，以及是否有心肌壞死[3]。臨床上治療冠心病的目的是緩解癥狀，減少心絞痛的發(fā)作及冠心??；延緩冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)展，并減少冠心病死亡，早期診斷和合理預(yù)防對(duì)冠心病的治療及預(yù)后具有十分重要的意義。目前臨床上廣泛采用總膽固醇（TC）、 低密度脂蛋白 （LDL-C）、 高密度脂蛋白（HDL-C）、甘油三酯（TG）、B 型利鈉肽前體（Pro-BNP），肌鈣蛋白 I （cTnI）、肌酸激酶同工酶（CKMB）等生化標(biāo)記物來(lái)評(píng)估CAD 患者的疾病發(fā)展情況，然而這些指標(biāo)在非CAD 的敗血癥、肺栓塞等危重疾病患者中亦出現(xiàn)升高[4]。而microRNAs 作為基因表達(dá)的調(diào)節(jié)劑,近年來(lái)已經(jīng)發(fā)展為一個(gè)生物腫瘤治療領(lǐng)域的新靶點(diǎn),廣泛參與并有效涉及多種生物及細(xì)胞的增殖、分化、凋亡代謝自我更新等過(guò)程[5]，國(guó)內(nèi)外研究表明，microRNA-145 在心肌缺血缺氧和復(fù)氧損傷的調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮重要的作用[6]。本研究通過(guò)收集2016 年1 月-2017 年 12 月本院收治的100 例冠心病患者的血清和晨尿,旨在探討血清和尿沉渣 miR-145 用于冠心病診斷、 治療及預(yù)后的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床一般資料 2016 年 1 月-2017 年 12 月本院收治的100 例冠心病患者作為觀察組，診斷標(biāo)準(zhǔn)及入選標(biāo)準(zhǔn)，并依據(jù)NYHA 分級(jí)法進(jìn)行分級(jí)，IIV 級(jí)，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2014 年美國(guó)和歐洲穩(wěn)定性冠心病診治指南的診斷及分類(lèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：冠心病確診為冠脈造影時(shí)左主干、前降支、回旋支、右冠脈或其主要分支的血管直徑狹窄(至少1 支冠狀動(dòng)脈直徑狹窄＞50%)。入選標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)頭CT 排除腦出血及其他腦性疾病;⑵近1 個(gè)月內(nèi)未服用過(guò)任何類(lèi)型的抗凝藥物和影響纖溶活性的藥物,未服用過(guò)任何類(lèi)型的抗生素、激素、非甾體抗炎藥等；⑶患者不具有肝、腎功能不全，貧血、腫瘤，凝血功能異常及自身免疫性疾病、甲狀腺功能障礙等；(4)無(wú)手術(shù)外傷史。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者自愿簽署知情同意書(shū)。以同期98 例于我院行健康體檢者為對(duì)照組。見(jiàn)表1。

表1 兩組對(duì)象一般資料比較

1.2 樣品收集 所有患者均在我科進(jìn)行基礎(chǔ)藥物及溶栓治療：抗血小板、利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）、β 受體阻滯劑等，患者給予臥床休息、吸氧、低鹽低脂飲食、心電及血氧飽和度監(jiān)測(cè)等。清晨空腹采集各組患者靜脈血 5ml，2000rpm/min 離心15min，取上層血清待檢。收集各組患者晨起中段尿10ml,2000rpm/min 離心15min，取尿沉渣用于提取RNA。

1.3 觀察指標(biāo) 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)患者血清中的總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、甘油三酯（TG）、B 型利鈉肽前體（Pro-BNP）,肌鈣蛋白 I （cTnI）、肌酸激酶同工酶 （CK-MB）。Trizol 法提取血液和尿液內(nèi)總RNA，用含有g(shù)DNA 橡皮擦功能的PrimeScriptRT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄, 合成cDNA 進(jìn)行并擴(kuò)增，以U6snRNA 為內(nèi)參照基因，用SYBR Premix Ex TaqII試劑盒按照說(shuō)明書(shū)操作，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量Realtime PCR 分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。分析:通過(guò)計(jì)算miR-145 基因的表達(dá)含量。取1μg 總RNA 利用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，內(nèi)參選用U6。逆轉(zhuǎn)錄引物序列miR-145：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCG AGGTATTCGCACTG -GATACGACCGCGAGG-3'，采用 AB I7000 實(shí)時(shí)定量PCR 儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。RT-PCR 反應(yīng)引物序列miR-145： 上游引物序 5'-GGCTTC GTA CCG TGAGTAAT-3'，下游引物序列5'-GTGC AGGGTC CGAGGT-3'；U6：上游引物系列 5'-GCTTCGGCAG CACATATACTACATATACTAAAAT-3',下游引物序列 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。反應(yīng)體系：95℃孵育 30s，循環(huán)程序共 40 個(gè)循環(huán)，變性95℃，15s；退火 60℃，20s；延伸 70℃，60s。每個(gè)樣本均進(jìn)行三次檢測(cè)，應(yīng)用2-△△CT法計(jì)算miRNA-145的相對(duì)表達(dá)水平并對(duì)其進(jìn)行 log2-△△CT轉(zhuǎn)換，ΔΔCT=實(shí)驗(yàn)組(CTmiRNA-145-CTU6)-對(duì)照組(CT-miRNA-145-CTU6)，采用-ΔΔCT 表達(dá) MicroRNA-145 的相對(duì)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料符合正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，計(jì)量資料結(jié)果用±s 表示，采用單因素方差分析和T 檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)量資料組間差異比較。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（%）表示，組間差異采用卡方檢驗(yàn)，診斷實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)采用ROC 曲線的繪制；miR-145 與冠心病分期及術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系使用兩兩直線相關(guān)性分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入院指標(biāo)檢測(cè)比較 相比于對(duì)照組, 觀察組miRNA-145 含量升高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組對(duì)象入院指標(biāo)檢測(cè)比較

