化痰祛瘀方在肝豆?fàn)詈俗冃阅Ｐ托∈蠛ｑR神經(jīng)細(xì)胞增殖中的作用及相關(guān)機(jī)制研究

房如意，謝道俊

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

細(xì)胞信號(hào)通路在機(jī)體內(nèi)的作用顯著，正常細(xì)胞的增殖、分化等進(jìn)程均受細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)控[1-2]。然而，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異?？赡苷T發(fā)機(jī)體發(fā)生一系列變化。PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路已被證實(shí)與人類疾病的發(fā)展關(guān)系密切[3]，PI3K、AKT和mTOR是該通路的關(guān)鍵信號(hào)靶點(diǎn)，與組織細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等能力密切相關(guān)[4-6]。Wilson病又稱威爾遜病，是先天性銅代謝障礙性疾病[7]。

近年來(lái)，中藥方和天然動(dòng)植物提取物已被證實(shí)在抵抗細(xì)胞增殖、凋亡、抑制促癌基因表達(dá)、誘導(dǎo)抑癌基因表達(dá)等方面發(fā)揮重要作用[8-9]；同時(shí)，其具備易獲得、效果優(yōu)良等優(yōu)點(diǎn)，在延長(zhǎng)患者生存期和減少?gòu)?fù)發(fā)轉(zhuǎn)移上作用顯著[10]。本研究基于前人研究成果[11]，進(jìn)一步探討化痰祛瘀方在Wilson病模型小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖中的作用及PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑、儀器及藥物 胎牛血清、0.25%胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司，中國(guó))；RIPA裂解液(Beyotime，中國(guó))；二甲基亞砜(Beyotime，中國(guó))；聚偏氟乙烯膜和脫脂奶粉(PVDF；Millpore，USA)；甲醇(富宇精細(xì)化工，中國(guó))；電泳試劑盒(Sigma，USA)；Western blot一抗和二抗(Boster，中國(guó))；微量移液槍(Eppendorf，Research?plus)；細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning，USA)；二氧化碳恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱(Sanyo，日本)；SDS-PAGE試劑盒(Sangon，USA)；化痰祛瘀方配方溶液由本院制備。

1.2 Wilson病小鼠模型分組和藥物處理

1.2.1 實(shí)驗(yàn)小鼠分組：購(gòu)買20只健康4月齡Wilson病模型TX小鼠，平均體重為(22±2)g，將其飼養(yǎng)于室溫18～26 ℃、相對(duì)濕度50%～60%、模擬自然照明周期12/12 h的獨(dú)立通氣籠具。給予TX小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由攝取食物和水。同時(shí)購(gòu)買10只健康4月齡DL小鼠，平均體重為(22±2)g，雌雄對(duì)半，作為正常對(duì)照，同上法飼養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)小鼠藥物處理：中藥化痰祛瘀方組方為，澤瀉、金錢草各24 g,大黃、姜黃、黃連各20 g,三七3 g。將姜黃、黃連、澤瀉、金錢草和三七以蒸餾水浸泡0.5 h后，高火煎煮，后加大黃，文火煎煮。過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾，重復(fù)添加蒸餾水，再次煎煮和過(guò)濾，濃縮至生藥量2.2 g/ml，藥液密封儲(chǔ)存于4 ℃冷藏箱。

模型組TX小鼠(n=10)飼養(yǎng)環(huán)境和飼養(yǎng)方法同上所述。選用純凈飲用水，2次/d，每次0.2 ml/10 g體重的劑量灌胃。而實(shí)驗(yàn)組小鼠(n=10)則按上述制備中藥湯劑按0.2 ml/10 g體重的劑量灌胃(2次/d)。兩組前述處理時(shí)間為期28 d。另設(shè)正常對(duì)照組，將DL小鼠以前述同樣飼養(yǎng)方法置于相同環(huán)境，按照模型組TX小鼠灌胃方式進(jìn)行處理。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 腦組織取材：末次給藥12 h每組各取5只小鼠處死取材。以10%水合氯醛深度麻醉小鼠，斷頭脫頸處死?？焖偃?shí)驗(yàn)小鼠全腦，預(yù)冷PBS沖洗腦組織表面血液，快速獲取海馬區(qū)組織，低溫凍存于液氮中，一部分用于HE染色，一部分用于Western blot檢測(cè)。

