炎癥微環(huán)境下miR-30a調(diào)控Runx相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2對人牙周膜干細(xì)胞成骨分化的影響

林 麗，張 卓，哈斯達(dá)來，王 博，劉翠娟，馬稔秋，付澤宇

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科，遼寧 錦州 121001;2.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，內(nèi)蒙古 赤峰 024005)

牙周炎是一種發(fā)生于牙周支持組織的慢性炎癥，因牙齦卟林單胞菌、伴放線菌、變形鏈球菌等微生物感染引起，可破壞牙槽骨吸收及骨形成之間的動態(tài)平衡，使其骨吸收大于骨形成，導(dǎo)致牙槽骨的高度降低，阻止炎癥進(jìn)展，促進(jìn)牙周組織的修復(fù)再生在牙周炎的治療中至關(guān)重要[1-2]。人牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)來源于人牙周膜內(nèi)間質(zhì)的未分化細(xì)胞，可分化形成牙骨質(zhì)或牙周膜樣結(jié)構(gòu)，具有再生修復(fù)牙周組織的作用[3-4]，而炎癥可影響hPDLSCs的成骨分化能力，減弱其對牙槽骨及牙周組織的修復(fù)功能[5-6]。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)與成骨分化密切相關(guān)，能誘導(dǎo)不成熟骨細(xì)胞分化成熟，還可促進(jìn)hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化[7-8]，由此推測，Runx2是調(diào)控炎癥微環(huán)境下hPDLSCs成骨分化的一個作用靶點(diǎn)。微小RNA-30a(miR-30a)在牙周炎牙齦和牙槽骨組織中高表達(dá)，并抑制炎性環(huán)境下骨代謝及成骨細(xì)胞活性，另外miR-30a可與Runx2的3’-非翻譯區(qū)結(jié)合抑制Runx2的表達(dá)，但miR-30a是否可通過調(diào)控Runx2影響炎癥微環(huán)境下hPDLSCs的成骨分化，目前還不清楚，本文通過構(gòu)建體外hPDLSCs炎癥模型，對此進(jìn)行探索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、試劑及儀器 hPDLSCs(上海圻明生物科技有限公司，批號Sci-L-0684)；miR-30a mimics、miR-30a mimics陰性對照、miR-30a inhibitor、miR-30a inhibitor陰性對照(上海吉瑪基因有限公司，批號JM1037、JM1158、JM2019、JM2027)；DMEM培養(yǎng)基(武漢益普生物科技有限公司，批號PM150210)；胎牛血清、PBS緩沖液、胰蛋白酶-EDTA消化液、青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司，批號11011-8611、P1022、T1300、P1400)；Opti-MEM培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000(美國invitrogen公司，批號51985091、11668019)；人白細(xì)胞介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(上海古朵生物科技有限公司，批號GD-DS1726)；人腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(上海廣銳生物科技有限公司，批號DS-535)；堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司，批號40749ES60)；茜素紅染色液(上海聯(lián)碩生物科技有限公司，批號N/A-899)；RNA提取試劑盒(RNAiso Plus)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司，批號9108、RR037Q/A/B、639519)；兔源Runx2、骨橋蛋白(OPN)、骨鈣素(OCN)及GAPDH一抗、羊抗人二抗(美國Abcam公司，批號ab23981、ab63856、ab93876、ab181602、ab6721)；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司；批號C006325-0150、P0011)。光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司，型號CKX41-F32F)；酶標(biāo)儀(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，型號BK-EL10C)；熒光定量PCR儀、蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司，型號CFX96 Touch Deep Well、1659001、Trans-Blot Turbo)；低溫高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司，型號Centrifuge 5424R)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Thermo Fisher Scientific公司，型號IBright CL 1500)。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及培養(yǎng)基配制：完全培養(yǎng)基：向500 ml DMEM培養(yǎng)基中加入胎牛血清和青鏈霉素混合液，使其終濃度分別為10%、100 U/ml，上下顛倒混勻。成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基：向500 ml完全培養(yǎng)基中加入地塞米松、維生素C及β-磷酸甘油鈉，使其終濃度分別為10、50 μmol/L、10 mmol/L，上下顛倒混勻。購買的凍存hPDLSCs細(xì)胞株置于37 ℃水浴中，快速凍融后離心5 min(室溫，1000 r/min)，以完全培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞沉淀后重懸，接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底時，以胰酶消化，并以1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及標(biāo)本收集：取1.2.1中指數(shù)生長期的細(xì)胞，以胰酶消化后重懸并計數(shù)，接種在4個24孔板中，培養(yǎng)24 h，各板細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、模型組、miR-30a mimics組、miR-30a mimics陰性對照組、miR-30a inhibitor組、miR-30a inhibitor陰性對照組，除對照組外，其余各組以10 μg/ml的脂多糖處理細(xì)胞，構(gòu)建體外炎癥微環(huán)境，24 h后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，步驟如下：將完全培養(yǎng)基更換成Opti-MEM減血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，將1 μl LipofectamineTM2000溶于50 μl Opti-MEM減血清培養(yǎng)基中，小心混勻，同時分別將miR-30a mimics、miR-30a mimics陰性對照、miR-30a inhibitor、miR-30a inhibitor陰性對照(濃度參照說明書)溶解于50 μl Opti-MEM減血清培養(yǎng)基中混勻，均靜置20 min后分別與LipofectamineTM2000溶液混勻后，分組處理細(xì)胞，6 h后，以成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基更換Opti-MEM減血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2周后，選取兩個24孔板分別用于后續(xù)ALP染色及茜素紅染色實(shí)驗(yàn)，剩余2個24孔板中的各組細(xì)胞收集后分別用于實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)及蛋白檢測。

