基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討小青龍湯治療過敏性鼻炎的作用機(jī)制*

楊帆，朱恒，趙宵溢，王惠君

天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617

過敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)，又稱變應(yīng)性鼻炎，是指由免疫球蛋白E介導(dǎo)的以鼻癢、鼻黏膜腫脹、鼻分泌亢進(jìn)為主要臨床特點(diǎn)的鼻黏膜慢性炎癥反應(yīng)性疾病。隨著人類社會工業(yè)化的進(jìn)展，AR的發(fā)病率逐年增加[1]，已嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。AR的西醫(yī)治療主要有免疫療法和藥物治療，但效果欠佳[3]。AR在中醫(yī)學(xué)屬于“鼻鼽”范疇，其病機(jī)為臟腑虛損、衛(wèi)表不固，感受風(fēng)寒邪氣。而小青龍湯是治療AR的經(jīng)典名方，載于《傷寒論》，由8味藥物組成，分別是北五味子、麻黃、炙甘草、干姜、桂枝、細(xì)辛、白芍藥、半夏，主治表寒里飲之證。辜詩晶[4]應(yīng)用循證醫(yī)學(xué)和Meta分析得出，小青龍湯對改善AR癥狀和降低其復(fù)發(fā)率有明顯優(yōu)勢。王勝軍[5]研究發(fā)現(xiàn)，小青龍湯聯(lián)合補(bǔ)中益氣湯加減聯(lián)合西醫(yī)治療AR比單純西醫(yī)有明顯優(yōu)勢，治療后鼻塞、流清涕等癥狀有顯著改善。王超群等[6]以門診治療的100例AR患者為研究對象，經(jīng)分析得出小青龍湯加減治療AR的效果顯著，可明顯緩解本病癥狀，建議在臨床推廣使用。

中藥的化學(xué)成分復(fù)雜，其分子機(jī)理尚缺乏有效方法進(jìn)行闡釋，隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的廣泛應(yīng)用，也被視為適合中醫(yī)藥的研究手段，它的整體性、綜合性和系統(tǒng)性符合中藥的多化合物、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)[7]?，F(xiàn)應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究小青龍湯治療AR的作用機(jī)制，旨在為其臨床應(yīng)用提供一定的理論支撐。

1 方法

1.1 篩選小青龍湯中藥物的有效成分本研究通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)獲取小青龍湯中每味中藥的化學(xué)成分，且均以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為篩選條件，得到每味中藥的有效成分信息。

1.2 獲取相關(guān)靶點(diǎn)信息采用Uniprot數(shù)據(jù)庫(www.uniprot.org)對獲取的蛋白質(zhì)名稱進(jìn)行基因注釋，得到蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化基因名稱，物種設(shè)定為人，并將所有結(jié)果去重復(fù)后保存。

1.3 收集AR的靶點(diǎn)信息分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫中以Allergic Rhinitis為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，將得到的結(jié)果合并去重復(fù)保存到Excel中。

1.4 將小青龍湯中藥物的靶基因和AR的靶基因取交集搜索在線韋恩圖(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，在Upload lists下一欄的List1中導(dǎo)入AR的基因信息，在List2中導(dǎo)入小青龍湯的基因信息，點(diǎn)擊submit，即可得到小青龍湯治療AR的交集基因。

1.5 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選根據(jù)復(fù)方的基因信息整理出Network文件和Type文件，將兩個文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件，通過分析得到藥物-復(fù)方有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)入STRING數(shù)據(jù)庫，點(diǎn)擊左側(cè)的Multiple proteins，將復(fù)方和AR的交集基因?qū)隠ist Of Names一欄中，Organism選擇Homo sapiens，點(diǎn)擊SEARCH，隱藏游離靶點(diǎn)，得到一份tsv文件，將此文件導(dǎo)入到Cytoscape3.7.1軟件進(jìn)行分析。一般認(rèn)為，節(jié)點(diǎn)度值大于所有節(jié)點(diǎn)連接度2倍中位數(shù)對網(wǎng)絡(luò)具有重要意義，以此為篩選條件確定關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[8]，并運(yùn)用CytoNCA對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.6 交集基因的功能富集分析和通路富集分析通過Metascape(https：//metascape.org/)平臺對小青龍湯和AR的交集基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

