DEPDC5基因表達(dá)對胃癌MKN-28細(xì)胞凋亡的影響

周 威,洪 舟,符兆英

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，陜西 延安716000;2.西安市第五醫(yī)院急診科，陜西 西安 710082)

人DEP 結(jié)構(gòu)域包含5(Dishevelled,Egl-10,and pleckstrin domain-containing protein 5,DEPDC5)基因位于22號染色體長臂1區(qū)2帶2亞帶至1區(qū)2帶3亞帶，具有GTP酶活性。DEPDC5與NPRL2和NPRL3結(jié)合形成復(fù)合體GATOR1后可以抑制mTORC1活性，進(jìn)而調(diào)控哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)功能的發(fā)揮[1]。 大量研究表明DEPDC5與神經(jīng)發(fā)育、癲癇的發(fā)生、治療及預(yù)后相關(guān)：DEPDC5基因表達(dá)與大腦及神經(jīng)元發(fā)育有關(guān)——shRNA下調(diào)DEPDC5基因表達(dá)可激活mTORC1信號，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖和神經(jīng)元樹突的形成[2]，并且，DPEPDC5基因突變與癲癇的發(fā)生，癲癇患者的腦損傷、腦發(fā)育不良、抗癲癇藥物的不良預(yù)后等相關(guān)[3-5]。mTORC1屬于蛋白絲/蘇氨酸激酶，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中mTORC1通過PI3K/Akt/mTOR和Ras/Raf/MEK/ERK通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長、凋亡、侵襲和遷移的作用已被廣泛報道[6-8]。然而，作為mTORC1的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，DEPDC5相關(guān)的腫瘤研究報道還相對較少，但已有報道顯示DEPDC5與肝炎病毒感染導(dǎo)致的肝細(xì)胞癌相關(guān)[9-11]；胃腸道中，DEPDC5突變失活與胃腸道間質(zhì)瘤的形成相關(guān)[12]；并且DEPDC5的磷酸化可使其對mTORC1的抑制作用降低，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長[13]。DEPDC5及其下游基因mTORC1在腫瘤中的作用提示，DEPDC5可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。研究[14]表明：DEPDC5高表達(dá)與消化道腫瘤發(fā)生相關(guān)，為進(jìn)一步探究DEPDC5在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，本文對DEPDC5基因表達(dá)與胃癌侵襲、遷移及凋亡的關(guān)系進(jìn)行了探究,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人胃癌細(xì)胞株MKN-28為延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗研究中心保存。細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清購自BI公司(以色列)；RPMI-1640、Trizol購自賽默飛 (美國)；轉(zhuǎn)染試劑jetPRIME購自Polyplus (法國)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit購自TaKaRa(日本)；熒光定量PCR試劑盒購自康潤生物(中國)，Transwell 小室購自康寧(美國)，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自貝博生物有限公司(中國)，Caspase 3和β-actin購自博士德公司(中國)。DEPDC5的小干擾RNA(siRNA-DEPDC5)和陰性對照siRNA(siRNA-NC)購自上海吉瑪基因(中國)。熒光定量引物由奧科鼎盛生物科技有限公司(中國)合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理：MKN-28細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中。細(xì)胞培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2。使用jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑，按試劑說明書進(jìn)行siRNA的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染4 h后更換培養(yǎng)基。siRNA-DEPDC5干擾序列為，sense：5’-AAGGACUUCACGGACUUCUGC-3’，anti-sense：5’-GCAGAAGUCCGUGAAGUCCUU-3’,siRNA-NC的序列為，sense：5’-CCATCGCAACCUCGAUCGCAU-3’，anti-sense：5’-AUGCGAUCGAGGUUGCGA-

UGG-3’。

1.2.2 凋亡檢測：細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后，依試劑說明書處理細(xì)胞并對其進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.3 熒光定量PCR(q-PCR)檢測DEPDC5基因相對表達(dá)量變化：首先用Trizol裂解法提取各細(xì)胞樣本中的總RNA。以上述總RNA為模板，用Oligo dT，和隨機(jī)引物按試劑說明書合成cDNA片段。之后，以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參基因，用熒光定量PCR試劑盒RealStar SYBR Green qPCR Power Mixture分別檢測DEPDC5在不同處理組中的表達(dá)變化。定量引物序列為：DEPDC5-F，5’- AGTGTTCCGGCTGAGACCTTA-3’；DEPDC5-R,5’-CCACGGCCAATATACTGATCCT-3’；GAPDH-F,5’- GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT；GAPDH-R：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。DEPDC5基因的相對表達(dá)量以2-ΔΔCt進(jìn)行計算，結(jié)果以3次實驗的計算結(jié)果的平均值表示。

1.2.4 Western blot檢測Caspase 3表達(dá)：細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后，分別收集各處理組細(xì)胞，用含全蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，BCA蛋白定量后進(jìn)行蛋白電泳，濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印，10%脫脂奶粉封閉，4 ℃過夜孵育，TBST洗滌3次，每次10 min，室溫孵育第二抗體2 h,TBST洗滌3次,每次15 min,用G-Box采集圖片，Image J測定各個條帶的光密度值。

1.2.5 劃痕實驗：細(xì)胞轉(zhuǎn)染12 h后，用無菌槍頭以十字性進(jìn)行劃痕，拍照記錄。待細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，明場拍照記錄，觀察不同處理組細(xì)胞的遷移能力變化。

1.2.6 Transwell小室：細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，將其接種于無血清培養(yǎng)基的Transwell小室中(上室)，下室用含20%胎牛血清的RPMI-1640進(jìn)行培養(yǎng)。48 h后，用多聚甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察不同處理組細(xì)胞侵襲能力的變化。

