紫莖澤蘭栽培平菇的毒理學(xué)研究

朱建義，楊潔淼，趙浩宇，劉勝男，黃靜，周小剛*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，四川 成都 610066；2.農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點試驗室，四川 成都 610066；3.金堂縣農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，四川 金堂 610400)

隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的大力發(fā)展，食用菌栽培原料面臨資源短缺、價格高漲等問題，尋找新型培養(yǎng)基質(zhì)迫在眉睫[1]。平菇是我國栽培量和消費量最大的食用菌之一，隨著平菇生產(chǎn)規(guī)模逐年擴(kuò)大，培養(yǎng)基質(zhì)日趨緊張，新型培養(yǎng)基質(zhì)的研究相繼開展，范圍涵蓋果實、中藥材、木材、菌糠或菌渣、外來植物等[2]。陳若霞等[3]利用加拿大一枝黃花，周浩等[4]以大米草作為主料栽培平菇，陳謙等[5]研究了紫莖澤蘭對平菇產(chǎn)量及營養(yǎng)成分的影響。紫莖澤蘭(EupatoriumadenophorumSpreng)是一種入侵性惡性雜草，其營養(yǎng)豐富，是生產(chǎn)食用菌的優(yōu)質(zhì)原料[6-7]。利用其栽培食用菌，一方面為食用菌生產(chǎn)提供成本低廉、原料豐富的培養(yǎng)料，同時又可有效控制雜草危害，具有較好的生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和社會效益。紫莖澤蘭是一種含有有毒物質(zhì)的有害雜草[8]，利用其栽培平菇是否存在毒性殘留和富集的安全性問題，目前鮮有報道。明確利用紫莖澤蘭栽培平菇的安全性，可為新型基質(zhì)紫莖澤蘭的系統(tǒng)研究提供參考和依據(jù)。本研究使用紫莖澤蘭栽培平菇，并進(jìn)行毒理學(xué)研究，以明確其是否具有安全隱患。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及菌種

紫莖澤蘭采自四川省西昌市；平菇雜優(yōu)1號，由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所提供；昆明種小白鼠，體重18～22 g，由山東大學(xué)試驗動物中心提供[試驗動物許可證號：SCXK(魯)20130009號]。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g, 水1 000 mL。

常規(guī)平菇培養(yǎng)基：玉米芯70%，稻草10%，米糠10%，玉米粉7%，尿素0.5%，磷粉1%，石膏1.5%。

紫莖澤蘭平菇培養(yǎng)基：紫莖澤蘭42%，玉米芯28%，稻草10%，米糠10%，玉米粉7%，尿素0.5%，磷粉1%，石膏1.5%。

1.2 方法

1.2.1 紫莖澤蘭前處理及栽培基質(zhì)配制

取曬干的紫莖澤蘭莖稈，粉碎成長度約5 mm的秸稈粉。先將紫莖澤蘭秸稈粉、玉米芯用1∶500倍克霉靈溶液3～4 h濕透后，撈出與其他原料按比例混合均勻，再加水拌勻，料水質(zhì)量比為1∶1.2～1.4，石灰先溶于水后取上清液加入，使pH達(dá)7.5～8.5?；靹?，建堆，蓋膜，待料溫升至55 ℃時進(jìn)行翻堆，一般情況翻堆1～2次即可，堆漚時間以15 d為宜。

1.2.2 出菇試驗

按上述方法將栽培基質(zhì)配制好后，裝袋，套上頸圈，包扎袋口，100 ℃滅菌36 h，冷卻后在無菌條件下接種平菇菌種。然后將菌袋置于培養(yǎng)室內(nèi)，溫度25～27 ℃，相對濕度85%。待菌絲長滿菌袋，增加通風(fēng)，控制溫度18～20 ℃，打開袋口待子實體生長成熟時采集子實體。

