miRNA-183在噪聲性耳聾大鼠耳蝸組織中的表達(dá)及臨床意義

唐一萍，馮 俊，馬 鵬，羅德艷

(南充市中心醫(yī)院 川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院耳鼻咽喉頭頸外科，四川 南充637000)

近年，隨著我國(guó)城市化以及工業(yè)科技的不斷發(fā)展，噪聲污染日益嚴(yán)重。噪聲性耳聾成為了軍事、建筑業(yè)、工業(yè)、娛樂(lè)業(yè)、交通行業(yè)等最常見(jiàn)的聽(tīng)力致殘因素。以往有研究報(bào)道[1]，噪聲性耳聾與耳蝸組織發(fā)生機(jī)械性損傷以及代謝障礙密切相關(guān)。人體長(zhǎng)時(shí)間處于噪聲環(huán)境中過(guò)度的刺激會(huì)導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞壞死或凋亡。而隨著對(duì)噪聲性耳聾發(fā)生機(jī)制的不斷深入研究，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)噪聲性耳聾的發(fā)生受環(huán)境、基因雙重因素所影響[2-3]。miRNA在生物體發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用已有多項(xiàng)基礎(chǔ)研究所證實(shí)，其中，miRNA-183家族在內(nèi)耳中含有豐富的表達(dá)，且在內(nèi)耳發(fā)育過(guò)程中有著重要的調(diào)控作用[4]。相關(guān)研究[5]表明，miRNA-183家族與聽(tīng)力受損具有一定的相關(guān)性。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究miRNA-183在噪聲性耳聾大鼠耳蝸組織中的表達(dá)情況，并嘗試分析其對(duì)噪聲性耳聾發(fā)生發(fā)展的影響，旨在為噪聲性耳聾的診療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型 50只健康SD大鼠，均由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，25只雄鼠，25只雌鼠，體重100～200 g,8周齡，自由喂養(yǎng)，不限制飲食，而且大鼠的耳廓反射均靈敏，無(wú)噪聲接觸史、耳毒藥物服用史或中耳炎等。將50只SD大鼠分為兩組，其中，將10只SD大鼠不予任何處理設(shè)為空白對(duì)照組，另40只大鼠均進(jìn)行噪聲暴露以建立噪聲性耳聾動(dòng)物模型，將其分為噪聲暴露1 d組(n=10)、噪聲暴露7 d組(n=10)、噪聲暴露14 d組(n=10)、噪聲暴露28 d組(n=10)。本研究實(shí)驗(yàn)內(nèi)容、實(shí)驗(yàn)方法等均遵循了《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用指南》(科學(xué)出版社出版)，均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意。

1.2 噪聲性耳聾動(dòng)物模型建立 在隔音房?jī)?nèi)利用白噪聲播放軟件播放白噪聲，將音量調(diào)至最大，噪聲強(qiáng)度設(shè)置為120 dB SPL，將實(shí)驗(yàn)大鼠頭部放到聲源正前方2 cm處，每日持續(xù)噪聲暴露4 h，連續(xù)4 d，建立噪聲性耳聾動(dòng)物模型。

1.3 耳蝸基底膜鏡檢 對(duì)照組及各組噪聲暴露后立即進(jìn)行大鼠斷頭處死，即刻去除雙側(cè)聽(tīng)泡，放在PBS溶液中浸泡，借助手術(shù)放大鏡將蝸殼去除，并將基底膜連帶蝸軸取出，置于-80 ℃低溫冷凍環(huán)境中儲(chǔ)存。取適量耳蝸基底膜鋪片，并予以0.5%硝酸銀溶液進(jìn)行染色，在生物顯微鏡(10×40)視野下察看耳蝸毛細(xì)胞受損情況，與正常耳蝸毛細(xì)胞相比，受損的毛細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不規(guī)則排序，或在正常毛細(xì)胞排列中有空缺等。計(jì)算出各組耳蝸基底膜中外毛、內(nèi)毛細(xì)胞的缺失率，并以此作為毛細(xì)胞損傷判斷指標(biāo)。內(nèi)外毛細(xì)胞缺失率計(jì)算方法：在顯微鏡下應(yīng)用目鏡中長(zhǎng)度0.24 mm標(biāo)尺對(duì)耳蝸基底膜頂回至底回毛細(xì)胞存活/缺失數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，并與頂回頂點(diǎn)的距離形成線性函數(shù)關(guān)系，借助Sigma Plot軟件回執(zhí)耳蝸毛細(xì)胞圖，且應(yīng)用耳蝸毛細(xì)胞定量分析軟件計(jì)數(shù)毛細(xì)胞缺失率。

