基于COXⅠ及ITS基因糞類圓線蟲PCR鑒定方法的建立

蘆亞君，邢維媚，夏乾峰

（海南醫(yī)學院熱帶醫(yī)學與檢驗醫(yī)學院，海南 ?？?571199）

糞類圓線蟲（Strongyloides stercoralis）是一種土源性蠕蟲，流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)[1,2]。目前，糞類圓線蟲病常用的診斷方法是在患者糞便中檢出桿狀蚴、絲狀蚴或蟲卵。在光學顯微鏡下檢獲蟲體的病原學診斷方法雖然簡便快捷,但敏感性和特異性低。糞類圓線蟲的蟲卵和幼蟲均與鉤蟲、東方毛圓線蟲在形態(tài)上區(qū)別不明顯，易混淆[3]。

本研究擬用COXⅠ基因和ITS 基因作為分子標記對糞類圓線蟲進行分子生物學鑒定[4]，以明確診斷。以糞類圓線蟲病患者的糞便作為檢驗物純化糞類圓線蟲蟲體,提取蟲體 DNA，PCR 擴增COXⅠ和ITS 基因，探討分子鑒定在糞類圓線蟲病診斷的應用,為臨床上確診糞類圓線蟲感染提供明確的分子生物學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲體來源 2018 年5 月海南省某醫(yī)院糞類圓線蟲病腹瀉患者的糞便。

1.2 試劑 動物組織直接PCR 試劑盒購于北京百泰克生物技術有限公司，2×TSINGKE Master Mix(blue)購于北京擎科新業(yè)生物技術有限公司，DL20 00 DNA Marker 購于北京莊盟國際生物基因科技有限公司、核酸染料GelRed 購于biosharp，引物由廣州天一輝遠基因科技有限公司合成。

1.3 儀器 高效組織細胞破碎儀購于湖北新縱科病毒疾病工程技術有限公司,小型臺式高速冷凍離心機 Eppendorf 5424R、MASTERCYCLER PRO PC R 儀購于 eppendorf（中國）有限公司；L1 型低溫連接儀購于珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司,全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)Tanon-1600 購于上海天能科技有限公司。

1.4 形態(tài)學鑒別 使用生理鹽水直接涂片法檢查該腹瀉患者糞便，結合病史及臨床癥狀，在光學顯微鏡下初步鑒定蟲種蟲期。

1.5 蟲體前處理 取患者糞便分裝于1.5ml 無菌研磨管內，生理鹽水重懸糞便，12000rpm 離心5min，棄上清，重復 3 次[5]。向沉淀加入 100μl AB 溶液和研磨珠置于研磨儀中5000rpm 研磨30s,重復5 次,加入 25μl AD Buffer，室溫放置 10min 后，95℃孵育5min,加入100μl AC 溶液后即為蟲體粗提物。

1.6 COXⅠ基因PCR 反應 擴增COXⅠ基因的上游引物 ST COI NF：5’-GGTTTATGGGCTGGTATGA-TTG-3’，下游引物 ST COI NR: 5’-AAACCTTAACACCAGTAGGGAC-3’。PCR 體系總體積為20μl：2×PCR Mix 10μl,上游引物、下游引物各 0.8 μl，蟲體粗提物 4μl，ddH2O 4.4μl。PCR 反應程序為 94℃預 變性 3min，94℃變 性 1min，48℃退 火1min，72℃延伸 2min,35 個循環(huán),72℃后延伸 10min，反應設置2 個平行。

1.7 ITS 基因PCR 反應 擴增ITS 基因的上游引物NC5：5’ -GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT -3’,下游引物 NC2：5’-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3’[6]。PCR 體系總體積為 50μl：2×Master Mix 25 μl，上游引物、下游引物各 1μl，蟲體粗提物 1μl，ddH2O 22μl。梯度 PCR 反應程序為 94℃預變性5min；94℃變性 30s, 退火溫度分別設置為 45℃、50℃、55℃、60℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 個循環(huán)；72℃后延伸5min，每個反應設置2 個平行。

1.8 電泳 PCR 反應結束后，取 5μl 擴增產(chǎn)物于120V 電壓下進行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。

