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    和調健脾方對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠的治療作用及機制研究

    2021-05-18 07:11:10陳賢家符士穎蔡翠珠呂迎春
    陜西中醫(yī) 2021年5期
    關鍵詞:維溴銨低劑量健脾

    陳賢家,符士穎,蔡翠珠,呂迎春

    (1.儋州市中醫(yī)醫(yī)院脾胃病科,海南 儋州 571700;2.三亞市中醫(yī)院脾胃科,海南 三亞 572000)

    腸易激綜合征是一組持續(xù)或間歇發(fā)作,以腹痛、腹脹、排便習慣和(或)大便性狀改變?yōu)榕R床表現(xiàn),而缺乏胃腸道結構和生化異常的腸道功能紊亂性疾病[1]。大多數報道都集中在胃腸蠕動障礙或遠端結腸的內臟超敏反應。此外,研究表明,腸易激綜合征大鼠的腸道通透性增加[2-3]。核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)/Notch1通路在腸易激綜合征期間調節(jié)腸通透性,其作為腸緊密連接蛋白的有效調節(jié)細胞因子[4-5]。有報道稱腸易激綜合征是由應激誘導的腦-腸軸變化引起的,導致腸道通透性過高,從而加劇黏膜下異常免疫反應[6]。然而,尚不清楚導致腸易激綜合征腸黏膜屏障功能受損的確切病理生理信號。和調健脾方是中藥的經典處方之一。它由多種中藥組成:炒柴胡、炒白芍、炒白術、炒黨參、廣木香、炒陳皮、佛手片、廣藿香、焦薏苡仁、干荷葉、淡干姜。目前尚未見關于和調健脾方治療腸易激綜合征動物模型以探討其藥效學和機制的文獻。本研究擬探討和調健脾方對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠的治療作用及NF-κB/Notch1通路的影響,為腹瀉型腸易激綜合征的治療提供理論依據。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠,雌雄不限,10周齡,體重260~280 g,購自四川大學實驗動物中心,動物生產許可證號:SCXK(川)2018-0001,動物使用許可證號:SYXK(川)2018-0004,動物質量合格證號:SD203671,大鼠飼養(yǎng)環(huán)境為:溫度(22~26 ℃)、光照(12 h∶12 h光照-黑暗循環(huán))、濕度60%~70%。

    1.2 主要藥物、試劑與儀器 和調健脾方成分為:炒柴胡、炒黨參各18 g,炒白芍12 g,炒白術、佛手片、焦薏苡仁、干荷葉各9 g,廣藿香6 g,炒陳皮4.5 g,廣木香、淡干姜各3 g(以上中藥材均購自四川國強中藥飲片有限公司),以上中藥煎煮2次,每次1 h,混合2次藥液,過濾,濃縮成生藥濃度為0.282、0.564 g/ml的湯劑;番瀉葉(批號 301876);匹維溴銨片(規(guī)格50 mg/片,批號:20200402);白細胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、二胺氧化酶(Diamine oxidase,DAO)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海佰曄生物科技中心,批號分別為:CP-3012R、CP-4007、CP-5116);蘇木精-伊紅(Hematoxylin eosin,HE)染色試劑盒、放射免疫沉淀緩沖液(上海碧云天生物技術研究所,批號分別為:DP1063、DP3315);TRIzol試劑(美國Invitrogen公司,批號:15547012);反轉錄試劑盒(日本Takara公司,批號:RR117);SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(德國QIAGEN公司,批號:WE85532);BCA蛋白質檢測試劑盒(美國Pierce公司,批號:XC59963.32);NF-κB單克隆抗體、Notch1單克隆抗體、GAPDH單克隆抗體、山羊抗鼠二抗(美國Abcam公司,批號分別為:ab40754、ab31108、ab39005、ab10018);增強的ECL化學發(fā)光試劑盒(美國Pierce公司,批號:SD-306D)。酶標儀(山東恒美電子科技有限公司,型號:HM-SY96A);顯微鏡(日本尼康公司,型號:E200 POL);實時PCR檢測系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司,型號:CFX96Touch);凝膠成像儀(北京君意華鑫科技有限公司,型號:JY-Clear ECL)。

