改良有效的培養(yǎng)大鼠原代血管平滑肌細(xì)胞的方法

鄧惠堅 ，盧群 ，林轉(zhuǎn)娣 審校

（1.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院；2.廣東藥科大學(xué)；3.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院，廣州 番禺 511400）

高血壓是心腦血管疾病最重要的危險因素之一，長期的血壓升高促進動脈管壁發(fā)生彌漫性纖維性硬化，最終導(dǎo)致心、腦及腎等靶器官損害[1]。在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程，VSMCs 參與了動脈壁生理功能和病理變化[2,3]。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損后，內(nèi)皮細(xì)胞合成及分泌的血管活性物質(zhì)與細(xì)胞因子間的平衡會被破壞，導(dǎo)致白細(xì)胞黏附，誘導(dǎo) VSMCs 發(fā)生表型轉(zhuǎn)化并遷移到內(nèi)膜下[4]?；罨?VSMCs 大量增殖并攝取氧化型低密度脂蛋白形成泡沫細(xì)胞，大量泡沫細(xì)胞堆積會引發(fā)動脈粥樣硬化的形成及病理性內(nèi)膜增厚[5,6]。高血壓、超重/肥胖和吸煙是導(dǎo)致AS 發(fā)生的主要三種危險因素，本實驗是利用的高血壓和導(dǎo)致肥胖的高脂飲食的危險因素促進AS 模型的快速構(gòu)建，而動脈粥樣硬化形成的血管平滑肌細(xì)胞增強的增殖和遷移能力將有助于細(xì)胞培養(yǎng)。

1 材料與方法

1.1 材料

⑴實驗動物 10 周齡雄性SPF 級自發(fā)性高血壓大鼠和10 周齡的SD 大鼠各 12 只，體重（230±15）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

⑵飼料 高脂高膽固醇飼料 （配方：4% 膽固醇，0.5% 膽酸鈉，0.2% 丙基硫氧嘧啶，10%豬油，5% 白糖，80.3% 普通飼料）。

⑶實驗儀器 超凈工作臺（SW-CJ-2F，蘇凈集團安泰公司）SHEL L/JB CO2培養(yǎng)箱 （Heraeus，德國）倒置熒光顯微鏡（Olympus，Tokyo，Japan）病理切片設(shè)備 全自動生化分析儀（美國亞培公司）。

⑷實驗試劑 胎牛血清(Gibco 公司) 青霉素和鏈霉素（吉諾生物有限公司）高糖培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM, Gibco 公司)磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline, PBS) 4%多聚甲醛（廣州翔博） 4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色液(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI, 碧云天公司） 抗α 平滑肌肌動蛋白抗體 (alpha smooth muscle actin, α-SMA, Abcam） 熒光二抗 (R&D) 維生素D3 注射液 （上海通用藥業(yè)公司） 10% 水合氯醛（廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院）

1.2 方法

⑴12 只 10 周齡自發(fā)性高血壓大鼠（雄性）。高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)3 周，在飼養(yǎng)開始時，每只大鼠予以 60 萬/U 維生素D3 腹腔注射，平均分 2 d注射完畢。同時SD 大鼠采取普通飼料喂養(yǎng) 3 周。

⑵3 周后大鼠稱重后通過用 10% 水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，然后用 75% 醫(yī)用乙醇浸泡大鼠頸部以下的部位，消毒時間 2 min。接著操作者帶好無菌手套和穿好無菌隔離衣，在消毒操作臺用鑷子和剪刀采用“D”字形切口打開左側(cè)胸腔并分離出大鼠胸主動脈，立即放入含有 1%青霉素和鏈霉素的 4℃ 預(yù)冷的無菌PBS 溶液中，反復(fù)沖洗血管直至血管透亮。

⑶一部分血管用于轉(zhuǎn)移到 4% 多聚甲醛固定液中后行HE 染色后觀察血管內(nèi)膜形態(tài)改變。另一部分血管放置于含20% 胎牛血清和 1% 青霉素、鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中，用小剪刀縱向剖開血管并使內(nèi)膜面朝上，用兩個眼科彎鑷背側(cè)攤平血管并輕輕搔刮血管內(nèi)膜面，以便刮除血管內(nèi)膜上的內(nèi)皮細(xì)胞。接著，用兩個眼科彎鑷背側(cè)壓緊血管內(nèi)膜面反向牽拉，使得內(nèi)膜面中層組織撕裂，鑷子背側(cè)繼續(xù)輕輕剝離血管中層組織并充分剔除外膜組織。將取好的中層組織置入小離心管內(nèi)，眼科小剪刀將組織剪成約1mm3的組織粒。用移液槍吸干組織粒間的水分后并將剪碎的組織塊均勻貼放于25cm2培養(yǎng)瓶底，組織粒間距約 0.2~0.3cm。最后把培養(yǎng)瓶置于直立或者倒立狀態(tài)，并向瓶內(nèi)加入2~3ml 含 20% 胎牛血清和 1% 青霉素、 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液，置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，繼續(xù)保持直立或倒立狀態(tài)保持 1.5~3h，根據(jù)組織塊與瓶壁牢固貼附情況調(diào)整時間。后輕輕地翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使組織塊浸沒于培養(yǎng)液中。