2.2 觀察組血清內(nèi)miR-145 mRNA 含量表達(dá) 隨著NYHA 分級(jí)加重，患者血清中的miR-145 mRNA 含量表達(dá)顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?；颊卟捎贸Ｒ?guī)方法治療后，患者血清中的miR-145 mRNA 含量表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 觀察組血清內(nèi)miR-145 mRNA含量表達(dá)

2.3 觀察組尿沉渣中miR-145 mRNA 含量表達(dá)隨著NYHA 分級(jí)加重，患者尿沉渣中的miR-145 mRNA 含量表達(dá)顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?；颊卟捎贸Ｒ?guī)方法治療后，患者尿沉渣中的miR-145 mRNA 含量表達(dá)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4。

2.4 血清及尿沉渣中miR-145 診斷價(jià)值 觀察組血清miR-145 診斷曲線下面積AUC 為0.79，靈敏度為75.00%，特異性為80.00%。觀察組尿沉渣中miR-145 診斷曲線下面積AUC 為0.62，靈敏度為65.00%，特異性為72.00%，見(jiàn)表5。

表4 觀察組尿沉渣中miR-145 mRNA含量表達(dá)

表5 血清及尿沉渣中miR-145 診斷價(jià)值

2.5 血清及尿沉渣中miR-145 與觀察組疾病程度的相關(guān)性 隨著冠心病患者NYHA 分級(jí)的加重，觀察組血清及尿沉渣中miR-145 mRNA 含量與患者疾病程度呈明顯負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表6。

表6 血清及尿沉渣中miR-145 與觀察組疾病程度的相關(guān)性

2.6 血清及尿沉渣中miR-145 與觀察組冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性 隨著冠心病患者NYHA 分級(jí)的加重，觀察組血清及尿沉渣中miR-145 mRNA含量與患者 TC、LDL-C、CK-MB、CTnl 及 Pro-BNF含量呈明顯負(fù)相關(guān)，與患者HDL-C 和TG 含量呈明顯正相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表7。

表7 血清及尿沉渣中miR-145 與觀察組冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性

3 討論

近年來(lái)，大量研究表明miRNA 表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)足以引起一些特異性的心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展，包括促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖和凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程[8]。miR-145 是血管內(nèi)皮上的特殊的miRNA,其靶基因 Ephrin-A3 是 VEGF介導(dǎo)血管新生信號(hào)通路的重要信號(hào)分子,參與調(diào)控Hif-1a-VEGF 信號(hào)通路，miR-145 在心梗后的血管發(fā)生和維持血管的完整性上起著重要作用[9,10]。

miR-145 位于染色體 11p15.5 染色體上AK123483 基因轉(zhuǎn)錄生成的非編碼 RNA 內(nèi)含子內(nèi)，是當(dāng)前公認(rèn)的缺氧特異miRNA，是目前科學(xué)界公認(rèn)的一種特異性缺氧miRNA，亦能夠在機(jī)體缺氧的情況下用于調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成的關(guān)鍵因素[11]。在機(jī)體處于缺氧和受 Hif1-a 直接刺激條件下,miR-145 的表達(dá)穩(wěn)定增加,通過(guò)抑制 EphrinA3，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞形成血管, 促進(jìn)血管新生, 能促進(jìn)VEGF 誘導(dǎo)的HUVECs 遷移,這對(duì)促進(jìn)血管再生有重要作用[12,13]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[14]，尿沉渣中的miRNA具有更好的抗解性，能夠在室溫下長(zhǎng)期儲(chǔ)存，甚至能夠多次凍融。本研究結(jié)果表明，隨著冠心病患者NYHA 分級(jí)的加重,觀察組血清和尿沉渣miR-145 mRNA 含量表達(dá)顯著下降；患者采用常規(guī)方法治療后，觀察組血清和尿沉渣miR-145 mRNA 含量表達(dá)顯著升高，說(shuō)明miR-145 的表達(dá)受缺氧誘導(dǎo)，調(diào)控缺氧反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá),有效提示患者機(jī)體內(nèi)的缺血缺氧性損傷。曾令勇[15]等人亦研究miR-145在心肌梗死大鼠心肌組織中的表達(dá)明顯下降，上調(diào)miR-145 表達(dá)可抑制心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡。此外本研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)顯示，觀察組血清及尿沉渣中miR-145 mRNA 含量與患者疾病程度呈明顯負(fù)相關(guān)； 觀察組血清及尿沉渣中miR-145 mRNA 含量與患者 TC、LDL-C、CK-MB、CTnl 及 Pro-BNF 含量呈明顯負(fù)相關(guān)，與患者HDL-C 和TG 含量呈明顯正相關(guān)，說(shuō)明miR-145 表達(dá)與患者的治療及預(yù)后情況明顯相關(guān),可有效提示觀察組冠心病及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的損傷程度。同時(shí)，觀察組血清miR-145 診斷曲線下面積AUC 為0.78，靈敏度為75.00%, 特異性為80.00%。觀察組尿沉渣中miR-145 診斷曲線下面積AUC 為0.64，靈敏度為65.00%, 特異性為72.00%。說(shuō)明血清和尿沉渣miR-145 在診斷的特異性及敏感性方面有一定的優(yōu)勢(shì),預(yù)示著血清和尿沉渣miR-145 可能作為判斷冠心病的無(wú)創(chuàng)診斷指標(biāo)。

綜上所述,血清和尿沉渣miR-145 可用于作為診斷冠心病的生物學(xué)標(biāo)志物,對(duì)于臨床判定冠心病患者分期、治療及復(fù)發(fā)具有重要的輔助作用。