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    淫羊藿素對腹膜纖維化大鼠糖原合酶激酶3β、β連環(huán)蛋白的影響

    2021-05-18 07:10:06李林煜
    陜西中醫(yī) 2021年5期
    關(guān)鍵詞:模型

    李林煜,陳 燁,甘 平

    (1.貴州醫(yī)科大學(xué),貴州 貴陽550000;2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院,貴州 貴陽550004)

    腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)是一種治療終末期腎病(End-stage renal disease,ESRD)經(jīng)濟(jì)有效的腎臟替代療法[1]。但腹膜組織長期暴露于生物不相容的高葡萄糖PD液(PDF)會使腹膜進(jìn)行性損傷,導(dǎo)致腹膜纖維化[2]。目前腹膜纖維化的發(fā)生機(jī)制尚不清楚,尚無有效的治療方法。關(guān)于腹膜纖維化的發(fā)病機(jī)制中醫(yī)學(xué)目前沒有相關(guān)的描述,但一些醫(yī)學(xué)家認(rèn)為腹膜纖維化的中醫(yī)發(fā)病機(jī)制為脾腎虧虛、痰瘀互結(jié)等。研究顯示淫羊藿為小檗科淫羊藿屬植物,是一種傳統(tǒng)中草藥,具有增強(qiáng)人體免疫功能、延緩衰老、防治神經(jīng)性疾病等作用,淫羊藿素是從淫羊藿中提取的一種異戊二烯類黃酮衍生物,具有抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松等作用[3]。目前尚不了解淫羊藿素在透析誘導(dǎo)的腹膜纖維化中的抗纖維化作用。β連環(huán)蛋白(β-catenin)信號在體內(nèi)自我更新中發(fā)揮重要作用,在腎臟纖維化、肺纖維化、肝纖維化和皮膚纖維化中涉及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的啟動[4-6]。糖原合酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)在上述病理中抑制β-catenin信號傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用[7]。由此,本研究擬探討淫羊藿素對腹膜纖維化的作用效果及對GSK-3β、β-catenin的影響,為淫羊藿素治療腹膜纖維化的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物:成年雄性SPF級SD大鼠30只,體重(210±10)g。購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司,使用許可證號:SCXK(川)2019-031。飼養(yǎng)于恒溫(20~25 ℃)、恒濕(50±5)%環(huán)境中,自然采光,自由飲水。

    1.1.2 主要試劑及儀器:淫羊藿素購自上海友思生物技術(shù)公司;0.1%葡萄糖氯已定購于美國Sigma;蘇木素染液(批號:C200301)、伊紅染液(批號:C200403)購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司;改良Masson三色染色液(批號:0630A20)購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;GSK-3β、β-Catenin ELISA試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司;相關(guān)一抗GSK-3β、β-catenin、p-GSK-3β購自CST,二抗購自英國Abcam公司;RS36型全自動染色機(jī)購自常州派斯杰醫(yī)療設(shè)備公司;病理組織漂烘儀(PHY-Ⅲ型)購自常州市中威電子儀器;BA210Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡購自麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 腹膜纖維化大鼠模型構(gòu)建及干預(yù)方法:大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,隨機(jī)分為假手術(shù)組(10只)及造模組(20只)。模型組每日給予0.1%葡萄糖氯已定(1 ml/100 g)腹腔注射,假手術(shù)組每日給予1 ml生理鹽水腹腔注射,連續(xù)21 d。21 d后造模大鼠隨機(jī)分為模型組、淫羊藿素組,隨后假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃生理鹽水,淫羊藿素組按3 mg/kg淫羊藿素灌胃,淫羊藿素劑量選擇是根據(jù)前期體內(nèi)淫羊藿素(0.1~10 mg/kg)處理的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用3 mg/kg劑量給藥,每天給藥1次,持續(xù)6周。

    1.2.2 標(biāo)本采集:三組大鼠于末次給藥結(jié)束24 h后,處死大鼠,分別取腹膜組織,將腹膜組織分為三部分,一部分采用4%多聚甲醛固定,用于病理觀察及免疫組化染色;另一部分于-80 ℃冰箱保存,用于ELISA檢測;剩余部分于液氮中保存,用于后續(xù)Western blot檢測。

    1.2.3 腹膜組織病理變化觀察:HE染色方法為,腹膜組織4%多聚甲醛固定,包埋在石蠟中,然后切成切片(約5 μm厚),根據(jù)說明書對樣品進(jìn)行了蘇木精-伊紅(HE)染色,觀察腹膜組織的病理變化,并用光學(xué)顯微鏡拍照。Masson染色:腹膜組織4%多聚甲醛固定,包埋在石蠟中,切成5 μm的橫截面,使用Masson的三色染色劑,將腹膜組織分別染成紅色和藍(lán)色,觀察腹膜組織膠原纖維變化,并用光學(xué)顯微鏡拍照。