⑷培養(yǎng)瓶靜置培養(yǎng)箱 3d 后取出觀察，用含20% 胎牛血清和 1% 青霉素、鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液以保留原培養(yǎng)基量的 1/2~1/3 方式來換液處理。約 5~7d 后在顯微鏡下可見細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，往后約 2d 換液 1 次，具體可以根據(jù)培養(yǎng)基的顏色變化調(diào)整換液時間。

⑸傳代培養(yǎng)： 當(dāng)組織粒間的細(xì)胞生長匯合達(dá)80% 以上時可進行第一次傳代處理，在超凈工作臺中用常溫?zé)o菌的PBS 溶液沖洗組織粒使之脫落，再加入 0.125% 胰酶混合消化液 2ml。室溫下消化約1min 后置于顯微鏡下觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮、間隙增大并有少數(shù)細(xì)胞脫落時，直接加入 2ml的20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液來終止消化，移液槍吹打瓶壁細(xì)胞使之脫落混勻并制成單細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至 5ml 的無菌離心管，離心管密封后于臺式離心機 1000r/min 的參數(shù)下離心5 min 后超凈工作臺中吸去上清液，接著加入含20% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液后混勻并制成單細(xì)胞懸液，以 1:3 原則接種傳代，細(xì)胞個數(shù)控制在約 1×106個/ml。將傳代的培養(yǎng)瓶做好標(biāo)志后放入37℃、5% 的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約 3 d 可長滿。建議前 3 代的平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)選用含 20% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，往后的細(xì)胞可選用含 10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液。

⑹通過在倒置相差顯微鏡下觀察并拍照記錄平滑肌細(xì)胞的生長特點、大小、形態(tài)及排列方式等。

⑺平滑肌細(xì)胞鑒定： 本次實驗用免疫熒光化學(xué)法對第 3 代血管平滑肌細(xì)胞進行鑒定，將制好的細(xì)胞懸液注入到預(yù)先放置蓋玻片的 6 孔板中，待細(xì)胞生長匯合達(dá) 80% 以上時，吸去孔板中的培養(yǎng)液后加入適量的 4% 多聚甲醛，并置于室溫下固定 20~30 min，用PBS 漂洗蓋玻片 3 次，每次時間約 5 min。然后用 1 % TritonX-100 通透細(xì)胞膜處理，時間20~30 min。接著再加入山羊血清覆蓋蓋玻片并置于 37℃ 下封閉處理，時間 60 min。封閉結(jié)束后用PBS 漂洗蓋玻片 3 次，每次時間約 5 min。加入一抗(α-SMA 1：200) 稀釋液孵育并置于4℃ 冰箱過夜。隔天再用PBS 漂洗蓋玻片 3 次，每次時間約 5 min。暗室內(nèi)加入FITC 標(biāo)記的山羊抗鼠抗體稀釋液孵育蓋玻片，繼續(xù)置于室溫下暗室60 min。孵育結(jié)束后PBS 液繼續(xù)漂洗 3 次，每次時間 5 min。最后加入含 1 μg/ml 的 DAPI 的 PBS 稀釋液暗室下繼續(xù)孵育 10 min，用PBS 液充分沖洗蓋玻片，甘油封片后在倒置熒光顯微鏡下觀察并攝片記錄。

2 結(jié)果

⑴圖a 中高倍顯微鏡鏡下（100 x）可見自發(fā)性高血壓大鼠胸主動脈內(nèi)膜有不同程度的內(nèi)皮細(xì)胞脫落，且血管中層組織可見平滑肌細(xì)胞大量增殖和遷移導(dǎo)致內(nèi)膜動脈病理性增生。見圖 b 中高倍顯微鏡鏡下（100 x）SD 大鼠動脈內(nèi)膜未見增厚，且血管內(nèi)膜下內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊。

