ERCC1及其重疊基因 3’端非編碼區(qū)多態(tài)性與結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)的病例對(duì)照研究

張靖悅，張倩也，陳信楨，張國培，肖明揚(yáng)，逯曉波

（中國醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，沈陽 110122）

遺傳與環(huán)境因素共同作用是結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）發(fā)生的機(jī)制［1］。環(huán)境有害因子可與DNA結(jié)合造成DNA損傷。切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（excision repair cross-complementary enzyme 1，ERCC1）的表達(dá)水平和DNA損傷的修復(fù)活性密切相關(guān)，且其單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)與CRC的易感性存在關(guān)聯(lián)［2］。此外，反義切除修復(fù)交叉互補(bǔ)因子1（CD3e molecule，epsilon associated protein，CD3EAP）基因與PPP1R13L（protein phosphatase 1 regulatory subunit 13 like）基因分別與ERCC1的3’端非編碼區(qū)（3’ -untranslated region，3’ UTR）及5’端重疊，且二者基因的多態(tài)性與CRC的易感性也密切相關(guān)［3］。因此，本研究擬通過在中國東北地區(qū)漢族人群中開展病例對(duì)照研究，探討中國漢族人群中ERCC1rs3212986、ERCC1rs735482、ERCC1rs2336219、CD3EAPrs1007616和PPP1R13Lrs6966多態(tài)性位點(diǎn)與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)聯(lián)，為尋找CRC易感性生物標(biāo)志提供理論依據(jù)和科學(xué)線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器：DNA提取試劑盒（北京天根生化技術(shù)有限公司）；SNP基因探針及引物合成（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；LightCycler? 480 Probes Master試劑（瑞士Roche公司）。Nanodrop核酸定量分析儀（美國ThermoFisher Scientific公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（瑞士Roche公司）；低溫超速離心機(jī)（美國Beckman公司）；CF15D低溫高速離心機(jī)（日本Hitachi公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.1.2 研究對(duì)象：本研究采用病例對(duì)照研究，研究對(duì)象均為來自中國東北地區(qū)無血緣關(guān)系的漢族人群。選擇2014年10月至2015年3月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院就診的200例原發(fā)性CRC患者作為病例組。選擇于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢的200名健康志愿者作為對(duì)照組，對(duì)照組無癌癥病史，并按年齡（±2歲）及性別與病例匹配，在同一地區(qū)和同一時(shí)期招募。本研究已獲得中國醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并在實(shí)施過程中遵守《赫爾辛基宣言》，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。通過調(diào)查問卷的形式收集研究對(duì)象的基本資料，采集外周靜脈血5 mL，EDTA抗凝，置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取：用DNA提取試劑盒提取2組DNA后，檢測DNA質(zhì)量并調(diào)整DNA濃度為200 ng/μL，取A260/A280位于1.7～1.9的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 候選SNP位點(diǎn)的確定：根據(jù)Hapman（http：//www.hapmap.org）、PubMed（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）和UCSC（http：//www.genome.ucsc.edu）網(wǎng)站提供的中國漢族人群中ERCC1、CD3EAP及PPP1R13L的3’ UTR多態(tài)性位點(diǎn)信息、中國漢族北京人群的最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.2及樣本量確定候選SNP位點(diǎn)為ERCC1rs3212986、ERCC1rs735482、ERCC1rs2336219、CD3EAPrs1007616和PPP1R13Lrs6966。具體生物學(xué)信息見表1。

1.2.3 基因分型檢測：采用Taqman 水解探針法檢測候選SNP位點(diǎn)在2組人群中的分布頻率。本研究中使用的SNP基因探針及引物由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)并合成，包括rs3212986（ID號(hào)：C_2532948_10）、rs735482（ID號(hào)：C_341729_10）、rs2336219（ID號(hào)：C_16204465_10）、rs6966（ID號(hào)：C_2615637_10）、rs1007616（ID號(hào)：AH6RTHI）。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：2×LightCycler 480 Probes Master 10 μL，1×probe 5 μL，RNase-free water 3 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 s，共40個(gè)循環(huán)；40 ℃冷卻30 s。

表1 候選SNP位點(diǎn)基本信息Tab.1 Basic information of candidate SNP sites

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。年齡呈正態(tài)分布，以（）表示，計(jì)數(shù)資料用［n（%）］表示，2組間SNP位點(diǎn)連鎖不平衡用Haploview 4.2軟件分析。采用Welch’st檢驗(yàn)比較2組間年齡差異；χ2檢驗(yàn)分析SNP位點(diǎn)的基因型在病例組和對(duì)照組中的分布差異。采用非條件logistic回歸模型分析SNP位點(diǎn)不同基因型與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)，用比值比（odds ratio，OR）及其 95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度。統(tǒng)計(jì)分析采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料對(duì)比