    1.2.4 免疫組織化學(xué)法:固定的腹膜組織脫水,包埋,切片,使用磷酸鹽緩沖液(PBS)中的0.3%過氧化氫抑制這些切片中的內(nèi)源性過氧化物酶活性,并用10%的正常山羊血清封閉非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)。然后將切片與抗GSK-3β、抗β-catenin抗體4 ℃過夜,后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgGs二抗37 ℃孵育30 min,蘇木素染色,鏡檢觀察,并使用Image-J圖像分析軟件根據(jù)積分光密度(IOD)/面積值確定GSK-3β、β-catenin陽性染色的強(qiáng)度。

    1.2.5 ELISA檢測:取腹膜組織,剪碎后加入預(yù)冷的生理鹽水3 ml,4 ℃下研磨,3500 r/min低溫離心10 min,取上清液,用于分析GSK-3β、β-catenin含量。通過相應(yīng)的ELISA分析試劑盒檢測,所有步驟均按照說明書進(jìn)行。設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣品孔,其中空白孔不加樣品,只加顯色劑A、B和終止液用于調(diào)零;標(biāo)準(zhǔn)品孔加入配好的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl,然后加入辣根過氧化物酶100 μl;待測樣品孔加入樣本50 μl,然后辣根過氧化物酶100 μl,蓋上封板膜,輕輕振蕩混勻,37 ℃溫育60 min。揭膜,棄去液體,于每孔加滿洗滌液后靜置1 min,棄去液體,重復(fù)5次。每孔先加入底物液A 50 μl,再加入底物液B 50 μl,輕輕震蕩混勻,37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μl,終止反應(yīng)。在15 min內(nèi),450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。

    1.2.6 Western blot分析:將每個樣品在裂解緩沖液中裂解以獲得總蛋白質(zhì),然后通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離該蛋白質(zhì),并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在5%脫脂牛奶中封閉60 min后,將膜與一抗GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、β-actin在4 ℃孵育過夜。然后將膜用tris緩沖鹽水Tween(TBST)洗滌,并與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗兔或抗小鼠二抗在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測試劑觀察蛋白條帶,并使用Image-J軟件通過光密度法定量。條帶的灰度值標(biāo)準(zhǔn)化為β-actin,并表示為相對于對照的倍數(shù)變化,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析,試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異采用t檢驗(yàn)統(tǒng)計分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組大鼠腹膜組織病理變化 假手術(shù)組:腹膜組織結(jié)構(gòu)較為完整、清晰,未見明顯增厚;表面被覆單層扁平上皮,排列較為整齊,間皮下可見疏松結(jié)締組織,未見明顯纖維增生或炎細(xì)胞浸潤;腹膜下肌束結(jié)構(gòu)清晰,肌束內(nèi)肌細(xì)胞呈長圓柱狀,胞核呈扁圓形或橢圓形,位于細(xì)胞周緣,胞質(zhì)染色較為均勻,未見明顯變性壞死。模型組:腹膜組織明顯增厚,間皮細(xì)胞排列紊亂;間皮下大量纖維組織增生,膠原纖維增多,腹膜組織厚度增加,增生纖維組織較為致密,平行排列成束,成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞穿插于纖維束間,增生區(qū)域內(nèi)可見大量血管增生及淋巴細(xì)胞浸潤,局部血管充血擴(kuò)張較為明顯;腹膜下肌細(xì)胞變性壞死,見肌細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)丟失,大量肌細(xì)胞萎縮溶解。淫羊藿素組:腹膜組織增厚,纖維組織不同程度增生,可見成纖維細(xì)胞或淋巴細(xì)胞聚集于新生纖維束間;腹膜下部分肌細(xì)胞變性,見肌細(xì)胞輕微萎縮,腹膜組織間皮下致密層增厚程度減輕,膠原纖維較模型組減少(圖1)。

    圖1 各組大鼠腹膜組織病理變化(×400)

    2.2 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達(dá)比較 見表1(圖2)。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin蛋白含量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,淫羊藿素組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin蛋白含量明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    表1 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達(dá)比較

    圖2 各組大鼠GSK-3β、β-catenin免疫組化染色圖(IHC染色,×200)

    2.3 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin含量比較 見表2。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin水平明顯升高(P<0.01)。與模型組比較,淫羊藿素組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin水平明顯降低(P<0.05)。

    表2 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、β-catenin含量比較

    2.4 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達(dá)比較 見表3(圖3)。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腹膜組織中GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達(dá)明顯升高(P<0.05);與模型組比較,淫羊藿素組大鼠腹膜組織中GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達(dá)明顯降低(P<0.05)。

    表3 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達(dá)比較

    圖3 各組大鼠腹膜組織GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)

    3 討 論

    腹膜纖維化是長期腹膜透析(PD)引起的嚴(yán)重并發(fā)癥,其特征是間皮細(xì)胞丟失和細(xì)胞外基質(zhì)沉積[8],因此開發(fā)腹膜纖維化的潛在治療策略尤為重要。中醫(yī)認(rèn)為腹膜纖維化的發(fā)病機(jī)制為脾腎虧虛、痰瘀互結(jié)、久病入絡(luò),從而導(dǎo)致腹絡(luò)微型癥積。

