miR-200a以及上皮性卵巢癌病理特征、預(yù)后的關(guān)系研究

薛艷軍，林麗紅 ，高雁榮 ，馬媛 ，韓金利

（安陽市腫瘤醫(yī)院1.婦科；2.檢驗科，河南 安陽 455000）

臨床上上皮性卵巢癌的發(fā)病率或者病死率均維持在較高的水平，在具有相關(guān)家族史的群體中，上皮性卵巢癌的發(fā)病率可顯著的上升[1,2]。通過對于上皮性卵巢癌臨床預(yù)后的評估,能夠為上皮性卵巢癌的診療提供參考?；蛘{(diào)控因子或者微小RNA因子,能夠在惡性腫瘤的發(fā)生及中晚期病情進展過程中發(fā)揮作用。其中微小 RNA-200a（miR-200a），能夠在癌基因的激活,腫瘤基因上游轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控等方面發(fā)揮作用,進而影響到腫瘤細胞的增殖調(diào)控。miR-200a 還能夠影響到腫瘤細胞內(nèi)信號通路的激活，進而影響到癌細胞的生物學特征[3,4]。部分研究者探討了miR-200a 在其他惡性腫瘤患者中的表達情況, 認為在相關(guān)惡性腫瘤患者中,miR-200a 的高擴增表現(xiàn)能夠顯著促進患者病情的進展[5]，但在卵巢癌中的分析不足。為了揭示miR-200a的表達與卵巢癌的關(guān)系,本次研究選取在本院病理科經(jīng)病理學檢查證實的卵巢癌組織標本120 例，探討了miR-200a 的表達及其與卵巢癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料 選取在本院病理科經(jīng)病理學檢查證實的卵巢癌組織標本120 例 (惡性組)、120 例卵巢良性腫瘤組織標本(良性組),組織標本收集時間2012年4 月-2015 年7 月：⑴上皮性卵巢癌患者的診斷標準參考中華醫(yī)學會婦產(chǎn)科學分會制定的標準[6]；⑵卵巢癌組織來源于手術(shù)后，經(jīng)病理學檢查證實，均為上皮性卵巢癌；⑶患者手術(shù)前未接受放化療、免疫學治療；⑷一般資料、病理學資料完整；⑸本研究符合醫(yī)學倫理委員會的相關(guān)要求。排除標準：⑴合并盆腔、腹腔其他類型腫瘤；⑵生殖系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、盆腔感染性疾??；⑶自身免疫性疾病、類風濕性疾病。

惡性組，年齡 42～68 歲，平均 57.1±7.0 歲；國際婦產(chǎn)聯(lián)盟分期（FIGO）標準：Ⅰ期22 例、Ⅱ期58例、Ⅲ期38 例、Ⅳ期2 例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35 例；組織學分化程度：高分化20 例、中分化48 例、低分化52 例；病理學類型：漿液性囊腺癌88 例、粘液性癌32 例；術(shù)后輔助性化療97 例。良性組，年齡 38～69 歲，平均 55.6±8.5 歲；其中黏液性囊腺瘤80 例、漿液性囊腺瘤40 例。兩組患者的年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR 技術(shù) 取 50mg 組織置入 EP 管內(nèi)，加入Trizol 進行組織溶解，加入0.3ml 氯仿，室溫下震蕩30s，放置30min，取上清液待測，加入等體積的異丙嗪溶液，室溫放置30min，1000r/min 離心10min，取沉淀物，加入75%乙醇溶液1ml，溶解后1000r/min 離心 10min，取上清液，加入 20μlDEPC水計算 RNA 濃度，單位為：ug/ul。采用 SuperScript IV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京碧云天生物公司批號：2018 2748）進行cDNA 合成，采用金斯瑞oligo 進行引物合成和設(shè)計，GADPH 作為內(nèi)參，miR-200a 引物上游 5’ GAGGATGAT TGCTGACGTGGA 下游引物5’TCl CAGATGGTGAGCGAG 一 3’，CISILE2018高通量PCR 儀器購自羅氏檢測公司。

