對(duì)SPRINTERXL/Europattern系統(tǒng)檢測(cè)抗核抗體性能驗(yàn)證

陳甜甜，張春雷，占葆娥，曾學(xué)輝，張書(shū)楠，陳桂冰

（深圳市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518001）

間接免疫熒光法 （indirect immunofluorescence，IIF）法是檢測(cè)抗核抗體(（Antinuclear Antibody，ANA)的參考方法和首選方法[1]。而 IIF 手工操作模式容易受到試劑、操作、顯微鏡、判讀經(jīng)驗(yàn)、質(zhì)量控制和滴度系統(tǒng)等多方面的影響，較難實(shí)現(xiàn)結(jié)果互認(rèn)。SPRINTER XL+Europattern 全自動(dòng)熒光免疫分析系統(tǒng)，是歐蒙醫(yī)學(xué)診斷（中國(guó)）推出的全自動(dòng)間接免疫熒光操作/酶聯(lián)免疫一體機(jī)和全自動(dòng)免疫熒光核型及滴度判讀系統(tǒng)。本研究依據(jù)WS/T 505-2017《定性測(cè)定性能評(píng)價(jià)指南》[2]和《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在臨床免疫學(xué)定性檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》[3]的具體要求，在全自動(dòng)熒光免疫分析系統(tǒng)的基礎(chǔ)上建立抗核抗體性能驗(yàn)證的方案，對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)檢出限、診斷符合率和精密度（批內(nèi)精密度和中間精密度）進(jìn)行評(píng)價(jià),具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本 收集近4 年衛(wèi)生部臨檢中心室間質(zhì)評(píng)樣本1511-1515,1521-1525,1611-1615,1621-1625,1711-1715，1721-1724，1811,1813,1814,1821,1822，健康體檢人群陰性樣本8 例。ANA 顆粒陽(yáng)性樣本1 例（滴度 1:1000），顆粒弱陽(yáng)性樣本 1 例（滴度 1:100），均質(zhì)弱陽(yáng)性樣本 1 例（滴度 1:100）。所有患者均簽署知情同意書(shū)。WHO 參考血清，WHO 66/233 ANA 核均質(zhì) 100 IU/ml；陰性質(zhì)控品，批號(hào)201801001，北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司；陽(yáng)性質(zhì)控品（核顆粒），批號(hào)20180918，廣州市康潤(rùn)生物制品開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 儀器和試劑 儀器：全自動(dòng)熒光免疫分析系統(tǒng)（SPRINTER XL+Europattern，歐蒙醫(yī)學(xué)診斷(中國(guó))有限公司）；試劑：抗核抗體IgG 檢測(cè)試劑盒（間接免疫熒光法），批號(hào) CF171031AE，歐蒙(杭州)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司。

1.3 操作方法

1.3.1 檢出限驗(yàn)證

1.3.1.1 實(shí)驗(yàn)方案 將100IU/ml 的WHO 參考血清用PBS 按照1:2,1:3,1:4 稀釋?zhuān)瑢㈥?yáng)性檢測(cè)結(jié)果最低稀釋度（稀釋度1:3，濃度33.33IU/ml）每天檢測(cè)4次，連續(xù)檢測(cè)5d，計(jì)算陽(yáng)性檢出率。

1.3.1.2 判斷標(biāo)準(zhǔn) 陽(yáng)性檢出率≥95%的稀釋倍數(shù)對(duì)應(yīng)的濃度為改檢測(cè)系統(tǒng)的檢出限。

1.3.2 診斷符合率驗(yàn)證

1.3.2.1 實(shí)驗(yàn)方案 用全自動(dòng)熒光免疫分析系統(tǒng)收集并檢測(cè)衛(wèi)生部近年室間質(zhì)評(píng)血清34 例（其中陽(yáng)性樣本20 例，陰性樣本14 例。全部樣本室溫自然解凍，離心取上清，實(shí)驗(yàn)前由2 名具有10 年以上工作經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員手工檢測(cè)復(fù)核，結(jié)果與往年室間質(zhì)評(píng)上報(bào)結(jié)果一致方能入選），體檢陰性樣本6 例，評(píng)估符合率。

