小白菊內(nèi)酯對小兒血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡的影響實驗研究

傅 娟，劉媛媛，李 霞

(1.固原市人民醫(yī)院，寧夏 固原 756000；2.陜西省合陽縣人民醫(yī)院，陜西 合陽 715316；3.西安高新醫(yī)院，陜西 西安 710075)

血管瘤是以血管內(nèi)皮細胞增殖為特征的真性腫瘤[1-2]，在嬰兒中常見，為先天性良性腫瘤或血管畸形，大部分可自行消退，但也有一少部分因生長在特殊部位而影響到組織或器官功能，嚴重危及生命[3-4]。所以，血管瘤的治療是一個不容忽視的問題，也是臨床和科研研究的熱點。臨床上最常用的手術(shù)治療，但風險大、費用高，并不適用所有患者，所以尋找新穎、廉價高效的藥物用于臨床治療小兒血管瘤顯得極為迫切。小白菊內(nèi)酯(Parthenolide,PTL)是一種從菊科植物中提取出來倍半萜類化合物，具有獨特的抗炎及抗腫瘤的生物活性[5-6]。研究表明，血管瘤增殖的病理學基礎(chǔ)是血管內(nèi)皮細胞無限增殖[7]，因此，抑制血管內(nèi)皮細胞增殖或誘發(fā)血管內(nèi)皮細胞凋亡是血管瘤自然降解的關(guān)鍵[8]。本研究觀察PTL對小兒血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡相關(guān)蛋白的影響，為小兒血管瘤的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 小兒血管瘤內(nèi)皮細胞購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基、血清、青霉素/鏈霉素均購自Gibco公司，DMEM完全培養(yǎng)基包括10% 磷酸鹽緩沖液(PBS),1%青霉素/鏈霉素。Bax(批號2772s)、Bcl-2(批號3948s)、Cleaved-Caspase 3(批號9664)、Caspase 3(批號9662)單克隆抗體、Tunel細胞凋亡原位檢測試劑盒(批號11684817910)、抗體購自美國Cell Signal Technology公司，Cell Titer 96 AQueous 單溶液細胞增殖檢測試劑盒 (MTS)[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium](貨號G3582)購自美國Promega公司。PBS(貨號10010-023)購自美國Gibco公司，轉(zhuǎn)膜儀購自美國伯樂公司。實時熒光定量 PCR儀(qTOWER 2.0)購自德國耶拿公司。顯微鏡(Axiovert 200 MAT AXIOVERT 200 MAT)購自德國蔡司公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTS法檢測PTL對小兒血管瘤內(nèi)皮細胞活性的影響：小兒血管瘤內(nèi)皮細胞匯合度達到80% 左右時，消化并重懸細胞，將細胞以1×104/ml密度接種到96孔板中，每孔加入200 μl培養(yǎng)液，次日，加入含有PTL(0、5、10、20、40 μmol/ml)的培養(yǎng)基各180 μl，孵箱中培養(yǎng)24 h 后，每孔中加入20 μl MTS，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，自動酶標儀測量各孔的吸光度值。

1.2.2 流式細胞儀FITC-AnnexinV+PI雙重染色法檢測細胞凋亡：將細胞以1×105/ml密度接種到6孔板中，每孔加入2 ml培養(yǎng)液，次日，加入含有PTL(0、5、10、20、40 mg/ml)的培養(yǎng)基各2 ml，孵箱中培養(yǎng)24 h后，消化并收集細胞，預(yù)冷1×PBS洗滌細胞兩次，棄去上清液，加入490 μl預(yù)冷的試劑緩沖液以重懸細胞。按照試劑盒說明進行孵育。將試管放在冰上,在黑暗中孵育10 min。然后使用流式細胞儀測量細胞凋亡，重復實驗3次。