2 結(jié)果

2.1 小青龍湯中藥物的有效成分的篩選及靶點(diǎn)預(yù)測通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，且以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選條件得到小青龍湯的有效成分共169個，其中甘草92個、麻黃23個、芍藥13個、半夏13個、細(xì)辛8個、五味子8個、桂枝7個、干姜5個。經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫分析后，得到841個靶點(diǎn)，其中甘草226個、麻黃221個、細(xì)辛106個、半夏92個、芍藥88個、桂枝48個、干姜42個、五味子18個。去重復(fù)后共272個靶點(diǎn)。

2.2 AR疾病的靶點(diǎn)預(yù)測在Genecards、OMIM數(shù)據(jù)庫中均以Allergic Rhinitis為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，分別得到過敏性鼻炎疾病的相關(guān)基因2 073個和138個，去重復(fù)后得到基因共2 140個。

2.3 小青龍湯治療AR的潛在靶點(diǎn)預(yù)測將小青龍湯的活性成分靶點(diǎn)和AR的靶點(diǎn)在韋恩圖進(jìn)行映射，獲得兩者的交集靶點(diǎn)122個，即小青龍湯治療AR的潛在靶點(diǎn)。如圖1。

圖1 小青龍湯和AR的交集靶點(diǎn)數(shù)

2.4 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選將復(fù)方的Network文件和Type文件導(dǎo)入到Cytoscape軟件中，經(jīng)調(diào)整處理后可得到小青龍湯的藥物-復(fù)方有效成分-靶點(diǎn)圖(圖2)，其中涉及332個節(jié)點(diǎn)、909條邊，且節(jié)點(diǎn)越大，度值越大，即在網(wǎng)絡(luò)中的作用就越重要。將小青龍湯和AR的交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫后得到一份tsv文件，把此文件再導(dǎo)入軟件Cytoscape軟件進(jìn)行分析后，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并運(yùn)用軟件中的CytoNCA插件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治鲇?jì)算出各節(jié)點(diǎn)的點(diǎn)度中心性值、中介中心性值、接近中心性值。確定節(jié)點(diǎn)度值大于所有節(jié)點(diǎn)連接度 2 倍中位數(shù)的靶點(diǎn)為小青龍湯治療AR的關(guān)鍵靶點(diǎn)，見表1。并得到最終的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。在網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的大小、節(jié)點(diǎn)間連線的粗細(xì)均與度值成正相關(guān)。

表1 小青龍湯治療AR關(guān)鍵靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)

圖2 小青龍湯的藥物-復(fù)方有效成分-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 潛在靶點(diǎn)的基因功能富集分析結(jié)果和通路富集分析結(jié)果運(yùn)用Metascape對122個潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，包括分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)、生物過程(biological process，BP)。其中MF含有140條信息，CC含有81條信息，BP含有2199條信息。以P<0.01作為篩選條件，在BP、CC和MF中分別選取前20條繪制柱狀圖，見圖4，X軸是基因數(shù)目(Count)，Y軸是GO信息名稱(GO term)。通過Metascape進(jìn)行KEGG通路富集分析獲得182條通路(P<0.01)，其主要涉及到癌癥通路、白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)、腫瘤壞死因子(TNF)、Toll樣受體及PI3K-Akt等信號通路。根據(jù)P值從小到大選取前20條通路作圖，見圖5，圖中X軸是基因所占比率，Y軸是通路的名稱，氣泡大小代表富集的基因數(shù)目(Count)，顏色的深淺表示P值的大小，P值越小顏色越紅。

圖3 小青龍湯治療AR的關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 潛在靶點(diǎn)GO功能富集分析

圖5 潛在靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

3 討論

AR的相關(guān)記載最早見于《禮記·月令》，稱為“鼽嚏”，發(fā)作時以鼻癢、打噴嚏、流清涕為主要癥狀，或有嗅覺減退、耳癢、咽癢等，本病易反復(fù)，多與肺、脾、腎等臟腑相關(guān)，部分患者可有哮喘、鼻息肉等并發(fā)癥[9-10]。肺虛則衛(wèi)外不固，易感受寒邪，脾虛則水濕不運(yùn)，腎虛易致喘咳，符合小青龍湯外寒里飲證的病機(jī)特點(diǎn)，故臨床多用小青龍湯治療AR。AR的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要與嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、核轉(zhuǎn)錄因子κB(inuclear factor kappa-B,NF-κB)表達(dá)、TH1/TH2失衡等有關(guān)[11]。

