槲皮素對慢性阻塞性肺疾病大鼠骨骼肌損傷的保護作用及其作用機制

王 麗，劉佳育

(1.天津市濱海新區(qū)大港醫(yī)院呼吸內科 300270；2.天津市胸科醫(yī)院呼吸與危重癥學科 300000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是全球第三大死因[1]。合并其他疾病，特別是伴有或不伴有肌肉丟失的骨骼肌功能障礙，是COPD患者的特征，甚至在疾病的早期階段也是如此[2]。在COPD患者中，股骨骼肌無力(定義為肌力下降)和質量損失已經被證明可以預測患者的生存率和死亡率[3]。然而，COPD肌肉功能障礙的病因尚不清楚，研究表明，先前的發(fā)生可能與線粒體紊亂、氧化應激、全身炎癥和肌肉萎縮有關[4-5]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)是一小類轉錄調節(jié)因子的成員，該轉錄調節(jié)因子控制與線粒體代謝、生物發(fā)生和氧化應激有關的基因表達[6]。作為PGC-1α的下游靶基因，沉默交配型信息調節(jié)因子2同源蛋白3(SIRT3)主要位于線粒體基質中，其通過可逆酶脫乙?；饔谜{節(jié)線粒體脂肪酸氧化[7]。SIRT3還與線粒體電子轉移鏈的酶復合物相互作用，增加復合物活性，從而有助于電子傳遞[7]。吸煙是COPD最常見的病因之一，據(jù)報道，在8周內每天暴露于香煙煙霧中小鼠的比目魚肌和趾長肌中觀察到PGC-1α和SIRT3 mRNA的表達顯著降低[8]。

槲皮素是植物中含量最豐富的黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌等多種生物活性[9]。已證明槲皮素的抗氧化活性與清除活性氧的能力有關，并通過多種轉錄因子誘導抗氧化蛋白的表達，保護細胞免受活性氧攻擊[10]。線粒體是活性氧的一個重要來源，有報道稱為槲皮素的另一個治療靶點[11]。槲皮素對線粒體的影響在糖尿病、癌癥、衰老和神經退行性等疾病中得到廣泛研究[12-13]。然而，口服槲皮素能否改善COPD進展過程中骨骼肌線粒體功能損傷尚不清楚。因此，本研究旨在探討槲皮素對氣管內注射脂多糖并結合香煙煙霧暴露所致COPD大鼠模型中骨骼肌線粒體及PGC-1α/SIRT3信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動物和處理方法

本研究共使用48只雄性Wistar大鼠(年齡8周)，體重180～220 g。所有大鼠均購自上海SIPPR/BK實驗動物有限公司(合格證編號：SCXK 2008-0016)，并在光照12 h/黑暗12 h，濕度70%、溫度(20±2)℃的無病原體環(huán)境下飼養(yǎng)。為了進行生化分析，將大鼠隨機分為對照組(n=16)、COPD組(n=16)和槲皮素組(n=16)。COPD組和槲皮素組大鼠分別于第1天和第15天氣管內滴注脂多糖(1 mg/mL，0.2 mL，購自美國Sigma公司)，并在除第1天和第15天外的60 d里每天暴露于6支未經過濾的商業(yè)香煙(購自湖南中研實業(yè)有限公司；每支香煙含有1.4 mg尼古丁和14 mg焦油碳)煙霧中30 min，每日2次，煙霧暴露箱為70 cm×60 cm×50 cm。對照組大鼠接受類似的治療，但采用氣管內滴注生理鹽水和暴露于空氣中的方法。從第31天開始，所有大鼠每天灌胃1次。對照組和COPD組大鼠灌服生理鹽水，槲皮素組COPD大鼠灌服槲皮素(100 mg/kg)。本研究中使用的槲皮素劑量基于先前的實驗[14]和筆者的初步研究。

1.2 肺功能檢查

在第62天，對大鼠進行稱重和麻醉。在第二和第三軟骨環(huán)處用倒Y形切口打開氣管，并立即用Y型套管插管，然后測量肺的吸氣量和呼氣量。氣管內Y型插管的出口連接到與PLY3211小型動物肺功能測定儀(美國Buxco-Research-Systems公司)相連的壓力傳感器，另一側用于向肺內注入空氣。氣管內通入空氣6.0 mL，測定第0.3 秒用力呼氣量(FEV0.3)、用力肺活量(FVC)、峰值呼氣流量(PEF)和FEV0.3/FVC比值。