1.3 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計分析采用SPSS 21.0 軟件，年齡、miR-200a 相對表達等計量資料采用±s 表示，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗或單因素方差分析法； 多因素分析采用Logistic 回歸分析法；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 惡性組和良性組標本中miR-200a 相對表達水平對比 惡性組標本中的miR-200a 相對表達水平顯著高于良性組的黏液性囊腺瘤、 漿液性囊腺瘤，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）,見表1。

表1 惡性組和良性組標本中miR-200a相對表達水平對比（±s）

表1 惡性組和良性組標本中miR-200a相對表達水平對比（±s）

組別 n惡性組良性組黏液性囊腺瘤漿液性囊腺瘤P 值120 miR-200a（相對含量） F 值1.734±0.391 80 40 0.955±0.208 0.978±0.210 38.1090.000

2.2 不同病理學特征上皮性卵巢癌組織標本中miR-200a 相對表達水平對比 FIGO 分期 （Ⅲ期+Ⅳ期）、低分化、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、3 年隨訪死亡的卵巢癌組織標本中的miR-200a 相對表達水平顯著高于FIGO 分期（Ⅰ期+Ⅱ期）、高中分化、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、3 年隨訪存活的患者，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；不同年齡分組、不同病理學類型的卵巢癌組織標本中的miR-200a 相對表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）,見表2。

2.3 miR-200a 表達與患者預(yù)后的關(guān)系 以患者的預(yù)后結(jié)局作為因變量，以FIGO 分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、年齡分組、卵巢癌病理學類型作為自變量，經(jīng)Logistic 回歸分析，卵巢癌患者FIGO 分期（Ⅲ期+Ⅳ期）、低分化、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-200a 相對表達高水平是上皮性卵巢癌不良預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.05）；不同年齡、不同卵巢癌病理學類型對卵巢癌患者的預(yù)后影響尚不顯著（P＞0.05），見表3。

表2 不同病理學特征上皮性卵巢癌組織標本中miR-200a相對表達水平對比（±s）

表2 不同病理學特征上皮性卵巢癌組織標本中miR-200a相對表達水平對比（±s）

因素 n miR-200a（相對含量） t 值P 值年齡（歲）≥55＜55 FIGO 分期Ⅰ期+Ⅱ期Ⅲ期+Ⅳ期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移-0.8050.422 78 42 1.701±0.383 1.758±0.344-4.5280.000 80 40 1.612±0.377 1.940±0.368-2.1660.032是 否35 85 1.397±0.359 1.561±0.384組織學分級高+中低分化病理學類型漿液性囊腺癌粘液性癌3 年隨訪存活死亡-5.0430.000 68 52 1.600±0.380 1.951±0.375-0.6250.533 88 32 1.720±0.368 1.768±0.383-7.6330.000 51 69 1.520±0.355 2.041±0.380

表3 miR-200a表達與患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

不同卵巢生發(fā)上皮細胞的異常發(fā)生,能夠顯著促進卵巢惡性腫瘤的發(fā)生。在多囊卵巢、不孕或者月經(jīng)推遲絕經(jīng)的群體中,卵巢惡性腫瘤的發(fā)病率可明顯上升[7]。通過對于卵巢癌臨床預(yù)后的評估，能夠在卵巢惡性腫瘤的診療過程中發(fā)揮重要的作用。臨床預(yù)后相關(guān)分子標志物的研究，能夠在疾病治療方案的制定或者患者出院后的隨訪方面發(fā)揮作用。影像學檢查雖然能夠評估卵巢癌患者的臨床病理特征進展情況,但其對于卵巢癌患者臨床預(yù)后評估的可靠性較低,評估的滯后性及靈敏度并不理想。血清腫瘤指標能夠在卵巢癌的診療過程中發(fā)揮作用,其中雖然現(xiàn)階段臨床上主要采用糖鏈蛋白125 進而評估卵巢癌的生存預(yù)后。但糖鏈蛋白125 評估卵巢癌臨床預(yù)后的假陽性率及真性符合率仍然較低,其對于不同病理類型來源腫瘤評估的特異性程度較低[8,9]。而本次研究通過對于卵巢癌患者病灶組織中miR-200a 的表達分析，能夠在揭示卵巢腫瘤發(fā)生機理的同時,為臨床上卵巢腫瘤的生存預(yù)后評估提供參考。