1.2.3 ALP染色及茜素紅染色實(shí)驗(yàn)：取1.2.2中兩個24孔板，吸去培養(yǎng)基，以PBS漂洗后，加入4%多聚甲醛固定2 h，采用ALP染色試劑盒及茜素紅染色液分別對各組細(xì)胞進(jìn)行染色(具體步驟參照說明書)，在光學(xué)顯微鏡下觀察，呈現(xiàn)紫色的為ALP陽性細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色的為礦化結(jié)節(jié)，每組任選5個視野拍照，計數(shù)ALP陽性細(xì)胞數(shù)及礦化結(jié)節(jié)數(shù)，并計算其各組相對比例，對照組設(shè)為100%，相對比例=實(shí)驗(yàn)組ALP陽性細(xì)胞數(shù)(礦化結(jié)節(jié)數(shù))/對照組ALP陽性細(xì)胞數(shù)(礦化結(jié)節(jié)數(shù))×100%。

1.2.4 細(xì)胞上清液中TNF-α及IL-6水平檢測：取1.2.1中指數(shù)生長期的細(xì)胞，以胰酶消化后重懸并計數(shù)，接種在24孔板中，培養(yǎng)24 h，參照1.2.2中的方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞上清液，以ELISA試劑盒測定其中TNF-α、IL-6水平，具體步驟參照說明書進(jìn)行。

1.2.5 qRT-PCR分析各組細(xì)胞miR-30a、Runx2 mRNA的表達(dá)：取出1.2.2中收集的各組細(xì)胞，加入RNAiso Plus提取各自總RNA并以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，具體步驟、反應(yīng)體系配制、反應(yīng)條件設(shè)定均參照各自說明書進(jìn)行，以GAPDH為Runx2的內(nèi)參基因，U6為miR-30a的內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt算法統(tǒng)計分析所得數(shù)據(jù)，進(jìn)而得出各組mRNA相對表達(dá)量，qRT-PCR引物序列見表1。miR-30a、Runx2、U6、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.6 免疫印跡分析各組細(xì)胞Runx2、OPN、OCN蛋白的表達(dá)：取出1.2.2中收集的各組細(xì)胞，以蛋白提取試劑盒提取總蛋白后使用BCA試劑盒測定其總濃度，調(diào)整各組蛋白濃度至相同，煮沸變性，各取10 μl樣品液上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將分離蛋白全部轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，根據(jù)目的蛋白分子量截取條帶置于小盒中，加入5%的脫脂奶粉，室溫進(jìn)行封閉2 h，然后分別經(jīng)兔源Runx2、OPN、OCN及GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，羊抗人二抗室溫孵育2 h后，采用ECL顯色，以凝膠成像系統(tǒng)拍攝蛋白條帶，并以Image Lab軟件分析各組蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 ALP染色檢測miR-30a對各組細(xì)胞成骨分化的影響 與對照組相比，模型組ALP陽性細(xì)胞相對比例降低(P<0.05)；與模型組相比，miR-30a mimics組ALP陽性細(xì)胞相對比例均降低(均P<0.05)，miR-30a inhibitor組ALP陽性細(xì)胞相對比例升高(P<0.05)，miR-30a mimics陰性對照組、miR-30a inhibitor陰性對照組ALP陽性細(xì)胞相對比例無明顯變化(均P>0.05)，見表2(圖1)。

