楊帆,朱恒,趙宵溢,王惠君
天津中醫(yī)藥大學,天津 301617
過敏性鼻炎(allergic rhinitis,AR),又稱變應性鼻炎,是指由免疫球蛋白E介導的以鼻癢、鼻黏膜腫脹、鼻分泌亢進為主要臨床特點的鼻黏膜慢性炎癥反應性疾病。隨著人類社會工業(yè)化的進展,AR的發(fā)病率逐年增加[1],已嚴重影響患者的生活質(zhì)量[2]。AR的西醫(yī)治療主要有免疫療法和藥物治療,但效果欠佳[3]。AR在中醫(yī)學屬于“鼻鼽”范疇,其病機為臟腑虛損、衛(wèi)表不固,感受風寒邪氣。而小青龍湯是治療AR的經(jīng)典名方,載于《傷寒論》,由8味藥物組成,分別是北五味子、麻黃、炙甘草、干姜、桂枝、細辛、白芍藥、半夏,主治表寒里飲之證。辜詩晶[4]應用循證醫(yī)學和Meta分析得出,小青龍湯對改善AR癥狀和降低其復發(fā)率有明顯優(yōu)勢。王勝軍[5]研究發(fā)現(xiàn),小青龍湯聯(lián)合補中益氣湯加減聯(lián)合西醫(yī)治療AR比單純西醫(yī)有明顯優(yōu)勢,治療后鼻塞、流清涕等癥狀有顯著改善。王超群等[6]以門診治療的100例AR患者為研究對象,經(jīng)分析得出小青龍湯加減治療AR的效果顯著,可明顯緩解本病癥狀,建議在臨床推廣使用。
中藥的化學成分復雜,其分子機理尚缺乏有效方法進行闡釋,隨著網(wǎng)絡藥理學的廣泛應用,也被視為適合中醫(yī)藥的研究手段,它的整體性、綜合性和系統(tǒng)性符合中藥的多化合物、多靶點、多途徑的特點[7]?,F(xiàn)應用網(wǎng)絡藥理學研究小青龍湯治療AR的作用機制,旨在為其臨床應用提供一定的理論支撐。
1.1 篩選小青龍湯中藥物的有效成分本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)獲取小青龍湯中每味中藥的化學成分,且均以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18為篩選條件,得到每味中藥的有效成分信息。
1.2 獲取相關(guān)靶點信息采用Uniprot數(shù)據(jù)庫(www.uniprot.org)對獲取的蛋白質(zhì)名稱進行基因注釋,得到蛋白質(zhì)的標準化基因名稱,物種設定為人,并將所有結(jié)果去重復后保存。
1.3 收集AR的靶點信息分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫中以Allergic Rhinitis為關(guān)鍵詞進行檢索,將得到的結(jié)果合并去重復保存到Excel中。
1.4 將小青龍湯中藥物的靶基因和AR的靶基因取交集搜索在線韋恩圖(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/),在Upload lists下一欄的List1中導入AR的基因信息,在List2中導入小青龍湯的基因信息,點擊submit,即可得到小青龍湯治療AR的交集基因。
1.5 網(wǎng)絡的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點的篩選根據(jù)復方的基因信息整理出Network文件和Type文件,將兩個文件導入Cytoscape3.7.1軟件,通過分析得到藥物-復方有效成分-靶點網(wǎng)絡。進入STRING數(shù)據(jù)庫,點擊左側(cè)的Multiple proteins,將復方和AR的交集基因?qū)隠ist Of Names一欄中,Organism選擇Homo sapiens,點擊SEARCH,隱藏游離靶點,得到一份tsv文件,將此文件導入到Cytoscape3.7.1軟件進行分析。一般認為,節(jié)點度值大于所有節(jié)點連接度2倍中位數(shù)對網(wǎng)絡具有重要意義,以此為篩選條件確定關(guān)鍵節(jié)點[8],并運用CytoNCA對網(wǎng)絡進行拓撲分析。
1.6 交集基因的功能富集分析和通路富集分析通過Metascape(https://metascape.org/)平臺對小青龍湯和AR的交集基因進行GO和KEGG富集分析。
2.1 小青龍湯中藥物的有效成分的篩選及靶點預測通過TCMSP數(shù)據(jù)庫,且以OB≥30%、DL≥0.18為篩選條件得到小青龍湯的有效成分共169個,其中甘草92個、麻黃23個、芍藥13個、半夏13個、細辛8個、五味子8個、桂枝7個、干姜5個。經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫分析后,得到841個靶點,其中甘草226個、麻黃221個、細辛106個、半夏92個、芍藥88個、桂枝48個、干姜42個、五味子18個。去重復后共272個靶點。