    1.3 造模及分組 將大鼠適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗,參照文獻[7]的方法進行腹瀉型腸易激綜合征造模,將大鼠給予番瀉葉水煎液(濃度0.3 g/ml)灌胃,灌胃體積10 ml/kg,每天灌胃1次,每次灌胃后1 h,用繩子將大鼠四肢束縛1 h,再將大鼠放入冷水池中刺激30 min,連續(xù)兩周。當大鼠出現(xiàn)體重減輕,排稀便,精神萎靡不振,食欲減退,倦怠少動等癥狀,則表示造模成功[7]。將造模成功的48只大鼠按隨機數字表法分成模型組、匹維溴銨組、和調健脾方低劑量組、和調健脾方高劑量組,每組12只;另取12只健康大鼠作為對照組,對照組大鼠每天灌胃10 ml/kg的蒸餾水。

    1.4 給 藥 造模成功后第1天,匹維溴銨組大鼠給予2 mg/kg匹維溴銨[8]灌胃(匹維溴銨與蒸餾水配制成濃度為0.2 mg/ml的溶液,灌胃體積10 ml/kg),和調健脾方低劑量組、和調健脾方高劑量組大鼠分別給予2.82、5.64g/kg和調健脾方[9]灌胃(濃度分別為0.282、0.564 g/ml的生藥,灌胃體積10 ml/kg),對照組和模型組大鼠灌胃等體積蒸餾水,每天給藥1次,連續(xù)給藥14 d。

    1.5 檢測指標

    1.5.1 大鼠排便頻率、糞便含水量的測定:給藥周期結束后,將大鼠放在籠中24 h,自由進食和飲水,計算大鼠每小時的平均排便次數作為排便頻率。收集糞便顆粒進行稱重(m0),然后將糞便顆粒在烤箱中干燥后再次稱重(m1),計算糞便含水量,糞便含水量=(m0-m1)/m0×100%。

    1.5.2 大鼠血清IL-2、TNF-α、DAO水平的測定:實驗結束后,大鼠尾靜脈采血,3000 r/min離心分離血清,采用ELISA試劑盒檢測血清IL-2、TNF-α、DAO水平。

    1.5.3 大鼠結腸組織形態(tài)學觀察:頸脫臼處死大鼠,獲取結腸組織,用生理鹽水沖洗并在4%多聚甲醛中固定過夜,然后用連續(xù)的脫水步驟處理結腸組織,并包埋在石蠟塊中,將結腸組織切成薄片并進行標準HE染色,從每組中選擇3個樣本,并從每個樣本中選擇4個區(qū)域觀察,以評估黏膜層的腸黏膜屏障完整性和炎性細胞浸潤。

    1.5.4 大鼠結腸組織NF-κB、Notch1 mRNA水平的測定:用TRIzol試劑提取結腸組織總RNA,對于總RNA逆轉錄,使用反轉錄試劑盒將500 ng總RNA反轉錄為cDNA,基因表達通過SYBR Green熒光定量PCR試劑盒在實時PCR檢測系統(tǒng)上操作。將NF-κB、Notch1 mRNA的相對表達水平標準化為GAPDH表達,使用2-△△Ct方法計算mRNA表達的相對倍數變化。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成,引物序列如下:NF-κB為(正向)5’-ACACCAGACCGCAGCTCCATCAAGT-3’和(反向)5’-TCCATTGCTGCTGTCTGATTTGTAG-3’;Notch1為(正向)5’-TGTACGTGAAGCATGCCGTGACT-3’和(反向)5’-GGTGACGTGATTTTCTGTTCGTA-3’;GAPDH為(正向)5’-GCCAGTGGACTCCACGACTGGA-3’和(反向)5’-CAACTACATGGTTTACATGTTC-3’。重復該實驗至少3遍。PCR擴增條件如下:95 ℃持續(xù)10 min,然后進行40個95 ℃持續(xù)10 s和60 ℃持續(xù)30 s的循環(huán)。

