加味大黃蟲顆粒對(duì)精索靜脈曲張模型大鼠精子線粒體結(jié)構(gòu)的影響

盧森寶，王權(quán)勝，莫宏芳，蒙帥杰，楊德芬，代 波，鄭翼弛

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)已婚夫婦因各種原因引起的不孕不育率已高達(dá)15%，而因精索靜脈曲張引起的不育癥約占25%以上[1]。精索靜脈曲張(Varicocele，VC)導(dǎo)致不育癥的可能病理原因是因?yàn)檠懿∽儗?dǎo)致睪丸組織局部血液循環(huán)障礙，局部溫度升高，物質(zhì)代謝異常引起支持細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激損傷、生精細(xì)胞凋亡等[2]。對(duì)比現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療手段，中醫(yī)以補(bǔ)腎祛瘀法[3]對(duì)精索靜脈曲張性不育癥的治療有一定的特色。我們立足于《金匱要略·血虛虛勞病第六篇》的理論基礎(chǔ)，認(rèn)為精索靜脈曲張導(dǎo)致不育癥的主要病因病機(jī)是腎虛血瘀，以致“營(yíng)氣不從，腎精虧虛”。使用加味大黃蟲顆粒治療，能祛瘀通閉，補(bǔ)腎生精。前期的實(shí)驗(yàn)研究及臨床治療得到一定的效果[4-5]。本實(shí)驗(yàn)研究在現(xiàn)有基礎(chǔ)上，使用加味大黃蟲顆粒治療VC大鼠模型，觀察其對(duì)VC大鼠模型精子質(zhì)量及線粒體結(jié)構(gòu)的影響，深入探索其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 從廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買40只雄性大鼠，8～10周齡，體重在180～210 g之間,動(dòng)物許可證號(hào)[SCXK(桂)2019-0003]。隨機(jī)選取10只大鼠為假手術(shù)組，剩余30只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為邁之靈組10只、加味大黃蟲顆粒組10只、模型組10只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，每天按時(shí)投放飼料、飲用水、自由飲食。木屑?jí)|料，保持墊料干燥清潔。環(huán)境溫度23～25 ℃，自然光照。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑 精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)WLJY-9000和精子計(jì)數(shù)板MACRO(北京新世界科技發(fā)展公司)，光學(xué)生物顯微鏡，型號(hào)DM3000(德國(guó) LEICA 公司)由廣西中醫(yī)藥大學(xué)男科實(shí)驗(yàn)室提供。透射電子顯微鏡型號(hào)TECNAIG20TWIN；圖像采集軟件：Leica Application Suite V4，病理組織烤片機(jī)TEC2602型(德國(guó)FEI公司)，由廣西醫(yī)科大學(xué)電鏡室觀察分析。

1.4 動(dòng)物造模與給藥方法 所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照Turner深靜脈縮窄術(shù)[6]進(jìn)行造模。造模成功后，加味大黃蟲顆粒組給予濃度為2.4 g/ml的顆粒沖劑灌胃，假手術(shù)組和模型組予以等量的生理鹽水進(jìn)行灌胃，邁之靈組則予54 mg/kg邁之靈片，各組均按照每100 g體重給予1 ml藥液灌胃，灌胃8周。

1.5 實(shí)驗(yàn)室觀察及檢測(cè)方法

1.5.1 取材方法：末次給藥24 h后，將大鼠稱重，然后頭頸脫臼法處死大鼠，迅速開腹取出左側(cè)睪丸組織，用生理鹽水沖洗，除去血液。將大鼠睪丸分別固定在Bouin溶液中24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟切片包埋，HE染色，做睪丸組織HE染色檢測(cè)和電鏡備檢用。

1.5.2 睪丸精子質(zhì)量相關(guān)參數(shù)分析：取大鼠左側(cè)睪丸組織，置于5 ml生理鹽水，在預(yù)制37 ℃條件下剪碎、混勻，靜置15 min，使精子游離出。采用精子計(jì)數(shù)板檢測(cè)精子濃度、總活率及運(yùn)動(dòng)指數(shù)。按照WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)》第五版[7]標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定精液質(zhì)量相關(guān)參數(shù)。

1.5.3 透視電鏡制片及觀察方法：取1～2 mm3睪丸組織，加入2.5%戊二醛，于4 ℃保存,經(jīng)鋨酸固定，酒精脫水，滲透劑(丙酮、環(huán)氧樹脂)滲透，將滲透好的組織放入包埋板中用環(huán)氧樹脂聚合48 h后予超薄切片機(jī)切片80～100 nm，經(jīng)鈾鉛雙染色，最后用電鏡觀察。