2.2 AR疾病的靶點預測在Genecards、OMIM數(shù)據(jù)庫中均以Allergic Rhinitis為關(guān)鍵詞進行檢索,分別得到過敏性鼻炎疾病的相關(guān)基因2 073個和138個,去重復后得到基因共2 140個。
2.3 小青龍湯治療AR的潛在靶點預測將小青龍湯的活性成分靶點和AR的靶點在韋恩圖進行映射,獲得兩者的交集靶點122個,即小青龍湯治療AR的潛在靶點。如圖1。
圖1 小青龍湯和AR的交集靶點數(shù)
2.4 網(wǎng)絡的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點的篩選將復方的Network文件和Type文件導入到Cytoscape軟件中,經(jīng)調(diào)整處理后可得到小青龍湯的藥物-復方有效成分-靶點圖(圖2),其中涉及332個節(jié)點、909條邊,且節(jié)點越大,度值越大,即在網(wǎng)絡中的作用就越重要。將小青龍湯和AR的交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫后得到一份tsv文件,把此文件再導入軟件Cytoscape軟件進行分析后,構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡,并運用軟件中的CytoNCA插件對網(wǎng)絡進行拓撲分析計算出各節(jié)點的點度中心性值、中介中心性值、接近中心性值。確定節(jié)點度值大于所有節(jié)點連接度 2 倍中位數(shù)的靶點為小青龍湯治療AR的關(guān)鍵靶點,見表1。并得到最終的PPI網(wǎng)絡圖,見圖3。在網(wǎng)絡中節(jié)點的大小、節(jié)點間連線的粗細均與度值成正相關(guān)。
表1 小青龍湯治療AR關(guān)鍵靶點的網(wǎng)絡拓撲參數(shù)
圖2 小青龍湯的藥物-復方有效成分-靶點的網(wǎng)絡圖
2.5 潛在靶點的基因功能富集分析結(jié)果和通路富集分析結(jié)果運用Metascape對122個潛在靶點進行GO富集分析,包括分子功能(molecular function,MF)、細胞組分(cellular component,CC)、生物過程(biological process,BP)。其中MF含有140條信息,CC含有81條信息,BP含有2199條信息。以P<0.01作為篩選條件,在BP、CC和MF中分別選取前20條繪制柱狀圖,見圖4,X軸是基因數(shù)目(Count),Y軸是GO信息名稱(GO term)。通過Metascape進行KEGG通路富集分析獲得182條通路(P<0.01),其主要涉及到癌癥通路、白細胞介素-17(interleukin-17,IL-17)、腫瘤壞死因子(TNF)、Toll樣受體及PI3K-Akt等信號通路。根據(jù)P值從小到大選取前20條通路作圖,見圖5,圖中X軸是基因所占比率,Y軸是通路的名稱,氣泡大小代表富集的基因數(shù)目(Count),顏色的深淺表示P值的大小,P值越小顏色越紅。
圖3 小青龍湯治療AR的關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡圖
圖4 潛在靶點GO功能富集分析
圖5 潛在靶點KEGG通路富集分析
AR的相關(guān)記載最早見于《禮記·月令》,稱為“鼽嚏”,發(fā)作時以鼻癢、打噴嚏、流清涕為主要癥狀,或有嗅覺減退、耳癢、咽癢等,本病易反復,多與肺、脾、腎等臟腑相關(guān),部分患者可有哮喘、鼻息肉等并發(fā)癥[9-10]。肺虛則衛(wèi)外不固,易感受寒邪,脾虛則水濕不運,腎虛易致喘咳,符合小青龍湯外寒里飲證的病機特點,故臨床多用小青龍湯治療AR。AR的發(fā)病機制復雜,主要與嗜酸性粒細胞浸潤、核轉(zhuǎn)錄因子κB(inuclear factor kappa-B,NF-κB)表達、TH1/TH2失衡等有關(guān)[11]。
本研究篩選出小青龍湯共169個有效活性成分,相關(guān)靶點共272個,與AR的交集靶點共122個,關(guān)鍵靶點20個,涉及2420條GO生物信息和182條信號通路,說明小青龍湯治療AR有多成分、多靶點、多通路的特點。