本研究篩選出小青龍湯共169個有效活性成分，相關(guān)靶點(diǎn)共272個，與AR的交集靶點(diǎn)共122個，關(guān)鍵靶點(diǎn)20個，涉及2420條GO生物信息和182條信號通路，說明小青龍湯治療AR有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。

如圖2小青龍湯的藥物-復(fù)方有效成分-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖所示，以“節(jié)點(diǎn)度值≥2倍度值中位數(shù)”為標(biāo)準(zhǔn)篩選出關(guān)鍵成分73個，有槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、柚皮素(naringenin)、黃芩素(baicalein)、木犀草素(luteolin)和異鼠李素(Isorhamnetin)等。槲皮素具有抗炎、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等作用，可通過調(diào)節(jié) Th1和Th2細(xì)胞因子的表達(dá)來調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡，從而達(dá)到對AR的保護(hù)[12]。山柰酚可降低鼻黏膜組織中TNF-α和IL-4的水平緩解AR的癥狀[13]。β-谷甾醇可通過抑制表皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中炎癥小體NLRP3的激活、抑制MAPK信號通路的活化、降低IL-6、TNF-α 水平從而起到抗炎作用[14]。柚皮素可通過抑制NF-κB信號傳導(dǎo)途徑發(fā)揮抗炎作用[15]。黃芩素可抑制鼻黏膜STAT3磷酸化的表達(dá)，減少中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，從而減輕AR的程度和炎癥反應(yīng)[16]。木犀草素具有抗過敏作用，可通過減少炎性細(xì)胞的浸潤、抑制Th2細(xì)胞因子以達(dá)到對AR的治療作用[17]。異鼠李素可抑制TNF-α和IL-6的水平以增強(qiáng)抗炎作用[18]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小青龍湯治療AR的關(guān)鍵靶點(diǎn)有20個，即EGF、MYC、IL-6、IL-10、CCL2、TNF-α、MAPK1、CXCL8等。其中IL-6既是免疫調(diào)節(jié)因子也是促炎因子，其作用機(jī)理是促進(jìn)T、B細(xì)胞成熟，從而發(fā)生炎癥反應(yīng)[19]。IL-10是血清中免疫球蛋白E負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子，能減少嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤，改善AR的癥狀[20]。CCL2屬于趨化因子，對多種類型的免疫細(xì)胞具有強(qiáng)大的趨化性，從而介導(dǎo)多種促炎作用[21]。TNF-α是一種多功能炎癥細(xì)胞因子，可有效抑制NF-κB信號通路的激活，減少炎性因子的表達(dá)[22]。MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)可被多種細(xì)胞外信號或刺激(如炎性細(xì)胞因子、物理刺激等)所激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，并與炎癥等多種疾病相關(guān)[23]。CXCL8參與各級炎性過程，通過趨化作用調(diào)節(jié)免疫和炎性反應(yīng)[24]。

經(jīng)GO和KEGG富集分析得出，基因顯著富集在癌癥途徑、IL-17信號通路、乙型肝炎、TNF信號通路、Th17細(xì)胞分化、Toll樣受體信號通路(TLR)、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、NF-κB信號通路等。IL-17信號通路主要是Th17細(xì)胞活化和維持的重要通路，其在多種炎性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[25]。Toll受體(TLRs)能間接調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡，在AR的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，TLRs介導(dǎo)的信號通路失調(diào)會導(dǎo)致自身免疫性疾病和炎癥反應(yīng)[26]。MAPK是人體內(nèi)重要的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，主要包括：c-Jun氨基末端激酶(JNK)/SPAK、ERK5、p38和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)，其與感染、炎癥等密切聯(lián)系[27]。PI3K-Akt 信號通路在炎癥中發(fā)揮重要作用，抑制此通路的活化及上下游調(diào)質(zhì)的釋放，可緩解炎癥疼痛[28]。NF-κB是人體內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，可參與眾多免疫反應(yīng)和炎癥的表達(dá)，從而激活多種炎癥細(xì)胞發(fā)生炎性反應(yīng)[29]。

綜上，本研究主要借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)得出小青龍湯中的槲皮素、山柰酚、黃芩素等有效成分可能是通過IL-17、Toll樣受體、MAPK、P13K-Akt、NF-κB通路等多個通路作用于IL6、IL10、TNF、MAPK1和MAPK3等多個靶點(diǎn)，從而發(fā)揮治療AR的作用，這為小青龍湯的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。