加味大黃蟲顆粒對精索靜脈曲張模型大鼠精子線粒體結構的影響

盧森寶，王權勝，莫宏芳，蒙帥杰，楊德芬，代 波，鄭翼弛

(1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

根據數據統(tǒng)計，全球范圍內已婚夫婦因各種原因引起的不孕不育率已高達15%，而因精索靜脈曲張引起的不育癥約占25%以上[1]。精索靜脈曲張(Varicocele，VC)導致不育癥的可能病理原因是因為血管病變導致睪丸組織局部血液循環(huán)障礙，局部溫度升高，物質代謝異常引起支持細胞損傷、氧化應激損傷、生精細胞凋亡等[2]。對比現代醫(yī)學治療手段，中醫(yī)以補腎祛瘀法[3]對精索靜脈曲張性不育癥的治療有一定的特色。我們立足于《金匱要略·血虛虛勞病第六篇》的理論基礎，認為精索靜脈曲張導致不育癥的主要病因病機是腎虛血瘀，以致“營氣不從，腎精虧虛”。使用加味大黃蟲顆粒治療，能祛瘀通閉，補腎生精。前期的實驗研究及臨床治療得到一定的效果[4-5]。本實驗研究在現有基礎上，使用加味大黃蟲顆粒治療VC大鼠模型，觀察其對VC大鼠模型精子質量及線粒體結構的影響，深入探索其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 從廣西醫(yī)科大學動物實驗中心購買40只雄性大鼠，8～10周齡，體重在180～210 g之間,動物許可證號[SCXK(桂)2019-0003]。隨機選取10只大鼠為假手術組，剩余30只大鼠按照隨機數字表法分為邁之靈組10只、加味大黃蟲顆粒組10只、模型組10只。適應性飼養(yǎng)1周，每天按時投放飼料、飲用水、自由飲食。木屑墊料，保持墊料干燥清潔。環(huán)境溫度23～25 ℃，自然光照。

1.2 實驗設備與試劑 精子質量檢測系統(tǒng)WLJY-9000和精子計數板MACRO(北京新世界科技發(fā)展公司)，光學生物顯微鏡，型號DM3000(德國 LEICA 公司)由廣西中醫(yī)藥大學男科實驗室提供。透射電子顯微鏡型號TECNAIG20TWIN；圖像采集軟件：Leica Application Suite V4，病理組織烤片機TEC2602型(德國FEI公司)，由廣西醫(yī)科大學電鏡室觀察分析。

1.4 動物造模與給藥方法 所有大鼠均適應性喂養(yǎng)1周后，按照Turner深靜脈縮窄術[6]進行造模。造模成功后，加味大黃蟲顆粒組給予濃度為2.4 g/ml的顆粒沖劑灌胃，假手術組和模型組予以等量的生理鹽水進行灌胃，邁之靈組則予54 mg/kg邁之靈片，各組均按照每100 g體重給予1 ml藥液灌胃，灌胃8周。

1.5 實驗室觀察及檢測方法

1.5.1 取材方法：末次給藥24 h后，將大鼠稱重，然后頭頸脫臼法處死大鼠，迅速開腹取出左側睪丸組織，用生理鹽水沖洗，除去血液。將大鼠睪丸分別固定在Bouin溶液中24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟切片包埋，HE染色，做睪丸組織HE染色檢測和電鏡備檢用。

1.5.2 睪丸精子質量相關參數分析：取大鼠左側睪丸組織，置于5 ml生理鹽水，在預制37 ℃條件下剪碎、混勻，靜置15 min，使精子游離出。采用精子計數板檢測精子濃度、總活率及運動指數。按照WHO《人類精液檢查與處理實驗室檢驗手冊》第五版[7]標準，測定精液質量相關參數。