1.3.2 Western blot檢測(cè)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平：采用 Western blot 檢測(cè)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路相關(guān)因子p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR及PCNA、Ki-67等細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)。取適量組織，加裂解液，快速研磨組織，冰上充分裂解。離心取上清液，部分上清液用于BCA法測(cè)定蛋白含量；其余蛋白樣品變性凍存后，上樣，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，將PVDF膜置于孵育盒，加入適量稀釋后一抗(兔抗人p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR及PCNA、Ki-67單克隆抗體)，于4 ℃下孵育過(guò)夜；后經(jīng)HPR標(biāo)記二抗室溫下孵育1.5 h后，進(jìn)行ECL顯色。選取β-actin為內(nèi)參，圖像分析使用Image J軟件。

1.3.3 Brd U摻入法檢測(cè)化痰祛瘀方處理Wilson病模型小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖：采用Brd U摻入法檢測(cè)化痰祛瘀方處理Wilson病模型小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖。每組剩余5只小鼠備用。將Brd U溶液以生理鹽水稀釋制備成待用實(shí)驗(yàn)溶液(5 mg/ml)。配制后按50 mg/kg進(jìn)行腹腔注射，每4 h注射1次，共計(jì)3次。末次注射后間隔4 h處死實(shí)驗(yàn)小鼠取材。石蠟包埋制備組織切片，行免疫熒光染色。觀察小鼠海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞增殖情況。于200倍熒光顯微鏡下選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)Brd U陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色觀察三組海馬組織病理學(xué)變化 檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)照組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列緊密，核圓而大，神經(jīng)纖維排列整齊而密集；模型組神經(jīng)細(xì)胞排列稀疏，核小深染，膠質(zhì)細(xì)胞增生；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)細(xì)胞排列排列較模型組整齊，核固縮減輕，膠質(zhì)細(xì)胞輕度增生(圖1)。

2.2 Western blot檢測(cè)PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路相關(guān)因子蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 見(jiàn)表1。檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組總PI3K、AKT和mTOR蛋白水平以及p-PI3K、p-AKT和p-mTOR水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；提示PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路的激活。同時(shí)，與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組總PI3K、AKT和mTOR蛋白水平以及p-PI3K、p-AKT和p-mTOR水平則明顯抑制(均P<0.05)；提示PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路的抑制。且與正常對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組總PI3K、AKT和mTOR、p-PI3K、p-AKT和p-mTOR水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

圖1 三組海馬組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE染色，×400)

表1 三組PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路相關(guān)因子蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

2.3 Western blot檢測(cè)增殖相關(guān)因子蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 見(jiàn)表2。與正常對(duì)照組比較，模型組PCNA和Ki-67蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。同時(shí)，與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組PCNA和Ki-67蛋白相對(duì)表達(dá)則明顯升高(均P<0.05)。與正常對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組PCNA和Ki-67蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表2 三組增殖相關(guān)因子蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

2.4 Brd U摻入法檢測(cè)化痰祛瘀方處理Wilson病模型小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖 Brd U摻入法檢測(cè)化痰祛瘀方處理Wilson病模型小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖情況。模型組Brd U陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(10.65±3.24)較正常對(duì)照組(60.22±9.37)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)，與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組Brd U陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(144.68±14.60)則顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Brd U陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)亦明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