1.4 miRNA-183測(cè)定

1.4.1 試劑與儀器：Trizon總RNA提取試劑(上海聯(lián)邁生物)，F(xiàn)ast Super RT Kit cDNA第一鏈合成試劑盒(上海一基生物)，Ultra SYBR Mixture試劑盒(上海研謹(jǐn)生物)，Bio-Rad CFX384實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)伯樂(lè))，T10手持式勻漿機(jī)(德國(guó)IKA)，超低溫冰箱(松下)，AL104電子天平(瑞士梅特勒)，TG-16S微量高速離心機(jī)(上海錦玟)，Olympus CX22雙目顯微鏡。

1.4.2 操作方法：①總RNA提取：取各組耳蝸組織樣本應(yīng)用手持式勻漿機(jī)將其碾碎，研磨成粉末狀置于EP管中，按照35 mg樣本加入1 ml Trizon液的比例加入適量Trizon液混勻，并反復(fù)進(jìn)行吹打以使樣本充分裂解。將樣本在室溫中靜置5 min，待蛋白核酸復(fù)合物完全分離后再在EP管中添加0.2 ml的氯仿溶液，劇烈震蕩，室溫放置5 min后進(jìn)行離心處理(1200 r/min，4 min)。另取新EP管，往內(nèi)加入分離后的上清液300 ml、異丙醇溶液500 μl混勻，在4 ℃環(huán)境中放置20 min。再次以相同條件進(jìn)行離心處理80 min，將沉淀物取出，用75%酒精洗滌，離心處理4 min，棄上清液。待沉淀物晾干后添加二乙基焦碳酸酯處理水20 μl混勻震蕩以溶解RNA。②cDNA合成：應(yīng)用RT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)，取5 μl RNA為逆轉(zhuǎn)錄模板，miRNA-183的相對(duì)表達(dá)量以U6 RNA為內(nèi)參基因，嚴(yán)格按照Fast Super RT Kit cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行操作，加入引物(正向序列：5’-GCTTCGGCACATATACTAAAAT-3’；反向序列：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’)充分震蕩混勻，并予以短暫離心處理以使溶液集中于EP管底。然后將其置于42 ℃環(huán)境中孵育30 min，置于85 ℃中孵育3 min。最后對(duì)其進(jìn)行短暫離心處理，并放在冰上冷卻獲得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。③實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)：嚴(yán)格按照Ultra SYBR Mixture試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)，設(shè)置反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃,10 min，變性95 ℃,15 s，退火/延伸60 ℃,1 min，40個(gè)循環(huán)，并應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR儀測(cè)定循環(huán)閾值(Ct)，每組樣品作3個(gè)復(fù)孔，取平均值。以2-△△Ct法表示各組miRNA-183的相對(duì)表達(dá)量，其中，△Ct=目的基因Ct均值-內(nèi)參基因Ct均值，△△Ct=待測(cè)樣本△Ct值-校正器△Ct值。