1.2.3 Tunel法檢測細胞凋亡：賴氨酸提前處理過的玻片放入6孔板，吹干，將內(nèi)皮細胞懸液(1×104/ml)加入玻片，移至培養(yǎng)器，37 ℃靜置3 h，待細胞貼壁后，加入含有或不含PTL的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，計入1 ml 4%多聚甲醛，固定20 min，之后PBS清洗3次，進行Tunel法檢測細胞凋亡，細胞核呈棕色，顯微鏡下拍照。

1.2.4 蛋白印跡法(Western blot)： 將小兒血管瘤內(nèi)皮細胞(1×105/ml)接種在6孔板，次日，加入含有或不含PTL的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，隨后收集細胞，提取蛋白并用BCA試劑盒測定蛋白濃度，進行SDS電泳，每孔蛋白上樣量30 μg，用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后，蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用PBST(含0.5%吐溫、20%的磷酸鹽緩沖液)洗滌3次后，用5% 脫脂牛奶封閉1 h，加入兔抗人Bax(1∶1000)、Bcl-2(1∶1000)、Cleaved-Caspase 3(1∶1000)、Caspase 3(1∶1000)和GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)(1∶1000)一抗稀釋液，4 ℃ 在搖床上過夜孵育，次日，加入羊抗兔二抗稀釋液(1∶3000)常溫下，孵育1 h，用ECL成像儀顯色，用Image Lab 5.0分析并統(tǒng)計條帶灰度。

1.2.5 實時熒光定量 PCR (qPCR)：將小兒血管瘤內(nèi)皮細胞(1×105/ml)接種于6孔板中，次日，加入含有或不含PTL的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，棄掉培養(yǎng)基，加入1 ml Trizol裂解液，反復吹打均勻，提取RNA并用Nano Drop 2000測定RNA濃度，將Prime ScriptTMMaster Mix 試劑盒RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。用TB GreenTMPremix Ex TaqTM進行熒光定量分析，反應(yīng)程序采用兩步法。目的基因引物序列見表1。

表1 基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 PTL對小兒血管瘤內(nèi)皮細胞活性的影響 實驗分為：對照組，5、10、20、40 μmol/L PTL組五組(圖1)，5、10 μmol/L PTL對小兒血管瘤內(nèi)皮細胞活性沒有顯著抑制作用，隨著濃度的增加，20、40 μmol/L PTL對小兒血管瘤內(nèi)皮細胞活性的抑制作用明顯增加，與對照組相比，其差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)，故本研究選擇20 μmol/L PTL用于后續(xù)實驗。

注：與對照組相比，*P<0.01圖1 PTL對小兒血管瘤內(nèi)皮細胞活性影響

2.2 PTL對小兒血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡的影響 見表2。PTL 10、20 μmol/L對內(nèi)皮細胞凋亡無顯著影響，隨著給藥濃度的增加，PTL 20、40 μmol/L顯著促進內(nèi)皮細胞凋亡，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。 采用細胞爬片的方法進行Tunel法檢測細胞凋亡(圖2)。PTL顯著促進小兒血管腫瘤內(nèi)皮細胞凋亡，與對照組相比，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表2 五組間細胞凋亡率比較(%)

注：與對照組相比，*P<0.01圖2 PTL對小兒血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡影響(Tunel法,×200)

2.3 PTL對小兒血管瘤內(nèi)皮細胞Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase 3和 Caspase 3 mRNA和蛋白表達的影響 PTL 處理小兒血管瘤內(nèi)皮細胞24 h 后，檢測Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase 3和Caspase 3 mRNA和蛋白表達的變化(圖3、4) 。PTL 可促進小兒血管瘤內(nèi)皮細胞促凋亡蛋白Bax mRNA和蛋白水平表達(均P<0.01)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白水平的表達(均P<0.01)， PTL顯著促進Caspase 3 mRNA和Cleaved-Caspase 3蛋白表達上調(diào)(均P<0.01)，且促進Cleaved/Total Caspase 3比例上調(diào)(P<0.01)，最終致使小兒血管瘤內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡，與對照組相比，其差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。