1.5.4 HE染色法檢測(cè)：睪丸組織切片行蘇木精-伊紅(HE)染色,每組制作10張切片,每張切片隨機(jī)取兩個(gè)視野觀察睪丸組織(×200,每組觀察20個(gè)視野)。在睪丸生精小管的15個(gè)橫切面進(jìn)行觀察和評(píng)價(jià)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行單因素方差分析，組間比較使用LSD檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 造模后大鼠動(dòng)物外觀體征和行為表現(xiàn) 造模后1周內(nèi)各組大鼠均出現(xiàn)不同程度活動(dòng)減少,食欲下降，畏懼感增加等表現(xiàn)，1周后上述情況逐漸好轉(zhuǎn)。在造模過(guò)程中因注射麻藥出現(xiàn)死亡2只(模型組1只、大黃蟲顆粒組1只)，喂養(yǎng)過(guò)程中因大鼠相互撕咬打斗死亡2只(邁之靈組1只，模型組1只)。

2.2 各組大鼠治療8周后附睪精子質(zhì)量比較 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組的大鼠附睪精子濃度、精子總活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分比下降明顯(P<0.05)；與模型組比較，加味大黃蟲顆粒組精子濃度、精子總活率、前向運(yùn)動(dòng)精子百分比均升高(均P<0.05)。

2.3 各組大鼠治療8周后附睪精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)比較 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組的大鼠精子直線速度(VSL)、精子曲線速度(VCL)、平均路徑速度(VAP)、精子頭側(cè)擺幅度(ALH)下降明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與模型組比較，大黃蟲顆粒組VSL、VCL、VAP、ALH均升高(P<0.05)。

2.4 各組大鼠睪丸組織HE染色結(jié)果 各組大鼠睪丸組織HE染色報(bào)告顯示(圖1)，假手術(shù)組生精小管在光學(xué)顯微鏡下可見，生精上皮中精原細(xì)胞，初級(jí)及次級(jí)精母細(xì)胞和精子細(xì)胞、各期生精細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，管腔內(nèi)存在超過(guò)20個(gè)成熟精子/生精小管，精子釋放良好。說(shuō)明睪丸精子生成功能良好。加味大黃蟲顆粒組可見生精小管部分萎縮，生精上皮中精原細(xì)胞，初級(jí)及次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、各期生精細(xì)胞排列始于紊亂，管腔有脫落的生精細(xì)胞或管腔輕微阻塞，有超過(guò)20個(gè)成熟精子/生精小管，精子釋放可。說(shuō)明睪丸精子生成功能降低。邁之靈組生精上皮中精原細(xì)胞，初級(jí)及次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、各期生精細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞變性，管腔有脫落的生精細(xì)胞或管腔輕微阻塞，有少于20個(gè)成熟精子/生精小管，精子釋放不良。說(shuō)明睪丸精子生成功能降低。模型組生精小管發(fā)育不良，管腔空化，生精上皮中各期生精細(xì)胞凋亡嚴(yán)重，說(shuō)明精子細(xì)胞分化障礙，精子生成低下，無(wú)精子癥。

表1 各組大鼠治療8周后附睪精子質(zhì)量比較

表2 各組大鼠治療8周后附睪精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)比較

A：假手術(shù)組；B：加味大黃蟲顆粒組；C：邁之靈組；D：模型組圖1 各組大鼠光鏡下睪丸組織結(jié)構(gòu)變化 (HE染色，×200)

2.5 各組大鼠精子線粒體電鏡病理結(jié)果 各組大鼠精子線粒體電鏡病理報(bào)告顯示(圖2)，假手術(shù)組,電鏡下精子形態(tài)結(jié)構(gòu)良好，精子線粒體有序規(guī)則排列于精子兩側(cè)，以卵圓形線粒體為主，相鄰線粒體膜分界清晰，線粒體外模完整。加味大黃蟲顆粒組精子線粒體在電鏡下可見線粒體排列有序，但部分線粒體發(fā)育異常，大小長(zhǎng)短不一，線粒體結(jié)構(gòu)、形態(tài)基本正常。邁之靈組精子結(jié)構(gòu)不完整，精子膜破裂，線粒體排列紊亂，線粒體形態(tài)、結(jié)構(gòu)基本正常。模型組精子未見完整線粒體結(jié)構(gòu)，線粒體結(jié)構(gòu)破壞、線粒體溶解消失等。