1.3 組織病理學評價

對大鼠進行肺功能評價后，從心臟針刺放血。在大鼠停止呼吸后，收集右肺上葉及右比目魚肌標本，用4%多聚甲醛固定24 h，在75%乙醇中脫水12 h，包埋在石蠟中，切片，用蘇木精-伊紅(HE)染色，并固定在載玻片上。此外，骨骼肌切片也用Masson三色染色。組織學評價由一位病理學專家通過CX31顯微鏡(日本Olympus公司)進行觀察和拍攝切片，計算骨骼肌膠原體積分數(shù)，即膠原總面積除以整個視野面積。

1.4 骨骼肌線粒體功能評價

1.4.1線粒體分離

使用線粒體粗提分離試劑盒(上海Genemed scientifics公司)從比目魚肌中分離出骨骼肌線粒體。按照說明書操作，在4 ℃下，通過1 000×g離心10 min除去細胞核和未破碎的細胞。然后將上清液在4 ℃下，用10 000×g離心10 min，獲得線粒體部分，并將其懸浮在線粒體存儲液中，置于-80 ℃下保存。

1.4.2線粒體酶活性測定

根據(jù)廠家說明書(南京建成生物工程研究所)，用相應試劑盒測定骨骼肌線粒體中細胞色素C氧化酶(COX)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性。

1.4.3線粒體氧化參數(shù)測定

根據(jù)廠家說明書(南京建成生物工程研究所)，用相應試劑盒測定骨骼肌線粒體中的氧化參數(shù)，包括用硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)水平，用分光光度法測定錳超氧化物歧化酶(MnSOD)、 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶的活性。

1.5 細胞因子測定

將左比目魚肌冷凍組織標本置于含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的冷RIPA裂解緩沖液中勻漿。勻漿在4 ℃下以14 000×g離心20 min，使用相應的ELISA試劑盒(上海麥濟生物技術有限公司)測定上清液中白細胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。

1.6 實時PCR分析

使用TRIZOL試劑(美國Invitrogen公司)從左比目魚肌中提取總RNA。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)進行反轉錄。然后使用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)和7500序列檢測實時PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)進行實時PCR分析。通過GAPDH校正并使用公式x=2-ΔΔCt進行計算。所用PCR引物的核苷酸序列如下：SIRT3正向：5′-TACAGAAATCAGTGCCCCGA-3′，反向：5′-GGTGGACACAAGAACTGCTG-3′；PGC-1α正向：5′-ATGAGAAG CGGGAGTCTGAA-3′，反向：5′-GCGGTCTCTCAGTTCTGTCC-3′；GAPDH正向：5′-TGCCACTCAGAAGA CTGTGG-3′，反向：5′-TTCAGCTCTGG GATGACCTT-3′。

1.7 Western blot分析

在冰冷的RIPA裂解緩沖液中裂解左比目魚肌組織，然后在4 ℃下勻漿。將細胞裂解物在4 ℃下12 000×g離心30 min以除去細胞碎片。使用BCA蛋白質測定試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)測定蛋白質濃度。在8%～10%SDS-PAGE凝膠上分離等量的蛋白質(50 μg)，并轉移到PVDF膜上。在室溫下將膜在5%脫脂牛奶中封閉2 h，然后與針對PGC-1α(1∶1 000，英國Abcam公司)、SIRT3(1∶500，美國Santa Cruz Biotechnology公司)和GAPDH(1∶1 000，美國Santa Cruz Biotechnology公司)的特異性抗體一起孵育過夜。在室溫下用適當?shù)睦备^氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1:5 000；美國Santa Cruz Biotechnology公司)覆蓋2 h。最后，用增強的化學發(fā)光檢測系統(tǒng)(美國Pierce Biotechnology公司)觀察印跡。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 COPD大鼠模型評價及槲皮素對其影響

為確定COPD大鼠模型的建立是否成功，對其體重、肺功能和肺組織形態(tài)學進行了測定。在實驗期間，COPD組和槲皮素組各有1只大鼠死亡，死亡大鼠肺中可見大量肺大泡。呼吸衰竭和(或)灌胃刺激可能導致這些大鼠死亡。與對照組比較，COPD組和槲皮素組大鼠的體重增長速度明顯減慢(P<0.05)，見圖1A。在肺功能參數(shù)測定中，COPD組和槲皮素組大鼠PEF和FEV0.3/FVC均較對照組明顯降低[(4.90±0.82)mL/svs. (3.19±0.48)mL/s、(4.10±0.61)mL/s，P<0.05；(96.41±4.37)%vs. (63.50±11.50)%、(80.38±8.20)%，P<0.05)]，見圖1B、C。組織學分析顯示，從對照組大鼠獲得的肺組織樣本顯示肺泡間隔薄，肺泡正常，沒有炎性細胞浸潤(圖1D)；而從COPD大鼠獲得的肺組織樣本顯示肺泡間隔受損，肺泡增大，炎性細胞浸潤(圖1E)；所有這些異常經槲皮素治療顯著減弱(圖1F)。