病例組男女比為113 ∶87，對(duì)照組男女比為111 ∶89，2組之間性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.041，P=0.840）；納入研究的2組研究對(duì)象均以年齡超過50歲的人群為主，約占80%，2組之間年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=0.525，P=0.600）。見表2。

2.2 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果

表2 病例組與對(duì)照組的臨床特征比較Tab.2 Comparison of clinical characteristics in case group and control group

本研究選取的rs3212986、rs735462、rs2336219、rs1007616及rs6966位點(diǎn)對(duì)照組基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡（P＞ 0.05）。

2.3 關(guān)聯(lián)分析

基因分型結(jié)果顯示，ERCC1rs3212986位點(diǎn)的等位基因在病例組與對(duì)照組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=4.61，P=0.032），PPP1R13Lrs6966位點(diǎn)基因型在2組中的頻率分布具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=6.05，P=0.049），其余SNP位點(diǎn)基因型則均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ERCC1rs3212986位點(diǎn)的AA基因型與CRC的發(fā)生具有相關(guān)性（OR=2.53，95%CI：1.14～5.60）；其余SNP位點(diǎn)與CRC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

2.4 分層分析

2.4.1 性別分層：進(jìn)一步按照性別分層后，男性中rs3212986 位點(diǎn)的AA基因型患CRC的風(fēng)險(xiǎn)增高（OR=4.04，95%CI：1.26～12.97）；在女性中未觀察到這種關(guān)聯(lián)。見表4。

2.4.2 年齡分層：根據(jù)年齡分布的特點(diǎn)，病例組和對(duì)照組的平均年齡分別為62.18歲和61.59歲，因此以60歲作為分層點(diǎn)，將研究對(duì)象分為＜60歲和≥60歲2層，在年齡＜60歲人群中，相關(guān)性分析未發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)與CRC之間的關(guān)聯(lián)；而在年齡≥60歲人群中，ERCC1rs3212986位點(diǎn)的AA基因型患CRC的風(fēng)險(xiǎn)增高（OR=7.48，95%CI：1.63～34.3），其余SNP位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)這種關(guān)聯(lián)。見表5。

2.5 連鎖不平衡及單倍型分析

2.5.1ERCC1基因單體型結(jié)構(gòu)分析：單體型為一條染色體區(qū)域中所有SNPs 等位基因的集合。對(duì)ERCC1基因3個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果顯示，rs3212986、rs735482和rs2336219位點(diǎn)處于強(qiáng)連鎖不平衡（P=0.003），提示AAG單體型可能與CRC患病風(fēng)險(xiǎn)增高有關(guān)（OR=1.61，95%CI：1.09～2.37）。此外，構(gòu)建得到的其他單體型在2組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表6。

表3 病例組和對(duì)照組中候選SNP位點(diǎn)的等位基因和基因型頻率比較Tab.3 The frequencies of alleles and genotypes of candidate SNP locis in cases and controls

2.5.2 區(qū)域性單體型分析：染色體在傳遞過程中同源片段發(fā)生重組，傳遞多代之后原有的排布已被打亂，而染色體中沒有發(fā)生重組的區(qū)域被重組區(qū)域相互隔開，這些沒有發(fā)生重組的區(qū)域被稱為區(qū)域性單體型。由于rs3212986、rs735482、rs2336219、rs1007616和rs6966位點(diǎn)所在的基因相互之間有重疊，故位點(diǎn)間可能存在連鎖不平衡，故用Haploview4.2軟件進(jìn)行區(qū)域性單體型分析。結(jié)果顯示，rs3212986、rs735482、rs2336219和rs1007616處 于連鎖不平衡（rs6966與其他SNP位點(diǎn)呈較弱連鎖不平衡，所以實(shí)際只有4個(gè)位點(diǎn)被納入了單體型分析），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在Haploview4.2軟件構(gòu)建的區(qū)域單體型中，提示CCAC（OR=4.46，95%CI：1.79～11.09）、AAGC（OR=5.64，95%CI：2.23～14.31）、CAGT（OR=4.04，95%CI：1.58～10.31）可能與CRC患病風(fēng)險(xiǎn)增高有關(guān)。此外，構(gòu)建得到的其他區(qū)域單體型在2組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。見表7。