1.5.3 透視電鏡制片及觀察方法：取1～2 mm3睪丸組織，加入2.5%戊二醛，于4 ℃保存,經鋨酸固定，酒精脫水，滲透劑(丙酮、環(huán)氧樹脂)滲透，將滲透好的組織放入包埋板中用環(huán)氧樹脂聚合48 h后予超薄切片機切片80～100 nm，經鈾鉛雙染色，最后用電鏡觀察。

1.5.4 HE染色法檢測：睪丸組織切片行蘇木精-伊紅(HE)染色,每組制作10張切片,每張切片隨機取兩個視野觀察睪丸組織(×200,每組觀察20個視野)。在睪丸生精小管的15個橫切面進行觀察和評價。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行分析，數據以均數±標準差進行單因素方差分析，組間比較使用LSD檢驗和χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 造模后大鼠動物外觀體征和行為表現 造模后1周內各組大鼠均出現不同程度活動減少,食欲下降，畏懼感增加等表現，1周后上述情況逐漸好轉。在造模過程中因注射麻藥出現死亡2只(模型組1只、大黃蟲顆粒組1只)，喂養(yǎng)過程中因大鼠相互撕咬打斗死亡2只(邁之靈組1只，模型組1只)。

2.2 各組大鼠治療8周后附睪精子質量比較 見表1。與假手術組比較，模型組的大鼠附睪精子濃度、精子總活率、前向運動精子百分比下降明顯(P<0.05)；與模型組比較，加味大黃蟲顆粒組精子濃度、精子總活率、前向運動精子百分比均升高(均P<0.05)。

2.3 各組大鼠治療8周后附睪精子運動參數比較 見表2。與假手術組比較，模型組的大鼠精子直線速度(VSL)、精子曲線速度(VCL)、平均路徑速度(VAP)、精子頭側擺幅度(ALH)下降明顯，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與模型組比較，大黃蟲顆粒組VSL、VCL、VAP、ALH均升高(P<0.05)。

2.4 各組大鼠睪丸組織HE染色結果 各組大鼠睪丸組織HE染色報告顯示(圖1)，假手術組生精小管在光學顯微鏡下可見，生精上皮中精原細胞，初級及次級精母細胞和精子細胞、各期生精細胞排列整齊，結構正常，管腔內存在超過20個成熟精子/生精小管，精子釋放良好。說明睪丸精子生成功能良好。加味大黃蟲顆粒組可見生精小管部分萎縮，生精上皮中精原細胞，初級及次級精母細胞、精子細胞、各期生精細胞排列始于紊亂，管腔有脫落的生精細胞或管腔輕微阻塞，有超過20個成熟精子/生精小管，精子釋放可。說明睪丸精子生成功能降低。邁之靈組生精上皮中精原細胞，初級及次級精母細胞、精子細胞、各期生精細胞排列紊亂，細胞變性，管腔有脫落的生精細胞或管腔輕微阻塞，有少于20個成熟精子/生精小管，精子釋放不良。說明睪丸精子生成功能降低。模型組生精小管發(fā)育不良，管腔空化，生精上皮中各期生精細胞凋亡嚴重，說明精子細胞分化障礙，精子生成低下，無精子癥。

表1 各組大鼠治療8周后附睪精子質量比較

表2 各組大鼠治療8周后附睪精子運動參數比較

A：假手術組；B：加味大黃蟲顆粒組；C：邁之靈組；D：模型組圖1 各組大鼠光鏡下睪丸組織結構變化 (HE染色，×200)

2.5 各組大鼠精子線粒體電鏡病理結果 各組大鼠精子線粒體電鏡病理報告顯示(圖2)，假手術組,電鏡下精子形態(tài)結構良好，精子線粒體有序規(guī)則排列于精子兩側，以卵圓形線粒體為主，相鄰線粒體膜分界清晰，線粒體外模完整。加味大黃蟲顆粒組精子線粒體在電鏡下可見線粒體排列有序，但部分線粒體發(fā)育異常，大小長短不一，線粒體結構、形態(tài)基本正常。邁之靈組精子結構不完整，精子膜破裂，線粒體排列紊亂，線粒體形態(tài)、結構基本正常。模型組精子未見完整線粒體結構，線粒體結構破壞、線粒體溶解消失等。