2.2 骨骼肌組織病理學改變及定量分析

如圖2A所示，對照組大鼠骨骼肌未見明顯損傷。COPD組大鼠骨骼肌出現(xiàn)明顯的形態(tài)學改變，如肌纖維間隔增加、肌纖維萎縮和肌原纖維紊亂。此外，在COPD組大鼠中有更多的膠原沉積，而在對照大鼠中觀察到很少的纖維化。所有這些異常經槲皮素治療顯著減弱。進一步定量分析顯示，與對照組比較，COPD組和槲皮素組的膠原體積分數(shù)明顯增加[(1.21±0.24)%vs.(8.50±1.12)%、(4.62±0.85)%，P<0.05]，槲皮素組的膠原體積分數(shù)較COPD組顯著降低(P<0.05),見圖2B。

A:對照組、COPD組和槲皮素組大鼠的體重變化;B：大鼠肺功能指標PEF；C：大鼠肺功能指標FEV0.3/FVC；D:對照組大鼠肺組織HE染色(×200，比例尺=50 μm)；E ：COPD組大鼠肺組織HE染色(×200，比例尺=50 μm)；F：槲皮素組大鼠肺組織HE染色(×200，比例尺=50 μm)。*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與COPD組比較。

A：對照組、COPD組和槲皮素組大鼠骨骼肌的HE和Masson三色染色(×100，比例尺=100 μm)；B：對照組、COPD組和槲皮素組大鼠骨骼肌膠原體積分數(shù)的定量分析。*：P<0.05，與對照組比較；#:P<0.05,與COPD組比較。

2.3 骨骼肌線粒體酶活性研究

COPD組和槲皮素組大鼠骨骼肌線粒體COX、SDH、Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性均顯著低于對照組(P<0.05)。與COPD組比較，槲皮素組COPD大鼠骨骼肌線粒體COX、SDH、Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 3組大鼠骨骼肌線粒體酶活性

2.4 骨骼肌線粒體氧化應激研究

骨骼肌線粒體中的氧化參數(shù)如表2所示。COPD組骨骼肌線粒體MDA含量明顯高于對照組(P<0.05)，而MnSOD、GSH-Px和過氧化氫酶活性均顯著低于對照組(P<0.05)。與COPD組比較，槲皮素組COPD大鼠骨骼肌線粒體MDA含量顯著降低(P<0.05)，MnSOD、GSH-Px和過氧化氫酶活性顯著升高(P<0.05)。

2.5 3組骨骼肌IL-6和TNF-α水平比較

COPD組大鼠骨骼肌IL-6、TNF-α水平均顯著高于對照組(P<0.05)。槲皮素顯著降低COPD大鼠骨骼肌IL-6和TNF-α水平(P<0.05)，見表3。

表2 槲皮素對COPD大鼠骨骼肌線粒體氧化應激的影響

2.6 骨骼肌PGC-1α/SIRT3信號通路的變化

Western blot和實時PCR檢測骨骼肌PGC-1α和SIRT3的蛋白和mRNA表達結果如圖3所示。COPD組PGC-1α和SIRT3的蛋白和mRNA水平顯著低于對照組(P<0.05)。此外，槲皮素組PGC-1α和SIRT3的蛋白和mRNA表達較COPD組顯著升高(P<0.05)。

表3 3組骨骼肌IL-6、TNF-α水平比較

A:3組大鼠骨骼肌組織PGC-1α/SIRT3蛋白表達的Western blot圖；B：3組大鼠骨骼肌組織PGC-1α/SIRT3蛋白表達水平；C：3組大鼠骨骼肌組織PGC-1α/SIRT3 mRNA表達。*：P<0.05，與對照組比較;#：P<0.05，與COPD組比較。

3 討 論

COPD被認為是世界范圍內的公共衛(wèi)生問題，其患病率和病死率不斷上升[1]。調查顯示，在COPD進展期間，30%～40%的患者出現(xiàn)骨骼肌質量損失和功能障礙[15]。并且由于骨骼肌萎縮，COPD患者可能出現(xiàn)營養(yǎng)不良，并與病情惡化和病死率有關[16]。一項研究發(fā)現(xiàn)，隨著COPD嚴重程度的增加，股四頭肌無力變得更加嚴重[17]。此外，在身體活動相對正常，氣流受輕至中度阻塞的COPD患者中也觀察到明顯的肌肉無力，甚至在沒有COPD的吸煙者中也觀察到此現(xiàn)象，提示骨骼肌功能障礙可能在呼吸癥狀發(fā)作之前的早期發(fā)生[18]。線粒體功能損傷是COPD患者骨骼肌功能障礙的最重要機制之一[19]。因此，保護骨骼肌線粒體功能損傷對于改善COPD進展中骨骼肌功能障礙至關重要。本研究根據(jù)體重、肺功能和肺組織形態(tài)學三個參數(shù)建立COPD大鼠模型。與對照組比較，COPD大鼠體重增加速度明顯減慢，PEF和FEV0.3/FVC明顯降低，并且大鼠肺泡間隔破壞，肺泡增大，炎性細胞浸潤，以及骨骼肌線粒體功能受到明顯破壞。這些結果表明，COPD大鼠模型的建立是成功的。本研究進一步調查了槲皮素對COPD大鼠的治療作用，結果顯示，槲皮素減輕COPD大鼠骨骼肌線粒體功能損傷與PGC-1α/SIRT3信號通路的上調有關。