1.2.3 毒理學(xué)試驗

毒理學(xué)研究委托山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院進(jìn)行。分別采集紫莖澤蘭平菇(以下簡稱澤蘭平菇)和普通平菇子實體，曬干或烘干后各取干品2 kg，進(jìn)行小鼠經(jīng)口急性毒性試驗、小鼠30 d喂養(yǎng)試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核計數(shù)和小鼠精子畸形試驗。

將澤蘭平菇加工成粉末狀，配成所需濃度。按照GB 15193.3—2003，采用最大限量法進(jìn)行急性毒性試驗方法。選健康小鼠20只，其中雌雄各10只。動物禁食12 h后稱重分2次灌胃，灌胃體積按0.2 mL·kg-1體重計算，間隔6 h，劑量為15 000 mg·kg-1。動物給予受試物后連續(xù)觀察14 d，記錄動物中毒癥狀及死亡情況，最后根據(jù)動物死亡數(shù)量求出半數(shù)致死量(LD50)。

選健康小鼠50只，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為5組，每組10只：大劑量組(10 g·kg-1組)、中劑量組(5 g·kg-1組)、小劑量組(2.5 g·kg-1組)、普通平菇組(10 g·kg-1)及對照組。試驗前將平菇粉摻入飼料中，加工成10%、5%、2.5%澤蘭平菇小鼠飼料及10%普通平菇小鼠飼料，大劑量組給予10%澤蘭平菇小鼠飼料，中劑量組給予5%澤蘭平菇小鼠飼料，小劑量組給予2.5%澤蘭平菇小鼠飼料，普通平菇組給予10%普通平菇小鼠飼料，對照組給予正常小鼠飼料，試驗動物連續(xù)喂養(yǎng)30 d。動物喂養(yǎng)在SPF級動物房內(nèi)進(jìn)行。

試驗期間每天觀察記錄小鼠的活動、進(jìn)食情況及中毒癥狀，每周稱量小鼠體重。試驗結(jié)束時各組小鼠均采用摘眼球取血測定血液中白細(xì)胞總數(shù)(WBC)及分類(NEU、LYM)、紅細(xì)胞總數(shù)(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、血小板計數(shù)(PLT)、血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、血糖(GLU)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)的含量。并對全部動物進(jìn)行解剖，檢查腦、心、肺、肝、脾、腎、胃、腎上腺、睪丸、子宮等臟器情況，記錄所見異常變化。取腦、心、肝、脾、肺、腎、睪丸、腎上腺等主要臟器稱重，計算臟器系數(shù)(臟器重/體重×100%)。每組留取6只小鼠的主要臟器標(biāo)本，用10%甲醛固定后，進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)檢查。

選健康小鼠50只，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為5組，每組10只：澤蘭平菇大劑量組、中劑量組、小劑量組及陰性對照組和陽性對照組。陰性對照組給予純凈水，陽性對照組給予40 mg·kg-1環(huán)磷酰胺腹腔注射。試驗動物每日經(jīng)口給藥1次，連續(xù)2 d，于第2天給藥后6 h處死動物，取兩側(cè)股骨骨髓，常規(guī)制片，Giemsa染色，鏡下觀察，每只動物觀察10 000個嗜多染紅細(xì)胞，求出微核率。

選健康雄性小鼠50只，隨機(jī)分成5組，每組10只，試驗處理及給藥同上。給藥后5 d脫臼處死動物，取出的雙側(cè)附睪置于盛有2 mL生理鹽水的小燒杯中剪碎，4層擦鏡紙過濾后制成精子懸液，進(jìn)行精子計數(shù)、精子存活數(shù)和精子畸形檢查。精子計數(shù)：取已制備好的精子懸液1滴灌入血細(xì)胞計數(shù)板的計數(shù)池中，高倍顯微鏡下計數(shù)池中5個中方格中的精子數(shù)，換算成1 mL精子懸液中的精子數(shù)即為每側(cè)附睪的精子數(shù)量。精子畸形率：取已制備好的精子懸液以1 000 r·min-1離心5 min，吸去上清液，剩余少量液體與沉淀搖勻后，取懸液1滴置于潔凈載玻片一側(cè)，推片，晾干后甲醇固定5 min，干后用2%伊紅水溶液染色1 h，在高倍顯微鏡下檢查精子形態(tài)，每只鼠檢查完整精子1 000個，計算畸形率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010和DPS 7.05進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠經(jīng)口急性毒性