    淫羊藿(Epimedium brevicomu Maxim.)又名仙靈脾、陰陽活、銅絲草、巴倫草,味甘、辛,性溫,歸腎、肝經(jīng),《玉楸藥解》注其功效:“榮筋強(qiáng)骨,起痿壯陽,溫補(bǔ)肝腎,滋益精血,治陰絕不生,陽痿不舉,消瘰疬,起癱瘓,益志寧神,清風(fēng)明目”[9]。《本草綱目》認(rèn)為淫羊藿有“益精氣,堅筋骨,補(bǔ)腰膝,強(qiáng)心力”之功效,對于腎陽虛導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥療效顯著。因此,淫羊藿也被廣泛用于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[10]。淫羊藿最早記載見于《神農(nóng)本草經(jīng)》,藥理作用有補(bǔ)腎壯陽、祛風(fēng)除濕等,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明淫羊藿素已被臨床證明對一系列腫瘤、骨質(zhì)疏松等疾病有效,此外,在神經(jīng)保護(hù)、心臟保護(hù)、抗炎、抗肝纖維化等方面具有顯著藥理作用[11]。研究報道淫羊藿素可顯著抑制血清促炎細(xì)胞因子的分泌和產(chǎn)生,包括前列腺轉(zhuǎn)腺癌小鼠中的白細(xì)胞介素(IL-1α、IL-β、IL-6)和腫瘤壞死因子TNF-α[12]。此外,淫羊藿素還可通過激活5’-單磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶(AMPK)并抑制β位點(diǎn)APP裂解酶1(BACE-1)發(fā)揮抗阿爾茨海默氏癥作用[13]。Zhao等[14]發(fā)現(xiàn)淫羊藿素通過抑制IL-6和TNF-α的表達(dá)并通過AMPK/mTOR信號通路抑制肺癌破骨細(xì)胞的形成。Hwang等[15]報道淫羊藿素可通過刺激Nrf2/ARE和降低AP-1和NF-κB信號通路恢復(fù)UVB誘導(dǎo)的光老化。淫羊藿素還可調(diào)節(jié)硬化素的表達(dá),促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨[16]。但淫羊藿素對腹膜纖維化的保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚。因此,本研究建立腹膜纖維化大鼠,觀察淫羊藿素抗纖維化作用。首先從病理角度觀察結(jié)果顯示淫羊藿素可減輕腹膜增厚,減輕間皮下大量纖維組織增生,改善局部血管充血擴(kuò)張,并減少腹膜組織膠原纖維。提示淫羊藿素對腹膜纖維化具有改善作用,可成為治療腹膜纖維化的潛在治療藥物。

    淫羊藿素已被表明可通過多靶點(diǎn),多途徑作用于各種疾病[11]。研究報道GSK-3β是Wnt信號通路中的重要信號因子,在各種細(xì)胞內(nèi)均廣泛存在,可通過Wnt信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、增殖和凋亡等多種進(jìn)程[17]。Zhang等[18]證實(shí)GSK-3β在纖維化中占有重要作用,抑制GSK-3β的表達(dá)可以抑制肺纖維化的發(fā)生與進(jìn)展,并提出GSK-3β可能是肺纖維化治療的一個潛在靶點(diǎn)。β-catenin是通過Axin、腺瘤性息肉病大腸桿菌、酪蛋白激酶1α(CK1α)和GSK-3β組成的破壞復(fù)合體維持在較低水平,GSK-3β磷酸化抑制破壞復(fù)合物的泛素化活性,導(dǎo)致胞內(nèi)β-catenin的積聚,隨后遷移到細(xì)胞核[19]。核β-catenin與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子結(jié)合因子(TCF/LEF)家族成員形成復(fù)合物,刺激靶基因的轉(zhuǎn)錄,包括Snail、Twist、纖維連接蛋白(fibronectin)、MMPs、Jagged1和LEF1,促進(jìn)細(xì)胞增殖[20]。研究表明抑制β-catenin可阻斷高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[21]。Yan等[22]研究表明β-catenin通路可能在高糖誘導(dǎo)的腹膜纖維化過程中促進(jìn)腹膜間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究表明,淫羊藿素可抑制葡糖糖氯已定誘導(dǎo)的腹膜纖維化大鼠GSK-3β、β-catenin表達(dá),提示淫羊藿素可能通過抑制GSK-3β的磷酸化,促進(jìn)GSK-3β降解,減少β-catenin蓄積,減輕腹膜纖維化。

    綜上所述,淫羊藿素通過減輕腹膜增厚及腹膜組織膠原纖維進(jìn)展,抑制GSK-3β/β-catenin軸的激活,減輕葡糖糖氯已定誘導(dǎo)的腹膜纖維化。

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