1.5 觀察項(xiàng)目 ①比較各組大鼠耳蝸基底膜的外毛細(xì)胞、內(nèi)毛細(xì)胞缺失率;②比較各組大鼠耳蝸組織的miRNA-183相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)錄入到Microsoft Excel 2013軟件中，并進(jìn)行邏輯性整理，刪除不合邏輯的數(shù)據(jù)，然后再采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，計(jì)量資料采用不假定方差齊性Brown-ForsytheF統(tǒng)計(jì)量作為校正值進(jìn)行方差分析，同時(shí)應(yīng)用不要求方差齊性的Tamhane事后檢驗(yàn)，且兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠耳蝸基底膜外內(nèi)毛細(xì)胞形態(tài) 鏡檢下見(jiàn)空白對(duì)照組大鼠的耳蝸基底膜有1排內(nèi)毛細(xì)胞、3排外毛細(xì)胞，排列整齊，無(wú)毛細(xì)胞缺失(圖1)，經(jīng)單因素方差分析以及Brown-Forsythe檢驗(yàn)結(jié)果顯示，不同噪聲暴露時(shí)間內(nèi)膜細(xì)胞缺失率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1.571，P=0.215)。而B(niǎo)rown-Forsythe檢驗(yàn)結(jié)果顯示，不同噪聲暴露時(shí)間之間的外毛細(xì)胞總?cè)笔视薪y(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=69.401，P=0.000)。Tamhane事后檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，噪聲暴露28 d組、噪聲暴露14 d組、噪聲暴露7 d組的外毛細(xì)胞缺失率均顯著高于噪聲暴露1 d組(均P<0.01)，且噪聲暴露28 d組的外毛細(xì)胞缺失率明顯高于噪聲暴露14 d組、噪聲暴露7 d組(均P<0.01)。見(jiàn)表1。

圖1 空白對(duì)照組大鼠耳蝸基底膜鋪片鏡檢結(jié)果(OHC外毛細(xì)胞，IHC內(nèi)毛細(xì)胞)

表1 不同噪聲暴露組大鼠耳蝸基底膜外內(nèi)毛細(xì)胞缺失率比較(%)

2.2 各組大鼠耳蝸組織miRNA-183相對(duì)表達(dá)量比較 經(jīng)單因素方差分析以及Brown-Forsythe檢驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、不同噪聲暴露時(shí)間之間的miRNA-183相對(duì)表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=99.728，P=0.000)。Tamhane事后檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，噪聲暴露28 d組、噪聲暴露14 d組、噪聲暴露7 d組、噪聲暴露1 d組的miRNA-183相對(duì)表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組(均P<0.01)。噪聲暴露1 d組、噪聲暴露7 d組的大鼠耳蝸組織miRNA-183相對(duì)表達(dá)量明顯低于噪聲暴露14 d組、噪聲暴露28 d組(均P<0.01)，且噪聲暴露14 d組的miRNA-183相對(duì)表達(dá)量顯著低于噪聲暴露28 d組(t=4.988，P=0.000)。而噪聲暴露1 d組、噪聲暴露7 d組之間miRNA-183相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.980，P=0.063)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠耳蝸組織miRNA-183相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

近年，隨著臨床對(duì)內(nèi)耳損傷機(jī)制研究的不斷深入，已有大量研究證實(shí)[6]，耳蝸基底膜毛細(xì)胞在內(nèi)耳的正常發(fā)育、損傷修復(fù)中發(fā)揮重要的基礎(chǔ)，同時(shí)也是多種內(nèi)耳疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[7]，經(jīng)高強(qiáng)度噪聲暴露后大鼠的耳蝸受損區(qū)內(nèi)存有壞死毛細(xì)胞。Blioskas等[8]的研究將健康成年豚鼠置于聲壓級(jí)55 dB SPL、頻譜2000 Hz噪聲環(huán)境中國(guó)暴露28 d，發(fā)現(xiàn)其耳蝸內(nèi)有大量的毛細(xì)胞壞死、凋亡。相關(guān)文獻(xiàn)[9-10]也報(bào)道，永久性聽(tīng)力閾移的病理生理基礎(chǔ)是耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞出現(xiàn)不可逆性病理?yè)p害，致使毛細(xì)胞缺失，而且在此過(guò)程中最易受到損害的是外毛細(xì)胞，其次是支持細(xì)胞，最后為內(nèi)毛細(xì)胞。本研究經(jīng)硝酸銀溶液染色鏡檢后發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組大鼠的耳蝸基底膜內(nèi)毛、外毛細(xì)胞排列整齊，無(wú)細(xì)胞缺失，而噪聲暴露1 d組、噪聲暴露7 d組、噪聲暴露14 d組、噪聲暴露28 d組的耳底基膜外毛細(xì)胞缺失率隨噪聲暴露時(shí)間延長(zhǎng)而顯著升高，與上述研究報(bào)道相符，進(jìn)一步證實(shí)了在噪聲性耳聾發(fā)生中會(huì)出現(xiàn)毛細(xì)胞病理?yè)p傷，且最早出現(xiàn)變化的是外毛細(xì)胞。但本研究發(fā)現(xiàn)，在噪聲暴露的28 d以?xún)?nèi)內(nèi)毛細(xì)胞無(wú)病理性損害，與Peyvandi等[11]的研究結(jié)果不相符，筆者推敲可能是本研究在噪聲性耳聾模型建立中的噪音強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間不足所導(dǎo)致的。