⑵原代血管平滑肌細(xì)胞的鑒定結(jié)果。低倍鏡下（40 x）可見平滑肌細(xì)胞呈典型的峰谷樣生長形態(tài)（如圖A），高倍鏡下（100 x）觀察到細(xì)胞長梭形樣的生長形態(tài),見圖B。圖C 顯示是熒光顯微鏡下的平滑肌細(xì)胞，顯色為綠色是平滑肌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的肌動蛋白，藍(lán)色的是平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞核。本實驗成功獲取大鼠的原代血管平滑肌細(xì)胞。見圖D 顯示是本次實驗的雜細(xì)胞-血管內(nèi)皮細(xì)胞。

⑶兩組大鼠原代血管平滑肌細(xì)胞的數(shù)據(jù)對比。

3 討論

在高血壓大鼠動物研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠體內(nèi)的動脈的內(nèi)膜厚度較正常大鼠明顯增厚,其機制可能與高血壓改變血管平滑肌細(xì)胞的表型狀態(tài)有關(guān)[7,8]。本實驗選用自發(fā)性高血壓大鼠與SD 大鼠血管培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞，結(jié)果顯示自發(fā)性高血壓大鼠實驗組大鼠組細(xì)胞生長速度更快，而且細(xì)胞生長狀態(tài)良好。內(nèi)膜下的脂質(zhì)沉積也是AS 的基礎(chǔ)病變之一，可以通過誘導(dǎo)大量炎性細(xì)胞浸潤促進內(nèi)膜灶狀纖維化及粥樣斑塊形成[9,10]。研究發(fā)現(xiàn)大劑量的維生素D3 可以通過損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞促進血管鈣化從而導(dǎo)致動脈粥樣硬化形成[11]。本次研究我們采用腹腔注射大劑量的維生素D3 來達(dá)到損傷血管的內(nèi)皮細(xì)胞，然后喂養(yǎng)3 周的高脂高膽固醇飼料，通過病理切片我們可以看到有效快速地建立起動脈粥樣硬化模型。本實驗結(jié)果顯示自發(fā)性高血壓大鼠血管培養(yǎng)出的平滑肌細(xì)胞純度更高，避免了內(nèi)皮細(xì)胞的生長干預(yù)了平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)。本實驗首次比較動脈粥樣硬化形成自發(fā)性高血壓大鼠與SD 大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的生長狀態(tài)，結(jié)果顯示選取動脈粥樣硬化形成的自發(fā)性高血壓大鼠更容易培養(yǎng)出純度更高的原代血管平滑肌細(xì)胞。

表1

在培養(yǎng)原代大鼠血管平滑肌細(xì)胞過程中往往涉及很多細(xì)節(jié)，以下總結(jié)幾點：⑴相對無菌的操作過程是成功的基礎(chǔ)；包括使用大鼠解剖前的消毒、器械的高壓滅菌、超凈工作臺的準(zhǔn)備、帶有雙抗的漂洗液、 無菌手套的使用等等。⑵操作時間的控制；血管是一個離體組織，整個血管中層組織的提取時間盡量控制在30~60min 內(nèi)，前期的研究基礎(chǔ)顯示少于30min 的時間使得細(xì)胞的成功率更高。⑶血管活性的保持； 本次實驗過程用到的漂洗液或者浸泡液要在 4℃ 冰箱預(yù)冷，操作工程盡量在預(yù)先準(zhǔn)備好的冰袋上進行。⑷培養(yǎng)基的營養(yǎng)支持；細(xì)胞因子與活性物質(zhì)是血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移的啟動因子。因此，培養(yǎng)基必須要選用好的新鮮的血清或者加入血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor-BB, PDGF-BB）[12]。這里推薦使用新鮮的澳洲胎牛血清，血清盡量在解凍后1 月內(nèi)用完，最好當(dāng)天解凍后使用。⑸組織的處理；要用鑷子輕輕刮血管內(nèi)膜面及充分剔除血管外膜，避免后期的雜細(xì)胞的產(chǎn)生；將中膜層血管組織轉(zhuǎn)移到小離心管內(nèi)，可以快速充分剪碎組織粒，并且建議用微量的無菌移液槍將組織粒水分吸干以便縮短貼壁時間。⑹第一次換液的時間；培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3~4 d 后，必須行第一次換液處理，以保留原培養(yǎng)基 1/2~1/3 量的方式來進行換液。一方面補充損耗的營養(yǎng)物質(zhì)，另一方面保留部分原有的血管活性物質(zhì)和細(xì)胞因子。