    1.5.5 大鼠結腸組織NF-κB、Notch1蛋白水平的測定:將結腸組織在放射免疫沉淀緩沖液中裂解,收集蛋白質并使用BCA蛋白質檢測試劑盒進行定量,用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離40 μg蛋白質樣品,并將其轉移到聚偏二氟乙烯膜上,將膜在5%脫脂牛奶中室溫下封閉1 h。加入NF-κB(1∶1000)、Notch(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)單克隆抗體與膜在4 ℃孵育過夜,然后將膜用PBS緩沖液洗滌3次,并與山羊抗鼠二抗(1∶5000)在室溫下孵育1 h。使用增強的ECL化學發(fā)光試劑盒顯示蛋白印跡,通過使用凝膠成像儀對條帶的強度進行定量。

    1.6 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行分析,實驗結果采用均數±標準差表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結 果

    2.1 各組大鼠排便頻率、糞便含水量比較 見表1。與對照組比較,模型組大鼠排便頻率、糞便含水量明顯升高(P<0.05);與模型組比較,匹維溴銨組、和調健脾方低劑量組、和調健脾方高劑量組大鼠排便頻率、糞便含水量降低(P<0.05);且和調健脾方高劑量組大鼠排便頻率、糞便含水量低于和調健脾方低劑量組(P<0.05);和調健脾方高劑量組大鼠排便頻率、糞便含水量與匹維溴銨組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

    表1 各組大鼠排便頻率、糞便含水量比較

    2.2 各組大鼠血清IL-2、TNF-α、DAO水平比較 見表2。與對照組比較,模型組大鼠血清IL-2、TNF-α、DAO水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,匹維溴銨組、和調健脾方低劑量組、和調健脾方高劑量組大鼠血清IL-2、TNF-α、DAO水平降低(P<0.05);且和調健脾方高劑量組大鼠血清IL-2、TNF-α、DAO水平低于和調健脾方低劑量組(P<0.05);和調健脾方高劑量組大鼠血清IL-2、TNF-α、DAO水平與匹維溴銨組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

    表2 各組大鼠血清IL-2、TNF-α、DAO水平比較

    2.3 各組大鼠結腸組織病理觀察 對照組結腸黏膜組織結構正常;模型組腸絨毛變短、增厚、脫落,腸黏膜上皮細胞脫落,可見明顯炎癥細胞浸潤;匹維溴銨組及和調健脾方高劑量組結腸黏膜上皮細胞脫落減輕,炎癥細胞浸潤減少;和調健脾方低劑量組仍可見明顯充血及炎癥細胞浸潤(圖1)。

    A:對照組;B:模型組;C:匹維溴銨組;D:和調健脾方低劑量組;E:和調健脾方高劑量組圖1 各組大鼠結腸組織病理結構觀察(HE染色,×400)

    2.4 各組大鼠結腸組織NF-κB、Notch1 mRNA相對表達水平比較 見表3。與對照組比較,模型組大鼠結腸組織NF-κB、Notch1 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,匹維溴銨組、和調健脾方低劑量組、和調健脾方高劑量組大鼠結腸組織NF-κB、Notch1 mRNA表達水平降低(P<0.05);且和調健脾方高劑量組大鼠結腸組織NF-κB、Notch1 mRNA表達水平低于和調健脾方低劑量組(P<0.05);和調健脾方高劑量組大鼠結腸組織NF-κB、Notch1 mRNA表達水平與匹維溴銨組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

    表3 各組大鼠結腸組織NF-κB、Notch1 mRNA相對表達水平比較

    2.5 各組大鼠結腸組織NF-κB、Notch1蛋白相對表達水平比較 見表4(圖2)。與對照組比較,模型組大鼠結腸組織NF-κB、Notch1蛋白表達水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,匹維溴銨組、和調健脾方低劑量組、和調健脾方高劑量組大鼠結腸組織NF-κB、Notch1蛋白表達水平降低(P<0.05);且和調健脾方高劑量組大鼠結腸組織NF-κB、Notch1蛋白表達水平低于和調健脾方低劑量組(P<0.05);和調健脾方高劑量組大鼠結腸組織NF-κB、Notch1蛋白表達水平與匹維溴銨組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