1.3.2.2 判斷標(biāo)準(zhǔn) 陰性符合率≥80%，陽(yáng)性符合率為≥80%。

1.3.3 精密度驗(yàn)證

1.3.3.1 精密度驗(yàn)證方案 選取抗核抗體陰性樣本2 份、弱陽(yáng)性樣本2 份、陽(yáng)性樣本1 份共5 份樣本。每份樣本同時(shí)檢測(cè)20 次計(jì)算陰陽(yáng)性符合率評(píng)估批內(nèi)精密度；5 份樣本每天檢測(cè)4 次，連續(xù)檢測(cè)5天計(jì)算陰陽(yáng)性符合率評(píng)估中間精密度。

1.3.3.2 判斷標(biāo)準(zhǔn) 陽(yáng)性血清檢測(cè)的結(jié)果，要求特異性、熒光強(qiáng)度基本一致（不超過(guò)一個(gè)梯度），陰性血清檢測(cè)的結(jié)果為陰性。

1.3.4 質(zhì)控 每批次實(shí)驗(yàn)須同時(shí)檢測(cè)陰、 陽(yáng)性質(zhì)控品及陰、陽(yáng)性對(duì)照。質(zhì)控品和對(duì)照結(jié)果應(yīng)與預(yù)期結(jié)果一致，否則應(yīng)重新實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 結(jié)果判讀 樣本、 質(zhì)控品和對(duì)照嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)由SPRINTER XL 完成稀釋及加樣、 洗板，封片，由Europattern 自動(dòng)判讀結(jié)果，并由2 名工作10年以上的檢驗(yàn)醫(yī)生復(fù)核，以人工復(fù)核的結(jié)果為準(zhǔn)。

1.4 結(jié)果統(tǒng)計(jì) 最低檢出限采用IU/ml 表示，符合率和精密度采用百分率表示。

2 結(jié)果

2.1 檢出限驗(yàn)證結(jié)果

表1 檢出限驗(yàn)證結(jié)果

2.2 診斷符合率驗(yàn)證結(jié)果

2.3 精密度驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

ANA 陽(yáng)性常見(jiàn)于系統(tǒng)性或器官性自身免疫性疾病，也可見(jiàn)于感染、 腫瘤患者以及部分健康人群，檢測(cè)ANA 對(duì)自身免疫性疾病的診斷、鑒別診斷、 分型以及活動(dòng)性監(jiān)控都有重要意義。IIF 檢測(cè)ANA 采用的檢測(cè)基質(zhì)為人喉癌上皮細(xì)胞，其抗原成份豐富，可以檢測(cè)大量自身抗體[4]，在臨床被廣泛采用。但目前國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)現(xiàn)狀看，基于IIF方法檢測(cè)ANA 的性能驗(yàn)證研究較少、性能驗(yàn)證方案尚未形成共識(shí)、不同實(shí)驗(yàn)室之間ANA 滴度結(jié)果的可比性差，缺乏統(tǒng)一的規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)，較難實(shí)現(xiàn)臨床不同醫(yī)療機(jī)構(gòu)之間的檢驗(yàn)結(jié)果互認(rèn)。近年衛(wèi)生部室間質(zhì)評(píng)回報(bào)結(jié)果也顯示ANA 準(zhǔn)確率高，但滴度結(jié)果實(shí)驗(yàn)室之間可比性差[5-8]。

CNAS-CL02-A004：2018 《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》對(duì)定性實(shí)驗(yàn)性能驗(yàn)證提出要求，實(shí)驗(yàn)室至少應(yīng)對(duì)檢出限和符合率進(jìn)行驗(yàn)證。檢出限是由給定測(cè)量程序得到的測(cè)得量值，對(duì)于此值，在給定聲稱(chēng)物質(zhì)中存在某成分的誤判概率為α 時(shí),聲稱(chēng)不存在該成分的誤判概率為β，表明檢測(cè)系統(tǒng)識(shí)別陰、陽(yáng)性的濃度，但目前ANA 多數(shù)廠家試劑說(shuō)明書(shū)并沒(méi)有這個(gè)參數(shù)。本研究采用WHO 參考血清做梯度稀釋?zhuān)軌蜉^準(zhǔn)確的反應(yīng)檢測(cè)系統(tǒng)的檢出限，適用于不同實(shí)驗(yàn)室、 不同方法學(xué)和不同試劑廠家之間進(jìn)行比對(duì)。符合率是檢測(cè)系統(tǒng)最主要的性能參數(shù)，本研究主要采用衛(wèi)生部室間質(zhì)評(píng)樣本進(jìn)行符合率驗(yàn)證，并參照室間質(zhì)評(píng)合格標(biāo)準(zhǔn)，擬定了驗(yàn)證合格標(biāo)準(zhǔn)為大于等于80%。在符合率驗(yàn)證過(guò)程中，筆者不建議自己留樣，應(yīng)選擇國(guó)家衛(wèi)生部臨檢中心、各省市臨檢中心室間質(zhì)評(píng)樣品、 可朔源的企業(yè)參考品或?qū)I(yè)公司的全球質(zhì)評(píng)樣本、 或來(lái)源其它已通過(guò)15189 認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室。