此外，miRNA在內(nèi)耳中的表達(dá)情況及具體功能研究成為了熱門(mén)的話題。miRNA是由21～25個(gè)小分子核苷酸所組成的非編碼RNA，可廣泛分布在哺乳動(dòng)物基因組[12]。其中，有研究[13-14]報(bào)道，miRNA-183在多項(xiàng)疾病的病變組織中均會(huì)出現(xiàn)異常表達(dá)，能夠參與細(xì)胞凋亡、分化、增殖等許多重要生物學(xué)過(guò)程。Weston等[15]對(duì)小鼠胚胎期到成年期的耳蝸發(fā)育情況進(jìn)行分析研究，發(fā)現(xiàn)miRNA-183家族成員在耳蝸發(fā)育過(guò)程中呈動(dòng)態(tài)性表達(dá)，且在耳蝸結(jié)構(gòu)成形、分化中達(dá)到峰值。Yang等[16]的研究證實(shí)，miRNA-183能夠在一定程度調(diào)控內(nèi)耳毛細(xì)胞的分化、發(fā)育及成熟過(guò)程。本研究對(duì)不同噪聲暴露時(shí)間大鼠的miRNA-183表達(dá)水平進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，噪聲暴露1、7、14、28 d大鼠的耳蝸miRNA-183表達(dá)量較空白對(duì)照組逐漸降低。王園園等[17]的研究證實(shí)，在噪聲暴露期間耳蝸毛細(xì)胞會(huì)發(fā)生變性、壞死及缺失，促使聽(tīng)力受損。故筆者結(jié)合本研究結(jié)果推測(cè)噪聲刺激對(duì)聽(tīng)力的損傷可能與miRNA-183表達(dá)水平下降有關(guān)。與此同時(shí)，本研究經(jīng)事后檢驗(yàn)顯示，噪聲暴露14、28 d的miRNA-183表達(dá)水平較噪聲暴露1、7 d明顯升高。相關(guān)文獻(xiàn)[18-19]指出，噪聲暴露過(guò)程中除了耳蝸毛細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)缺損改變外，其耳蝸組織內(nèi)殘存的毛細(xì)胞會(huì)發(fā)生代償性修復(fù)，促使祖細(xì)胞向毛細(xì)胞分化，使殘存的毛細(xì)胞具有一定的再生、恢復(fù)能力。此說(shuō)法也可以解釋本研究miRNA-183表達(dá)水平在噪聲暴露14、28 d逐漸升高的原因，但需注意鏡檢結(jié)果顯示噪聲暴露14、28 d外毛細(xì)胞缺失率仍較噪聲暴露1、7 d增加，表明了大鼠耳蝸組織受損后殘存毛細(xì)胞的再生修復(fù)能力是有限的[20]。

綜上所述，miRNA-183在噪聲性耳聾大鼠耳蝸組織中呈低表達(dá)，推測(cè)miRNA-183表達(dá)量下調(diào)可能會(huì)促進(jìn)噪聲性耳聾發(fā)生發(fā)展，而且對(duì)耳蝸毛細(xì)胞損傷修復(fù)能力評(píng)估具有一定的臨床意義。