表2 各組細(xì)胞ALP陽性細(xì)胞相對比例(%)

2.2 茜素紅染色檢測miR-30a對各組細(xì)胞成骨分化的影響 與對照組相比，模型組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)相對比例降低(P<0.05)；與模型組相比，miR-30a mimics組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)相對比例均降低(均P<0.05)，miR-30a inhibitor組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)相對比例升高(P<0.05)，miR-30a mimics陰性對照組、miR-30a inhibitor陰性對照組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)相對比例無明顯變化(均P>0.05)，見表3(圖2)。

A：對照組；B：模型組；C：miR-30a mimics組；D：miR-30a mimics陰性對照組；E：miR-30a inhibitor組；F：miR-30a inhibitor陰性對照組圖1 各組細(xì)胞成骨分化(ALP染色，×200)

A：對照組；B：模型組；C：miR-30a mimics組；D：miR-30a mimics陰性對照組；E：miR-30a inhibitor組；F：miR-30a inhibitor陰性對照組圖2 各組細(xì)胞成骨分化(茜素紅染色，×200)

表3 各組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)相對比例(%)

2.3 miR-30a對各組細(xì)胞上清液中炎癥因子水平的影響 與對照組相比，模型組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平均升高(均P<0.05)；與模型組相比，miR-30a mimics組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平均升高(均P<0.05)，miR-30a inhibitor組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平均降低(均P<0.05)，miR-30a mimics陰性對照組、miR-30a inhibitor陰性對照組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平均無明顯變化(均P>0.05)，見表4。

表4 各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6水平比較(ng/ml)

2.4 各組細(xì)胞miR-30a、Runx2 mRNA表達(dá)水平比較 與對照組相比，模型組細(xì)胞miR-30a表達(dá)水平均升高(均P<0.05)，Runx2 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。與模型組相比，miR-30a mimics組細(xì)胞miR-30a表達(dá)水平升高(P<0.05)，Runx2 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)；miR-30a inhibitor組細(xì)胞miR-30a表達(dá)水平降低(P<0.05)，Runx2 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)；miR-30a mimics陰性對照組、miR-30a inhibitor陰性對照組細(xì)胞miR-30a、Runx2 mRNA表達(dá)水平均無明顯變化(均P>0.05)，見表5。

表5 各組細(xì)胞miR-30a、Runx2 mRNA表達(dá)水平比較

2.5 miR-30a對各組細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白Runx2、OPN、OCN表達(dá)的影響 與對照組相比，模型組細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白Runx2、OPN、OCN表達(dá)水平均降低(均P<0.05)；與模型組相比，miR-30a mimics組細(xì)胞Runx2、OPN、OCN蛋白表達(dá)水平均降低(均P<0.05)，miR-30a inhibitor組細(xì)胞Runx2、OPN、OCN蛋白表達(dá)水平均升高(均P<0.05)，miR-30a mimics陰性對照組、miR-30a inhibitor陰性對照組細(xì)胞成骨相關(guān)蛋白表達(dá)水平均無明顯變化(均P>0.05)，見表6(圖3)。

表6 各組細(xì)胞Runx2、OPN、OCN蛋白表達(dá)水平比較

A：對照組；B：模型組；C：miR-30a mimics組；D：miR-30a mimics陰性對照組；E：miR-30a inhibitor組；F：miR-30a inhibitor陰性對照組圖3 各組細(xì)胞Runx2、OPN、OCN蛋白表達(dá)