    表4 各組大鼠結腸組織NF-κB、Notch1蛋白相對表達水平比較

    A:對照組;B:模型組;C:匹維溴銨組;D:和調健脾方低劑量組;E:和調健脾方高劑量組圖2 各組大鼠結腸組織NF-κB、Notch1蛋白電泳圖

    3 討 論

    腸易激綜合征呈持續(xù)或間歇發(fā)作,是一種缺乏胃腸道結構和生化異常的腸道功能紊亂性疾病。近年來,有關腸易激綜合征的相關研究越來越多,然而,腸易激綜合征的確切病理機制仍不清楚,心理和壓力因素被認為是影響腸易激綜合征的重要因素[10]。另外,越來越多的學者認識到低度炎癥在繼發(fā)性腸易激綜合征中起重要作用[11]。作為天然的物理屏障,結腸上皮細胞在防止細菌、病原體和其他抗原侵入腸道黏膜中起著重要的保護作用。腸道屏障的完整性穩(wěn)定了整個腸道生態(tài)系統(tǒng)[12]。已經證明,腸黏膜屏障功能破壞是腸易激綜合征的重要致病因素[13]。因此,恢復腸黏膜屏障功能可能是腸易激綜合征治療的新目標。

    和調健脾方是著名的中藥處方之一,可以有效緩解腹痛和腹瀉,恢復患者體內消化道的平衡。和調健脾方中的23種成分已被成功驗證,包括單萜糖苷、色酮、內酯、有機酸類黃酮和甾類化合物等[9]。然而,關于和調健脾方在腹瀉型腸易激綜合征治療中的藥理作用和機制的研究仍然很有限。因此,本研究旨在探討腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型中和調健脾方的治療機制,并進一步研究和調健脾方對腸黏膜屏障的保護作用及其機制。在本項研究中,模型組大鼠排便頻率、糞便含水量、血清IL-2、TNF-α、DAO明顯高于對照組;和調健脾方低、高劑量組大鼠排便頻率、糞便含水量、血清IL-2、TNF-α、DAO低于模型組。這說明,腹瀉型腸易激綜合征大鼠血清炎癥因子水平較高,并伴有高糞便含水量和高排便頻率,用和調健脾方治療后,腹瀉型腸易激綜合征大鼠的糞便含水量、排便頻率和血清炎癥因子水平降低,腸蠕動頻率減少,表明腸通透性降低。此外結合本研究病理結果,匹維溴銨組及和調健脾方高劑量組結腸黏膜上皮細胞脫落減輕,炎癥細胞浸潤減少,說明和調健脾方可減輕結腸黏膜組織炎癥反應。

    研究表明,NF-κB是一種核轉錄因子,其信號通路參與許多生理過程,包括炎癥反應和先天免疫的調節(jié)[14-17]。NF-κB信號通路的異常激活促進炎癥因子,如Notch1、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和TNF-α的表達,誘發(fā)炎癥級聯(lián)反應和大量中性粒細胞聚集,可引發(fā)一系列病理損傷變化,例如腸上皮細胞損傷和小血管炎,這導致黏膜免疫細胞和趨化因子增加,繼而引起腸通透性增加[18-20]。本研究結果顯示,模型組大鼠結腸組織NF-κB、Notch1 mRNA蛋白表達水平高于對照組,經和調健脾方治療后,和調健脾方低、高劑量組大鼠結腸組織NF-κB、Notch1 mRNA蛋白表達水平降低,且呈劑量依賴性;說明和調健脾方可能通過抑制NF-κB、Notch1 mRNA和蛋白表達進而抑制NF-κB/Notch通路的激活,從而改善腹瀉型腸易激綜合征大鼠腹瀉癥狀,減輕大鼠血清和結腸組織炎癥反應。另外,腹瀉型腸易激綜合征大鼠的黏膜炎癥增加,引起腸黏膜破壞,腸黏膜屏障功能受損,腸通透性增加,用和調健脾方治療可以抑制NF-κB信號傳導,從而調節(jié)腸道通透性。

    綜上所述,和調健脾方可改善腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠腹瀉癥狀,減輕大鼠血清和結腸組織炎癥反應;其機制可能與和調健脾方抑制NF-κB、Notch1 mRNA和蛋白表達水平進而抑制NF-κB/Notch1通路的激活有關。

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