A:假手術(shù)組;B:加味大黃蟲顆粒組;C:邁之靈組；D:模型組圖2 各組大鼠電鏡下精子線粒體結(jié)構(gòu)變化(×5000)

3 討 論

根據(jù)WTO統(tǒng)計(jì)顯示，VC是引起不育癥的首要原因[8]，隨著中國(guó)地區(qū)男性不育癥發(fā)病率逐年增高[9]，男性不育問(wèn)題應(yīng)該受到更多的關(guān)注與研究。VC會(huì)導(dǎo)致睪丸局部血液循環(huán)障礙，出現(xiàn)睪丸供血不足，生精小管基膜和間質(zhì)小血管免疫復(fù)合物沉積增加，間質(zhì)細(xì)胞損傷和睪丸局部溫度增加，生精小管正常的物質(zhì)交換出現(xiàn)障礙，影響精子產(chǎn)生[10]。當(dāng)精子代謝底物不足時(shí)，精子線粒體的功能會(huì)出現(xiàn)紊亂，不能產(chǎn)生足夠的能量維持精子正常的活動(dòng)，影響精子的精子活力及受精能力[11]。

線粒體是產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP)的細(xì)胞器，為生物體能量代謝合成ATP，維持生命體的生命活動(dòng)。不同于體細(xì)胞線粒體，精子線粒體主要包裹于精子中段軸絲周圍，形成纖維鞘[12]，精子線粒體鞘是精子分解營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和合產(chǎn)生能量的主要場(chǎng)所，精子線粒體具有多種代謝通路如脂肪酸的β-氧化、氨基酸代謝等，使得精子能夠利用不同的代謝底物進(jìn)行利用，正是精子線粒體的這種結(jié)構(gòu)特殊性與功能多樣性，是維持精子發(fā)育與精子運(yùn)動(dòng)穩(wěn)定的能量來(lái)源，是確保精子受精能力的關(guān)鍵[13]。精子線粒體的功能不僅是合成ATP，還參與精子超激活運(yùn)動(dòng)、精子獲能、頂體反應(yīng)、調(diào)整鈣離子穩(wěn)態(tài)，調(diào)控細(xì)胞凋亡到最終受精等多種生理過(guò)程。在正常的精子線粒體中，由三磷酸循環(huán)產(chǎn)生的ATP傳遞給電子，同時(shí)將質(zhì)子從線粒體內(nèi)膜的基質(zhì)側(cè)泵到內(nèi)膜側(cè)，形成跨膜電位差,線粒體膜結(jié)構(gòu)的完整性是跨膜電位形成必要條件。線粒體膜電位反映了線粒體的能量狀態(tài)，是反映線粒體功能的主要指標(biāo)[14]。線粒體結(jié)構(gòu)與功能的完整性與精子的運(yùn)動(dòng)、獲能、頂體反應(yīng)及受精能力關(guān)系密切[15]。當(dāng)精子線粒體的結(jié)構(gòu)與功能的損傷，將影響線粒體氧化磷酸化合成ATP，使得精子運(yùn)動(dòng)及受精所需的能量出現(xiàn)供給不足，對(duì)精子發(fā)生、發(fā)育過(guò)程造成很大影響，導(dǎo)致精子活力低下及受精能力下降等，最終可能導(dǎo)致不育。

我們認(rèn)為VC性不育癥主要在腎，與肝脾有關(guān)，腎虛血瘀，氣血運(yùn)行不暢，經(jīng)脈瘀滯，加之肝脾不調(diào)，以致“營(yíng)氣不從，腎精虧虛”[16-19]。我們立論于“虛勞干血”，潤(rùn)以濡其干，蟲以動(dòng)其瘀，通以去其閉的治療思想，運(yùn)用加味大黃蟲顆粒治療。本方原出自張仲景大黃蟲丸，具有活血化瘀、益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)腎填精之功效。現(xiàn)代藥理研究表明本方藥物具有的抗炎、抗凝、溶栓、抗氧化、拮抗生精細(xì)胞凋亡等功效[20-23]。前期的實(shí)驗(yàn)研究表明，加味大黃蟲顆粒能改善精索靜脈曲張大鼠睪丸的病理?yè)p傷,提升睪丸組織中Nrf2的蛋白表達(dá),有利于精子的發(fā)生發(fā)育[24]；加味大黃蟲顆粒能有效抑制精索靜脈曲張引起的睪丸組織損傷,修復(fù)睪丸的氧化應(yīng)激傷害,降低生精細(xì)胞的凋亡率，起到維護(hù)精子發(fā)生的內(nèi)環(huán)境作用，有利于提高精子質(zhì)量[25]。