小鼠經(jīng)口給予15 000 mg·kg-1澤蘭平菇后，動物出現(xiàn)靜臥，飲食活動減少，8 h后逐漸恢復(fù)正常。連續(xù)觀察14 d動物無死亡(表1)。結(jié)果表明，雌雄性小鼠經(jīng)口急性毒性LD50>15 000 mg·kg-1，按照GB 15193.3—2003，澤蘭平菇屬無毒物質(zhì)。

表1 不同小鼠性別的經(jīng)口急性毒性

2.2 小鼠30 d喂養(yǎng)

試驗各組血常規(guī)、血生化及臟器系數(shù)檢查均未見異常(表3～5)。澤蘭平菇大劑量組及普通平菇組小鼠喂養(yǎng)2周后被毛蓬松，體重增長緩慢，與對照組相比有顯著性差異(表2)；小鼠解剖觀察可見胃內(nèi)容物較少，且呈黏液狀；病理組織學(xué)檢查胃黏膜細(xì)胞萎縮，黏膜層輕度變薄，炎細(xì)胞輕度增多，但未累及黏膜肌層。未見澤蘭平菇有明顯的毒性作用。

表2 不同級別小鼠喂養(yǎng)30 d的體重情況

表3 不同級別小鼠喂養(yǎng)30 d的血常規(guī)

表4 不同級別小鼠喂養(yǎng)30 d的血生化指標(biāo)

表5 不同級別小鼠喂養(yǎng)30 d的臟器系數(shù)

2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核計數(shù)

澤蘭平菇各組微核率為0.17%～0.19%，陰性對照組為0.18%，澤蘭平菇各組與陰性對照組均無顯著性差異。而陽性對照組為1.94%，與陰性對照組相比有極顯著差異(表6)。結(jié)果表明，在本試驗條件下，澤蘭平菇對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率無明顯影響。

表6 紫莖澤蘭對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率的影響

2.4 小鼠精子畸形率

澤蘭平菇各組精子計數(shù)、精子存活率、精子畸形率與陰性對照組比較，均無顯著性差異，而陽性對照組與陰性對照組相比有顯著性差異(表7)。結(jié)果表明，在本試驗條件下，澤蘭平菇對小鼠精子畸形率無明顯影響。

表7 紫莖澤蘭對小鼠精子的影響

3 小結(jié)與結(jié)論

紫莖澤蘭是一種含有毒物質(zhì)的有害雜草，其主要有毒成分是佩蘭毒素、澤蘭苦內(nèi)脂、香豆精類、丹寧等[8]。可引起大鼠肝臟毒性及血生化的改變[9-10]。紫莖澤蘭醇提取物有一定胚胎毒性[11]。因此，利用紫莖澤蘭栽培食用菌的食品安全性問題就顯得至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，小鼠經(jīng)口急性毒性LD50雌雄性動物均>15 000 mg·kg-1，按照GB 15193.3—2003進(jìn)行急性毒性試驗，澤蘭平菇屬無毒物質(zhì)；小鼠30 d喂養(yǎng)試驗各組血常規(guī)、血生化及臟器系數(shù)檢查均未見異常；小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核和小鼠精子畸形試驗結(jié)果均為陰性，表明澤蘭平菇無致突變致畸作用。其原因可能是通過紫莖澤蘭前處理、高溫滅菌以及平菇自身含有的大量生物酶，將紫莖澤蘭有毒物質(zhì)降解，參與平菇生長的代謝過程，但其解毒機(jī)理有待深入研究。