槲皮素具有多種藥理活性，其可以通過減輕線粒體功能損傷對多種疾病發(fā)揮治療作用[10]。最近研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以減輕以氣道炎癥和肺氣腫為特征的COPD大鼠肺泡上皮細胞線粒體損傷[20]。因此，本研究對槲皮素是否也能減輕COPD大鼠骨骼肌線粒體功能損傷作了進一步探討。病理學研究表明，COPD大鼠骨骼肌發(fā)生肌纖維間隔增加、肌纖維萎縮和肌原纖維紊亂，經槲皮素治療可明顯改善這些病理特征，表明槲皮素對COPD進展過程中的骨骼肌功能障礙具有治療作用。與相關研究結果一致[15]。本研究結果表明，COPD大鼠骨骼肌線粒體功能受到了明顯破壞，口服槲皮素可提高COPD大鼠骨骼肌線粒體酶活性。有報道稱線粒體是氧化應激的中心，線粒體功能損傷可顯著誘導炎性反應[21]。最近的證據(jù)表明，槲皮素的抗炎和抗氧化作用尤為重要[10]。槲皮素可以抑制脂多糖刺激的星形膠質細胞、單核細胞或肺泡巨噬細胞中促炎性細胞因子和趨化因子的產生[22-23]。槲皮素不僅可以通過清除活性氧和氮來誘導抗氧化活性，還可以通過激活抗氧化酶的表達來誘導抗氧化活性[10]。因此，本研究進一步分析了槲皮素對COPD大鼠骨骼肌氧化應激和炎性反應的影響，通過測定COPD大鼠骨骼肌線粒體中MDA、MnSOD、GSH-Px和過氧化氫酶含量，發(fā)現(xiàn)槲皮素能顯著降低氧化應激水平，增加抗氧化能力。此外，COPD大鼠骨骼肌促炎癥細胞因子(IL-6和TNF-α)顯著升高，槲皮素可逆轉這些升高。因此，槲皮素對COPD大鼠骨骼肌線粒體具有保護作用。

PGC-1α/SIRT3信號通路為調節(jié)線粒體代謝、生物發(fā)生和氧化應激的必需因子[24]。PGC-1α通過協(xié)同激活多種核轉錄因子來調節(jié)線粒體功能，從而增加包括SIRT3在內的核編碼線粒體蛋白的表達[25]。SIRT3作為sirtuin家族成員，主要定位于線粒體，并通過靶向中樞代謝中的幾種酶調節(jié)幾個關鍵的氧化途徑[26]。以往的研究已經證明，PGC-1α基因敲除可以有效降低肌肉細胞和肝細胞中SIRT3的表達，SIRT3通過幾種代謝和呼吸酶的去乙酰化來調節(jié)重要的線粒體功能[27]。然而，PGC-1α/SIRT3信號通路對COPD骨骼肌線粒體的影響尚不清楚。本研究表明，COPD大鼠骨骼肌線粒體功能損傷時，PGC-1α和SIRT3的表達顯著降低。進一步研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能上調COPD大鼠骨骼肌PGC-1α和SIRT3的表達，提示PGC-1α/SIRT3信號通路參與了槲皮素對COPD大鼠骨骼肌線粒體的保護作用和骨骼肌功能障礙的進展。然而，PGC-1α/SIRT3信號通路在COPD骨骼肌功能障礙中的具體機制有待進一步研究。

總之，本研究在COPD模型大鼠中發(fā)現(xiàn)了以肌纖維間隔增加、肌纖維萎縮和肌原纖維紊亂為特征的骨骼肌損傷。槲皮素可通過減輕COPD大鼠骨骼肌線粒體功能損傷來改善骨骼肌形態(tài)學，部分原因可能與PGC-1α/SIRT3信號通路上調有關。這些結果進一步證明口服槲皮素治療COPD骨骼肌功能障礙是可行的。