Wilson病得名于1911年Wilson的首次報(bào)道，又稱肝豆?fàn)詈俗冃?，或威爾遜變性[7]。該病好發(fā)于青少年，是一種常染色體隱性遺傳性疾病，主要表現(xiàn)為先天性銅代謝障礙[12]。Wilson病的臨床表現(xiàn)包括食欲不振、輕度黃疸、肝臟腫大和腹水，部分患者可能出現(xiàn)進(jìn)行性脾臟腫大和脾功能亢進(jìn)等[13]。Wilson病的治療受益于早期診斷，以糾正患者銅代謝平衡。肝、腦、腎、角膜等臟器的銅沉積可進(jìn)一步導(dǎo)致患者組織損害及病變，因此及早診療對(duì)于Wilson病患者至關(guān)重要。在中醫(yī)學(xué)角度而言，考慮到Wilson病的病機(jī)，銅在維持人體正常新陳代謝上發(fā)揮重要作用。然而，病理?xiàng)l件下，機(jī)體水液代謝失常，導(dǎo)致血淤痰堵，進(jìn)而痰淤互結(jié)，最終構(gòu)成Wilson病的主要病機(jī)[14-15]?；谇笆鰞?nèi)容，痰淤互結(jié)構(gòu)成Wilson病治療的關(guān)鍵。

在本研究中，針對(duì)Wilson病痰淤互結(jié)的病因以及銅代謝障礙的病理，筆者研究團(tuán)隊(duì)選用Wilson病模型4月齡TX小鼠設(shè)置治療方案實(shí)驗(yàn)組和模型對(duì)照，并選用4月齡DL小鼠作為模型對(duì)照，探究本研究組方對(duì)Wilson病模型小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖的影響，明確該組方的效果。本研究所選化痰祛瘀方以大黃、姜黃、黃連、澤瀉、金錢草和三七六味藥為主，其中，大黃和黃連可有助于促進(jìn)機(jī)體銅排泄，發(fā)揮解毒功效[16-17]；姜黃和三七可活血化瘀[18-19]，澤瀉可利水滲濕、泄熱泄?jié)?，金錢草可解毒散瘀[20-21]。

成年鼠的神經(jīng)干細(xì)胞一般處于相對(duì)靜息狀態(tài)，而腦損傷或缺血等病理狀態(tài)可引起海馬神經(jīng)再生[22]。同時(shí)，Brd U是胸腺嘧啶的衍生物，其摻入具有穩(wěn)定性，可隨DNA復(fù)制進(jìn)入細(xì)胞[23]。因此，Brd U特異性抗體的使用可檢測(cè)Brd U摻入情況，從而反映細(xì)胞增殖能力。本研究發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，模型小組Brd U陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)降低，提示銅代謝障礙導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖的抑制；而實(shí)驗(yàn)組Brd U陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)升高，提示化痰祛瘀方可有助于促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖。模型組PCNA和Ki-67蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比明顯降低；而與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組PCNA和Ki-67蛋白表達(dá)則明顯升高。PCNA和Ki-67為常見(jiàn)細(xì)胞增殖相關(guān)標(biāo)志物，二者水平變化與細(xì)胞增殖呈正相關(guān)[24]。此外，與正常對(duì)照組相比，模型組總PI3K、AKT和mTOR以及p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白水平較正常對(duì)照組明顯升高；而實(shí)驗(yàn)組前述指標(biāo)水平則較模型組顯著降低。眾所周知，PI3K、AKT和mTOR為PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白，其中PI3K可通過(guò)磷酸化產(chǎn)生磷脂?；姿崦铬?；AKT是PI3K下游關(guān)鍵蛋白；而mTOR是保守絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是該通路的關(guān)鍵位點(diǎn)；三者可參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和凋亡等[25]。以上結(jié)果提示化痰祛瘀方對(duì)Wilson病具有明顯的抑制作用。因此，我們初步認(rèn)為化痰祛瘀方是通過(guò)抑制PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路激活從而發(fā)揮抑制Wilson病模型小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖作用的。

綜上所述，本研究通過(guò)Wilson病模型TX小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，化痰祛瘀方處理可有助于促進(jìn)Wilson病小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞增殖，上調(diào)PCNA和Ki-67蛋白表達(dá)水平。其機(jī)制可能與抑制PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路激活，下調(diào)PI3K、AKT和mTOR磷酸化水平相關(guān)。