2 結果

2.1 形態(tài)學鑒定 光鏡下觀察糞便中的蟲體為糞類圓線蟲桿狀蚴蟲期，蟲體無色透明、光滑、線狀，具有折光性，前端鈍圓，尾端尖細，見圖1。

圖1 糞類圓線蟲桿狀蚴

2.2 電泳 COXⅠ基因PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外成像系統(tǒng)下觀察具有特異性條帶，大小約1500bp，見圖2。

圖2 COXⅠ基因1%瓊脂糖凝膠電泳

ITS 基因 PCR 擴增產(chǎn)物在退火溫度 45℃、50℃、55℃時有明顯的特異性條帶，其中50℃目的條帶最亮，目的條帶大小在900bp 之間。而退火溫度是60℃時無目的條帶，見圖3。

2.3 序列分析 Genebank 中檢索顯示不同線蟲的COXⅠ基因均在1500~1700bp 之間，見表1，而ITS基因在不同線蟲中的堿基組成中顯示，其分別包括18S、5.8S 和28S 的部分或完全序列，因此堿基長度變化較大，見表2。

3 討論

圖3 ITS基因1%瓊脂糖凝膠電泳

表1 不同線蟲COXⅠ基因比較

表2 不同線蟲ITS基因比較

糞類圓線蟲既可以在溫暖潮濕的疏松土壤中營自生生活，也可以在宿主體內營寄生生活，是一種致病性兼性寄生蟲[7]。糞類圓線蟲感染期幼蟲絲狀蚴經(jīng)皮膚或口腔黏膜侵入人體后，進入靜脈，經(jīng)過右心進入肺，在肺泡內短暫逗留后沿氣管、支氣管逆行至咽部，隨人的吞咽行為到達胃、小腸，或在體內移行至腸外器官。對于免疫力低下者或者患有惡性腫瘤、長期使用免疫抑制劑、激素等感染者[8,9]，本蟲易在體內進行播散性傳播或自體感染。蟲體若侵犯顱腦、睪丸、腹股溝等部位[10-12]，臨床癥狀不典型、糞便檢出率極低、易造成誤診和漏診,嚴重患者易致死。據(jù)報道，福建、浙江等地均已發(fā)現(xiàn)糞類圓線蟲致死病例[13,14]。傳統(tǒng)的糞類圓線蟲病的診斷方法是依靠檢驗物中檢獲出蟲體,生理鹽水直接涂片法鏡下進行形態(tài)學觀察加以判斷。其局限性在于糞量的多少、糞便性狀、涂片的厚薄及蟲體的完整性。另外，鉤蟲、東方毛圓線蟲等線蟲與糞類圓線蟲具有相似的形態(tài)學特征，難以區(qū)別，對于確定蟲種還需要具有豐富經(jīng)驗的操作人員[15,16]。相比于形態(tài)學鑒定法，以糞類圓線蟲特異性序列的PCR 技術可提供快速準確的分子診斷依據(jù)[17]。

COXⅠ基因是常用的分子遺傳標記，廣泛應用于物種的鑒定和分類。本研究經(jīng)PCR 擴增電泳后結果顯示，COX I 基因的目的條帶約為1500bp，大小符合Genebank 中檢索到的其他線蟲。ITS 基因擴增使用梯度PCR 方法, 探討了不同退火溫度對產(chǎn)物的影響，發(fā)現(xiàn)50℃時目的條帶最明顯，為最佳退火溫度，而60℃無目的條帶，說明不同退火溫度對ITS 基因的擴增效果存在差別。在Genebank 中檢索到不同線蟲的ITS 序列，分別包含部分或完全的 18s rRNA、ITS1、5.8s rRNA、ITS2、28s rRNA 基因，因此堿基長度范圍較大。但本實驗使用ITS 的上、下游引物擴增，其產(chǎn)物由ITS1、5.8s rRNA、ITS2組成，長度約為900bp，符合Genebank 中檢索到的序列范圍。

本研究探討了基于COXⅠ及ITS 基因的糞類圓線蟲PCR 診斷技術的建立, 并對反應參數(shù)進行了優(yōu)化探討,為糞類圓線蟲病準確及時的臨床診斷提供了技術支持，也為該蟲的分子分類、基因多態(tài)性研究奠定了基礎[18]。