3 討論

CRC具有高發(fā)病率、高死亡率的特點(diǎn)，多數(shù)病例預(yù)后不良［4］。DNA損傷是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的起始動(dòng)力，DNA損傷修復(fù)基因越來越受到惡性腫瘤研究者的密切關(guān)注［5］。作為常見惡性腫瘤，CRC與DNA損傷修復(fù)基因有著密不可分的關(guān)系，其發(fā)生被認(rèn)為可能是機(jī)體多個(gè)DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)紊亂而產(chǎn)生的不良結(jié)局［6］。

表4 不同性別分層分析SNP位點(diǎn)與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)Tab.4 The association between SNPs and CRC risk analyzed by gender stratification analysis

表5 不同年齡分層分析SNP位點(diǎn)與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)Tab.5 The association between SNPs and CRC risk analyzed by age stratification analysis

表6 ERCC1單體型結(jié)構(gòu)與CRC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)Tab.6 The association between the haplotype structures of ERCC1 and the risk of CRC

表7 ERCC1及其重疊基因區(qū)域單體型結(jié)構(gòu)與CRC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)Tab.7 The association between the regional haplotype structures of ERCC1 and its overlapping genes and the risk of CRC

研究［7］發(fā)現(xiàn)，DNA修復(fù)基因ERCC1的表達(dá)水平與CRC發(fā)病有明顯相關(guān)性。此外，ERCC1多態(tài)性也與個(gè)體DNA修復(fù)能力、惡性腫瘤易感性及腫瘤耐藥密切相關(guān)。ERCC1rs3212986位點(diǎn)位于基因的3’ UTR區(qū)，本研究發(fā)現(xiàn)其AA基因型患CRC風(fēng)險(xiǎn)升高，提示可能是由于該基因型與較低水平的DNA修復(fù)效率和較高水平的DNA損傷有關(guān)。這與以往研究rs3212986位點(diǎn)基因型與某些常見癌癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性相符，如ZHAO等［8］發(fā)現(xiàn)ERCC1rs3212986基因多態(tài)性的TT基因型攜帶個(gè)體與TG+GG基因型攜帶個(gè)體相比，胰腺癌的易感性更高，特別是在吸煙者中ERCC1rs3212986基因多態(tài)性更有助于胰腺癌的發(fā)展；GENG等［9］也發(fā)現(xiàn)ERCC1rs3212986基因多態(tài)性與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生率顯著相關(guān)，AA基因型攜帶者發(fā)生神經(jīng)膠質(zhì)瘤的風(fēng)險(xiǎn)是CA+CC基因型攜帶者的1.26倍。因此，提示在某些常見腫瘤的篩查診斷中ERCC1rs3212986位點(diǎn)可以作為有效的早期生物易感標(biāo)志。

ERCC1rs3212986位點(diǎn)位于ERCC1與CD3EAP的重疊區(qū)域，即同時(shí)位于ERCC1的3’ UTR和CD3EAP的編碼區(qū)。因此，ERCC1rs3212986位點(diǎn)的SNP既可以通過影響CD3EAP編碼區(qū)的基因表達(dá)，導(dǎo)致CD3EAP轉(zhuǎn)錄翻譯后生成的氨基酸不同，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)功能出現(xiàn)改變，從而影響細(xì)胞增殖，又可以影響ERCC1mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其與miRNA的結(jié)合能力發(fā)生改變，影響miRNA的調(diào)控能力，最終導(dǎo)致機(jī)體DNA修復(fù)能力出現(xiàn)差異，從而影響某些疾病的發(fā)生發(fā)展。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)包含該等位基因的單體型及多態(tài)性區(qū)域CRC的患病風(fēng)險(xiǎn)升高，也提示了該位點(diǎn)在CRC易感性中的重要性。

本研究尚有不足之處，腫瘤的發(fā)生是環(huán)境致癌物與遺傳物質(zhì)相互作用的結(jié)果，由于條件受限，本研究對(duì)象未能收集到吸煙、飲酒、飲食習(xí)慣、職業(yè)暴露等因素，故不能對(duì)環(huán)境與遺傳因素的交互作用與CRC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)做進(jìn)一步的分析，而且受到病例樣本含量的局限，本研究發(fā)現(xiàn)的rs3212986基因多態(tài)性與CRC易感性的關(guān)聯(lián)仍需大樣本人群的檢驗(yàn)等。因此，設(shè)計(jì)更加嚴(yán)密的病例對(duì)照研究、擴(kuò)大樣本含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過生物信息學(xué)進(jìn)行SNP位點(diǎn)的深入功能挖掘，并與遺傳毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，也是未來研究的重要方向。