3 討 論

牙周炎不僅可導(dǎo)致劇烈疼痛、牙齒損壞，還可能誘發(fā)心血管疾病，對居民身心健康，特別是口腔健康存在重大威脅[9-12]。組織再生工程技術(shù)是修復(fù)牙周組織，改善牙周炎臨床癥狀的重要治療手段，hPDLSCs具有自我更新和分化為牙周膜、牙骨質(zhì)等多種牙周組織細(xì)胞的能力，是組織工程技術(shù)中很好的種子細(xì)胞[13-14]，但hPDLSCs慢性炎癥微環(huán)境下再生及分化能力明顯降低[15]。本文以脂多糖誘導(dǎo)炎癥，構(gòu)建hPDLSCs體外炎癥微環(huán)境模型，結(jié)果顯示，hPDLSCs經(jīng)脂多糖處理后，細(xì)胞上清液中促炎因子TNF-α及IL-6水平升高，ALP陽性細(xì)胞相對比例、礦化結(jié)節(jié)相對比例、細(xì)胞成骨分化相關(guān)蛋白OPN及OCN表達(dá)水平降低，表明脂多糖可引發(fā)hPDLSCs產(chǎn)生炎癥，抑制其向成骨細(xì)胞分化，模型建立成功。

miR-30a是一種非編碼RNA分子，可調(diào)控多種信號通路傳導(dǎo)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，細(xì)胞增殖、凋亡及分化等生理過程。miR-30a可下調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體γ的共同激活劑Ppargc1b的表達(dá)，促使炎癥進(jìn)展，加劇自身免疫性腦脊髓炎癥狀[16]，并可抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(BMP9)誘導(dǎo)的C3H10T1/2和C2C12細(xì)胞的成骨分化[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組細(xì)胞miR-30a表達(dá)水平升高，推測炎癥微環(huán)境下miR-30a高表達(dá)，可能調(diào)控炎癥微環(huán)境下hPDLSCs的成骨分化。本研究通過使用miR-30a mimics及inhibitor調(diào)控炎癥微環(huán)境下hPDLSCs中miR-30a的表達(dá)對此進(jìn)行探索，結(jié)果顯示，miR-30a mimics處理細(xì)胞可升高細(xì)胞上清液中TNF-α及IL-6水平，降低ALP陽性細(xì)胞相對比例、礦化結(jié)節(jié)相對比例、細(xì)胞成骨分化相關(guān)蛋白OPN及OCN表達(dá)水平，miR-30a inhibitor處理細(xì)胞，則作用相反。表明miR-30a參與脂多糖誘導(dǎo)的hPDLSCs炎癥反應(yīng)及其成骨分化，上調(diào)miR-30a表達(dá)，可促進(jìn)炎癥進(jìn)展，抑制炎癥微環(huán)境下hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化，下調(diào)miR-30a表達(dá)，可抑制炎癥進(jìn)展，促進(jìn)炎癥微環(huán)境下hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化。Runx2是一種成骨分化相關(guān)因子，可增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞及hPDLSCs的成骨分化[19]。研究顯示，miR-30a可與Runx2的3’-UTR結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)Runx2的表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞的分化和骨溶解過程[20]，但miR-30a是否可通過調(diào)控Runx2的表達(dá)而介導(dǎo)炎癥微環(huán)境下hPDLSCs的成骨分化，目前還未見闡釋。本文結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組細(xì)胞Runx2 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-30a mimics處理炎癥微環(huán)境下hPDLSCs可降低細(xì)胞Runx2 mRNA和蛋白表達(dá)，miR-30a inhibitor處理細(xì)胞則作用相反，表明miR-30a可抑制Runx2表達(dá)，加重炎癥，抑制炎癥微環(huán)境下hPDLSCs的成骨分化。

綜上所述，炎癥微環(huán)境下hPDLSCs中miR-30a高表達(dá)，可抑制Runx2的表達(dá)，促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的hPDLSCs炎癥進(jìn)展及其成骨分化，下調(diào)miR-30a水平，可促進(jìn)Runx2表達(dá)，抑制炎癥發(fā)展，增強(qiáng)炎癥微環(huán)境下hPDLSCs中成骨相關(guān)因子OPN、OCN、ALP的表達(dá)水平，促使其向成骨細(xì)胞分化，揭示miR-30a是牙周炎的一個潛在治療靶點(diǎn)，為臨床治療牙周疾病提供了新的參考，調(diào)控Runx2的表達(dá)可能是其作用機(jī)制。但本文未通過上調(diào)或下調(diào)Runx2表達(dá)對miR-30a調(diào)控炎癥微環(huán)境下hPDLSCs的成骨分化進(jìn)行對照驗(yàn)證，還存在一定不足，還需進(jìn)行后續(xù)的深入研究，得出更為精確完整的作用機(jī)制。