如圖2小青龍湯的藥物-復方有效成分-靶點的網(wǎng)絡圖所示,以“節(jié)點度值≥2倍度值中位數(shù)”為標準篩選出關(guān)鍵成分73個,有槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、柚皮素(naringenin)、黃芩素(baicalein)、木犀草素(luteolin)和異鼠李素(Isorhamnetin)等。槲皮素具有抗炎、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等作用,可通過調(diào)節(jié) Th1和Th2細胞因子的表達來調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞因子的平衡,從而達到對AR的保護[12]。山柰酚可降低鼻黏膜組織中TNF-α和IL-4的水平緩解AR的癥狀[13]。β-谷甾醇可通過抑制表皮細胞、巨噬細胞中炎癥小體NLRP3的激活、抑制MAPK信號通路的活化、降低IL-6、TNF-α 水平從而起到抗炎作用[14]。柚皮素可通過抑制NF-κB信號傳導途徑發(fā)揮抗炎作用[15]。黃芩素可抑制鼻黏膜STAT3磷酸化的表達,減少中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤,從而減輕AR的程度和炎癥反應[16]。木犀草素具有抗過敏作用,可通過減少炎性細胞的浸潤、抑制Th2細胞因子以達到對AR的治療作用[17]。異鼠李素可抑制TNF-α和IL-6的水平以增強抗炎作用[18]。
本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),小青龍湯治療AR的關(guān)鍵靶點有20個,即EGF、MYC、IL-6、IL-10、CCL2、TNF-α、MAPK1、CXCL8等。其中IL-6既是免疫調(diào)節(jié)因子也是促炎因子,其作用機理是促進T、B細胞成熟,從而發(fā)生炎癥反應[19]。IL-10是血清中免疫球蛋白E負反饋調(diào)節(jié)因子,能減少嗜酸性粒細胞的浸潤,改善AR的癥狀[20]。CCL2屬于趨化因子,對多種類型的免疫細胞具有強大的趨化性,從而介導多種促炎作用[21]。TNF-α是一種多功能炎癥細胞因子,可有效抑制NF-κB信號通路的激活,減少炎性因子的表達[22]。MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)可被多種細胞外信號或刺激(如炎性細胞因子、物理刺激等)所激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,并與炎癥等多種疾病相關(guān)[23]。CXCL8參與各級炎性過程,通過趨化作用調(diào)節(jié)免疫和炎性反應[24]。
經(jīng)GO和KEGG富集分析得出,基因顯著富集在癌癥途徑、IL-17信號通路、乙型肝炎、TNF信號通路、Th17細胞分化、Toll樣受體信號通路(TLR)、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、NF-κB信號通路等。IL-17信號通路主要是Th17細胞活化和維持的重要通路,其在多種炎性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[25]。Toll受體(TLRs)能間接調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞因子的平衡,在AR的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用,TLRs介導的信號通路失調(diào)會導致自身免疫性疾病和炎癥反應[26]。MAPK是人體內(nèi)重要的細胞內(nèi)信號傳導通路,主要包括:c-Jun氨基末端激酶(JNK)/SPAK、ERK5、p38和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2),其與感染、炎癥等密切聯(lián)系[27]。PI3K-Akt 信號通路在炎癥中發(fā)揮重要作用,抑制此通路的活化及上下游調(diào)質(zhì)的釋放,可緩解炎癥疼痛[28]。NF-κB是人體內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子,可參與眾多免疫反應和炎癥的表達,從而激活多種炎癥細胞發(fā)生炎性反應[29]。
綜上,本研究主要借助網(wǎng)絡藥理學得出小青龍湯中的槲皮素、山柰酚、黃芩素等有效成分可能是通過IL-17、Toll樣受體、MAPK、P13K-Akt、NF-κB通路等多個通路作用于IL6、IL10、TNF、MAPK1和MAPK3等多個靶點,從而發(fā)揮治療AR的作用,這為小青龍湯的臨床應用提供一定的理論依據(jù)。