A:假手術組;B:加味大黃蟲顆粒組;C:邁之靈組；D:模型組圖2 各組大鼠電鏡下精子線粒體結構變化(×5000)

3 討 論

根據WTO統(tǒng)計顯示，VC是引起不育癥的首要原因[8]，隨著中國地區(qū)男性不育癥發(fā)病率逐年增高[9]，男性不育問題應該受到更多的關注與研究。VC會導致睪丸局部血液循環(huán)障礙，出現睪丸供血不足，生精小管基膜和間質小血管免疫復合物沉積增加，間質細胞損傷和睪丸局部溫度增加，生精小管正常的物質交換出現障礙，影響精子產生[10]。當精子代謝底物不足時，精子線粒體的功能會出現紊亂，不能產生足夠的能量維持精子正常的活動，影響精子的精子活力及受精能力[11]。

線粒體是產生三磷酸腺苷(ATP)的細胞器，為生物體能量代謝合成ATP，維持生命體的生命活動。不同于體細胞線粒體，精子線粒體主要包裹于精子中段軸絲周圍，形成纖維鞘[12]，精子線粒體鞘是精子分解營養(yǎng)物質和合產生能量的主要場所，精子線粒體具有多種代謝通路如脂肪酸的β-氧化、氨基酸代謝等，使得精子能夠利用不同的代謝底物進行利用，正是精子線粒體的這種結構特殊性與功能多樣性，是維持精子發(fā)育與精子運動穩(wěn)定的能量來源，是確保精子受精能力的關鍵[13]。精子線粒體的功能不僅是合成ATP，還參與精子超激活運動、精子獲能、頂體反應、調整鈣離子穩(wěn)態(tài)，調控細胞凋亡到最終受精等多種生理過程。在正常的精子線粒體中，由三磷酸循環(huán)產生的ATP傳遞給電子，同時將質子從線粒體內膜的基質側泵到內膜側，形成跨膜電位差,線粒體膜結構的完整性是跨膜電位形成必要條件。線粒體膜電位反映了線粒體的能量狀態(tài)，是反映線粒體功能的主要指標[14]。線粒體結構與功能的完整性與精子的運動、獲能、頂體反應及受精能力關系密切[15]。當精子線粒體的結構與功能的損傷，將影響線粒體氧化磷酸化合成ATP，使得精子運動及受精所需的能量出現供給不足，對精子發(fā)生、發(fā)育過程造成很大影響，導致精子活力低下及受精能力下降等，最終可能導致不育。

我們認為VC性不育癥主要在腎，與肝脾有關，腎虛血瘀，氣血運行不暢，經脈瘀滯，加之肝脾不調，以致“營氣不從，腎精虧虛”[16-19]。我們立論于“虛勞干血”，潤以濡其干，蟲以動其瘀，通以去其閉的治療思想，運用加味大黃蟲顆粒治療。本方原出自張仲景大黃蟲丸，具有活血化瘀、益氣養(yǎng)陰、補腎填精之功效。現代藥理研究表明本方藥物具有的抗炎、抗凝、溶栓、抗氧化、拮抗生精細胞凋亡等功效[20-23]。前期的實驗研究表明，加味大黃蟲顆粒能改善精索靜脈曲張大鼠睪丸的病理損傷,提升睪丸組織中Nrf2的蛋白表達,有利于精子的發(fā)生發(fā)育[24]；加味大黃蟲顆粒能有效抑制精索靜脈曲張引起的睪丸組織損傷,修復睪丸的氧化應激傷害,降低生精細胞的凋亡率，起到維護精子發(fā)生的內環(huán)境作用，有利于提高精子質量[25]。