表2 診斷符合率驗(yàn)證結(jié)果

表3 精密度（重復(fù)性）驗(yàn)證結(jié)果

ANA 檢測(cè)的自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化、信息化及實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果互認(rèn)是實(shí)驗(yàn)室的發(fā)展趨勢(shì)。本研究中探討ANA 的性能驗(yàn)證方案建立在歐蒙全自動(dòng)熒光免疫分析系統(tǒng)（SPRINTER XL+Europattern）的平臺(tái)上，該檢測(cè)系統(tǒng)的自動(dòng)化及標(biāo)準(zhǔn)化程度很高，具有很多優(yōu)點(diǎn)。第一，研究中對(duì)陰性、1:100，1:1000 兩種不同滴度不同核型樣本進(jìn)行批內(nèi)、 批間多次檢測(cè)，檢測(cè)滴度和核型一致率100%，表明該檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)具備良好的重復(fù)性，結(jié)果判讀識(shí)別穩(wěn)定。第二，近期在該檢測(cè)系統(tǒng)與人工判讀的比對(duì)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，判讀系統(tǒng)與人工判讀在單一核型和復(fù)合核型都有較高的一致性[10]，表明該系統(tǒng)自動(dòng)判讀結(jié)果穩(wěn)定可靠，具備良好的準(zhǔn)確性。第三，該判讀系統(tǒng)采用透射光LED 光源，光源壽命長(zhǎng)，使用壽命內(nèi)光強(qiáng)穩(wěn)定、無(wú)衰減，克服傳統(tǒng)汞燈光源自然衰減過(guò)程中引起的滴度判讀差異。筆者認(rèn)為，只有建立在一個(gè)可靠分析系統(tǒng)基礎(chǔ)之上的性能驗(yàn)證方案才能夠有效保證實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)質(zhì)量。歐蒙全自動(dòng)熒光免疫分析系統(tǒng)（SPRINTER XL+Europattern）克服了傳統(tǒng)的手工操作在不同實(shí)驗(yàn)室之間或同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部不同員工操作精度和主觀判斷的影響,保證了準(zhǔn)確性和重復(fù)性，值得推廣。

目前,ANA 檢測(cè)的臨床篩查價(jià)值越來(lái)越大[11-17],在持續(xù)推進(jìn)ANA 檢測(cè)質(zhì)量的過(guò)程中，還有大量的工作需要同步推進(jìn)。第一，ANA 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化在制度上必須保證對(duì)技術(shù)人員的標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn),如衛(wèi)生部臨檢中心及各省市臨檢中心等職能部門(mén)不斷規(guī)范ANA 檢測(cè)滴度稀釋系統(tǒng)。第二，不斷改進(jìn)室間質(zhì)評(píng)方案，室間質(zhì)評(píng)樣本應(yīng)包括《抗核抗體檢測(cè)的臨床應(yīng)用專(zhuān)家共識(shí)》 建議的13 種必報(bào)核型以及15 種選報(bào)核型[1]，對(duì)難以收集的樣本可采用圖片等方式不斷提高實(shí)驗(yàn)室判讀水平[9]等。第三，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部應(yīng)加強(qiáng)對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的性能驗(yàn)證和人員比對(duì)。只有規(guī)范化的培訓(xùn)和標(biāo)準(zhǔn)化的操作,才能夠持續(xù)不斷的提高和保證實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量。

綜上所述，SPRINTER XL+Europattern 全自動(dòng)熒光免疫分析系統(tǒng)自動(dòng)化程度高，判讀準(zhǔn)確，排除了手工操作和主觀判讀等因素影響，驗(yàn)證結(jié)果表明各性能指標(biāo)能夠滿足要求，此檢測(cè)系統(tǒng)能夠適用于臨床檢測(cè)，應(yīng)大力推廣。