注：與對照組相比，*P<0.01圖3 20 μmol/L PTL 對小兒血管瘤內(nèi)皮細胞Bcl-2、Bax、Caspase 3 mRNA表達影響

注：與對照組相比，*P<0.01圖4 20 μmol/L PTL 對小兒血管瘤內(nèi)皮細胞Bcl-2、Bax 和Cleaved-Caspase 3蛋白表達影響

3 討 論

菊科植物小白菊的胚芽中獲得的純凈提取物——小白菊內(nèi)酯，具有一定的抗癌活性[9]，文獻報道，小白菊內(nèi)酯可以顯著抑制人非小細胞性肺癌H1975 細胞凋亡、侵襲與遷移[10]。但小白菊內(nèi)酯對小兒血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡的影響卻少有報道，本研究通過MTS和細胞流式實驗篩選出促進小兒血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡的PTL濃度為20、40 μmol/L，后續(xù)實驗用20 μmol/L PTL干預(yù)小兒血管瘤內(nèi)皮細胞，通過Western blot和實時熒光定量 PCR 檢測PTL對小兒血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響，Tunel法染色法則可以對單個凋亡細胞進行原位染色，是檢測細胞凋亡的特異性和敏感性很高的方法[11],本研究通過Tunel法染色進一步確定PTL對小兒血管瘤內(nèi)皮細胞的抗凋亡作用。

細胞凋亡是多蛋白相互作用、多基因參與的調(diào)控過程，目前研究發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控腫瘤細胞凋亡基因主要有Caspase家族、p53、Bcl-2家族等[12]。腫瘤生長的病理學基礎(chǔ)是腫瘤細胞無限制生長，腫瘤細胞無法經(jīng)歷凋亡即程序性死亡，誘導腫瘤細胞凋亡是目前腫瘤研究的關(guān)鍵[13]。Bcl-2和Bax同屬于 Bcl-2家族蛋白，具有調(diào)控細胞凋亡的功能，Bcl-2具有抗凋亡的功能，Bax具有促凋亡的功能[14-15]，Bax/Bcl-2比值的變化決定細胞凋亡的走向。文獻報道，在膠質(zhì)瘤的治療中，Bax/Bcl-2的比值可能成為診斷腦膠質(zhì)瘤的標準[16]。本研究中，PTL顯著抑制Bcl-2 mRNA和蛋白的表達，顯著促進Bax mRNA和蛋白水平的表達，致使小兒血管瘤內(nèi)皮細胞Bax/Bcl-2比值明顯升高，從而誘發(fā)內(nèi)皮細胞凋亡。

細胞發(fā)生凋亡需要特定的酶發(fā)揮作用，其中Caspase家族起著關(guān)鍵作用，有文獻報道，在TNF-α誘導的細胞凋亡中，會引發(fā)一系列的Caspase級聯(lián)激活，Caspase 8的活化作為反應(yīng)的第一步[17]，進而激活Caspass 9和Caspass 3,而Caspase 3的激活更是被認為是細胞發(fā)生凋亡的早期標志以及細胞凋亡執(zhí)行因子[18]。文獻也報道，Caspase 3上升時，可使惡性腫瘤細胞的異常過度增殖被完全或部分阻斷，從而使癌腫瘤病灶停止或延緩生長，因此具有控制甚至是縮小癌腫體積的作用[19]。劉繼洪等[20]報道，小白菊內(nèi)酯能激活Caspase 3表達，誘導結(jié)腸癌細胞凋亡，提示Caspase 3是小白菊內(nèi)酯潛在的藥物作用靶點，為將來抗腫瘤應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。本研究中，細胞流式凋亡結(jié)果表明，PTL顯著促進小兒血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡，Tunel實驗結(jié)果進一步證實PTL誘導小兒血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡這一結(jié)論。

本研究證實PTL可以在體外顯著促進小兒血管瘤內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡。該凋亡可能由于PTL下調(diào)內(nèi)皮細胞Bcl-2 表達，上調(diào)Bax和Caspase 3表達導致，因此，本研究為PTL用于臨床治療小兒血管瘤提供理論依據(jù)。