miR-200a 是微小RNA 相關(guān)家族成員，其主要表達于細胞間質(zhì)及細胞器周邊,在炎癥反應(yīng)或者惡性腫瘤的發(fā)生早期，miR-200a 均可發(fā)生顯著的波動。miR-200a 對于腫瘤細胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的激活，能夠提高腫瘤細胞DNA 的分裂速度，提高腫瘤細胞異常分化的風險?；A(chǔ)分子生物學領(lǐng)域的研究還認為，miR-200a 對于癌細胞內(nèi)AKT 信號通路的激活作用，能夠增加腫瘤細胞免疫逃逸的風險[10]。部分研究者探討了miR-200a 在卵巢癌患者中的表達情況，但多數(shù)研究者局限于對于miR-200a 的表觀濃度表達研究[11,12],缺乏對于miR-200a的表達與卵巢癌生存預(yù)后的關(guān)系研究。

通過對于卵巢癌病灶組織中miR-200a 的表達分析，可以發(fā)現(xiàn)惡性組標本中的miR-200a 相對表達水平顯著高于良性組的黏液性囊腺瘤、 漿液性囊腺瘤，差異具有統(tǒng)計學意義，并且在卵巢癌病灶組織中，miR-200a 基因的擴增水平明顯的上升，高于卵巢良性組織，差異有統(tǒng)計學意義，表明miR-200a 的高表達能夠影響到卵巢腫瘤的發(fā)生過程。之所以在卵巢癌中存在miR-200a 的高表達，主要由于腫瘤微環(huán)境的改變，影響到了腫瘤細胞非編碼RNA 的活性，促進了非編碼RNA 的調(diào)控異常。有其他研究者也認為,在卵巢漿液性腫瘤或者透明細胞癌患者中，miR-200a 的表達濃度可上升超過40%，在卵巢癌腫瘤高負荷較為明顯或者腫瘤發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的患者中，miR-200a 基因擴增水平的上升更為顯著[13-15]。在不同的臨床病理特征中，可以發(fā)現(xiàn)隨著卵巢癌FIGO 分期的進展、腫瘤細胞分化程度的下降及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，病灶組織中miR-200a 基因的擴增水平可顯著上升, 相關(guān)臨床病理特征的進展越為明顯，病灶組織中miR-200a的表達濃度越高，提示了miR-200a 的高表達能夠顯著促進卵巢癌綜合性病情的進展。這主要由于miR-200a 的高表達，影響到了卵巢生發(fā)上皮細胞的生物學特征,促進了癌細胞粘附和浸潤能力的增強，最終促進了FIGO 分期的進展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生； 而miR-200a 對于癌細胞分化程度的影響，主要在于miR-200a 能夠干預(yù)到腫瘤細胞的分化調(diào)控成熟能力。但本次研究并未發(fā)現(xiàn)miR-200a 在不同病理類型患者中的表達差異, 提示miR-200a 并不會影響到腫瘤細胞的分化來源。危險因素分析可見，卵巢癌患者 FIGO 分期、 低分化、 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-200a高水平表達，均是影響卵巢癌不良臨床結(jié)局的風險因素, 臨床上對于具有相關(guān)臨床特征的患者，應(yīng)早期采用積極的治療措施，進而改善卵巢癌的臨床結(jié)局。

綜上，miR-200a 在卵巢癌患者中的表達明顯上升,在FIGO 分期較晚或者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，miR-200a 表達較高，同時miR-200a 相對表達高水平可能會增加上皮性卵巢癌不良預(yù)后的風險。