2 結(jié) 果

2.1 RNA干擾DEPDC5基因表達(dá)對胃癌細(xì)胞凋亡的影響 見表1。與對照siRNA轉(zhuǎn)染組(siRNA-NC)相比，siRNA-DEPDC5干擾DEPDC5基因表達(dá)后，胃癌細(xì)胞的凋亡率顯著增加(P<0.01)。siRNA干擾DEPDC5時胃癌細(xì)胞DEPDC5的表達(dá)量降低(圖1A)。對凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3的Western blot檢測(圖1B，左)及灰度值變化分析(圖1B,右)顯示，RNA干擾DEPDC5基因表達(dá)后，Caspase 3基因表達(dá)量增加(P<0.01)。

表1 不同處理組胃癌細(xì)胞凋亡情況(%)

2.2 RNA干擾DEPDC5基因表達(dá)對胃癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響 為進(jìn)一步探究DEPDC5對胃癌生長的影響，采用Transwell和劃痕實驗檢測了siRNA-DEPDC5干擾DEPDC5基因表達(dá)時胃癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的變化，結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染siRNA-NC對照組胃癌細(xì)胞相比，siRNA-DEPDC5干擾DEPDC5基因表達(dá)后MKN-28細(xì)胞的侵襲(圖2A)、遷移能力無顯著變化(圖2B)，提示DEPDC5基因表達(dá)可能與胃癌的進(jìn)展無關(guān)。

3 討 論

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，是一種進(jìn)化上十分保守的蛋白激酶，有兩種蛋白復(fù)合體類型mTORC1和mTORC2，能夠通過生長因子、氨基酸和能量等信號的整合調(diào)控細(xì)胞生長和新陳代謝。其中，mTORC1由mTOR、Raptor、PRAS40、mLST8和Deptor構(gòu)成[15]，其主要信號通路有兩條:Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt/mTOR，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、存活、血管生成和蛋白質(zhì)翻譯。

注：**P<0.01A：qPCR檢測siRNA干擾DEPDC5時胃癌細(xì)胞DEPDC5的表達(dá)量;B：Western blot檢測siRNA干擾DEPDC5后Caspase 3基因的表達(dá)變化(左)，以灰度值表示其相對變化(右)圖1 RNA干擾DEPDC5對凋亡蛋白Caspase 3表達(dá)影響

A：不同處理條件下胃癌細(xì)胞侵襲能力的變化(結(jié)晶紫染色,×200);B：不同處理條件下胃癌細(xì)胞遷移能力的變化(明場,×4)圖2 RNA干擾DEPDC5對胃癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

PI3K/Akt/mTOR通路對生長因子敏感，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；Ras/Raf/MEK/ERK與能量代謝相關(guān)，能夠間接調(diào)節(jié)mTOR的活性。mTORC2由mTOR、Rictor、PROTOR、mLST8、mSIN1和Deptor構(gòu)成，在細(xì)胞生存、細(xì)胞骨架形成、多肽、糖類、脂質(zhì)的降解等方面發(fā)揮作用[16]。腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，已有研究顯示多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在mTOR通路的異常，該通路活性變化可引起癌基因和抑癌基因的活性改變，參與腫瘤的發(fā)生、侵襲和遷移。mTOR能夠調(diào)節(jié)TGF-β通路活性調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化，通過Bcl-2、細(xì)胞色素C和自噬相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性及自噬性凋亡[17-18]。mTOR在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用使其成為潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)[19]。

DEPDC5是mTORC1的負(fù)性調(diào)控因子——DEPDC5基因缺陷可引起mTORC1信號的增加[20]，磷酸化DEPDC5可使其對mTORC1的抑制作用解除[13]，并且在體實驗顯示，使用雷帕霉素抑制mTORC1活性可挽救小鼠神經(jīng)元DEPDC5缺失導(dǎo)致的行為和生化缺陷[21]，DEPDC5對mTORC1活性的影響提示其可能作為mTOR的調(diào)控因子參與mTOR相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。在腫瘤研究中，盡管已有研究顯示，DEPDC5參與了病毒感染引起的肝癌發(fā)生[9-11,22-23]，且DEPDC5基因突變與胃腸間質(zhì)瘤形成過程相關(guān)[11]。但因DEPDC5基因轉(zhuǎn)錄本較多，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)變化還不甚清楚，有關(guān)DEPDC5在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及作用機(jī)制還鮮見報道。探究DEPDC5表達(dá)量與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系和DEPDC5在腫瘤生長中的作用，對揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制具有一定的積極意義。

項目組前期通過TCGA數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)DEPDC5基因表達(dá)與胃癌的發(fā)生相關(guān)，胃癌發(fā)生過程中DEPDC5基因的表達(dá)增加，高DEPDC5基因表達(dá)的胃癌患者生存期較短，提示DEPDC5基因表達(dá)變化可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，為探究DEPDC5在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究通過體外RNA干擾實驗證實，DEPDC5基因表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生相關(guān)，并且DEPDC5基因表達(dá)與胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲無關(guān)——RNA干擾DEPDC5表達(dá)時，胃癌細(xì)胞凋亡增加，但侵襲和遷移能力未發(fā)現(xiàn)顯著變化。然而，研究對DEPDC5在胃癌發(fā)生中的作用是否與mTORC1相關(guān)通路有關(guān)并未進(jìn)行探究。此外，DEPDC5有多個轉(zhuǎn)錄本，研究并未對各轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行區(qū)分，未來還需進(jìn)一步對DEPDC5不同轉(zhuǎn)錄本在胃癌發(fā)生中的作用及作用機(jī)制進(jìn)行探究。顯然，以上問題的闡明將會增加我們對DEPDC5參與胃癌發(fā)生機(jī)制的理解，并為利用DEPCDC5-mTORC1相關(guān)通路進(jìn)行腫瘤的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。