藍(lán)舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亞姆血清群病毒三重RT-qPCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

楊振興，李占鴻，肖 雷，謝佳芮，廖德芳，李卓然，李華春，朱建波，楊 恒

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院/云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

藍(lán)舌病病毒 (Bluetongue virus，BTV)、流行性出血病病毒 (Epizootic hemorrhagic disease virus，EHDV)和帕利亞姆血清群病毒(Palyam serogroup virus，PALV)均為通過(guò)庫(kù)蠓Culicoides傳播的呼腸孤病毒科Reoviridae環(huán)狀病毒屬Orbivirus成員，廣泛分布于熱帶、亞熱帶與溫帶地區(qū)，牛是3種病毒的重要宿主[1-3]。BTV、EHDV和PALV在全球引起的動(dòng)物疫病的暴發(fā)和流行給牛羊養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，導(dǎo)致牛羊進(jìn)出口貿(mào)易受限，影響了國(guó)際畜產(chǎn)品正常貿(mào)易。據(jù)估計(jì)，2009年全球畜牧業(yè)僅因BTV引發(fā)藍(lán)舌病而導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失就高達(dá)30億美元[4]；近年來(lái)EHDV在中東多國(guó)特別是在阿爾及利亞、突尼斯、摩洛哥和以色列等國(guó)家的牛群中多次引發(fā)流行性出血病的暴發(fā)，嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)的健康發(fā)展[5]；PALV感染妊娠期母牛能引起新生犢牛積水性無(wú)腦和小腦發(fā)育不全，曾在日本和韓國(guó)暴發(fā)，給兩國(guó)的肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6]。目前，藍(lán)舌病和流行性出血病已經(jīng)被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織 (Office international des epizooties，OIE)列為法定報(bào)告的跨境動(dòng)物疫病。

BTV、EHDV和PALV血清型眾多，目前世界范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)27種BTV血清型[7]、9種EHDV血清型[8]和10種PALV血清型[9]。2013年在公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)的資助下，在全國(guó)范圍內(nèi)開展了蟲媒病毒的流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)我國(guó)主要流行12 種 BTV 血清型 (BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21 和-24)[10]，5 種 EHDV 血清型(EHDV-1、-5、-6、-7 和-10)[11]和 3 種 PALV 血清型[Chuzan disease virus (CHUV)、D’Aguilar virus(DAV)與 Bunyip Creek virus (BCV)][12]等，表明流行于我國(guó)的BTV、EHDV和PALV血清型具有豐富多樣性。對(duì)3種病毒的血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)至少12個(gè)省區(qū)的牛羊群中同時(shí)存在BTV、EHDV和PALV抗體陽(yáng)性，且陽(yáng)性率由北向南逐漸升高，特別是在南方地區(qū)，如云南、廣西和廣東等地的牛群中，3種病毒的血清抗體陽(yáng)性率均高于30%；說(shuō)明BTV、EHDV和PALV在我國(guó)已經(jīng)廣泛存在，嚴(yán)重威脅我國(guó)畜牧產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[13-15]。

快速診斷病原是動(dòng)物疫病防控的重要一環(huán)，BTV、EHDV和PALV不僅具有共同的傳播媒介與易感動(dòng)物，在流行區(qū)域上也存在重疊；因此，建立一種能同時(shí)診斷這3種病原的檢測(cè)方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值。多重RT-qPCR可在1個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)多種目的基因，克服了普通熒光PCR只能檢測(cè)單一基因的缺點(diǎn)，具有特異性強(qiáng)、敏感性高和短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)多種病原的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物傳染病的診斷[16]。本研究旨在運(yùn)用TaqMan探針技術(shù)建立一種三重RT-qPCR方法，提高病毒檢出率，簡(jiǎn)化操作流程，降低檢測(cè)成本，為臨床快速鑒別檢測(cè)BTV、EHDV和PALV提供有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 毒株、血液和核酸樣品

24個(gè)BTV血清型(BTV-1～BTV-24)南非參考毒株由OIE南非藍(lán)舌病參考實(shí)驗(yàn)室(Onderste-poort Veterinary Institute)提供，6個(gè) EHDV 血清型(EHDV-1、-2、-5、-6、-7、-8)參考毒株由澳大利亞麥克阿瑟·伊麗莎白農(nóng)業(yè)研究所(Elizabeth Macarthur Agricultural Institute，EMAI)提供，中國(guó)分離的12種BTV血清型、5種EHDV血清型和3種PALV血清型代表毒株信息見表1。阿卡斑病毒(Akabane virus, AKAV)核酸由云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)核酸由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)，口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)、牛流行熱病毒 (Bovine ephemeral fever virus, BEFV)核酸由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)。BTV Seg-10、EHDV Seg-5和PALV Seg-7基因節(jié)段重組質(zhì)粒pLB-BTV-NS3-T7、pLB-EHDV-NS1-T7和 pLBCHUV-VP7-T7由云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期制備并保存。

表 1 中國(guó)分離的不同藍(lán)舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亞姆血清群病毒血清型代表毒株信息Table 1 Representative strains of different serotypes of bluetongue virus, epizootic hemorrhagic disease virus and Palyam serogroup virus isolated in China

1.2 主要試劑與儀器

病毒 RNA 抽提試劑盒 MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit購(gòu)自Thermo公司，DNA膠回收試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，T7啟動(dòng)子RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司，RNA純化試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒、pLB平末端克隆載體購(gòu)自天根生化科技有限公司，7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購(gòu)自ABI公司。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成

從NCBI檢索并下載BTV、EHDV、PALV病毒的全基因組序列，并根據(jù)云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離的3種病毒的全基因組序列，利用MEGA-X進(jìn)行序列對(duì)比分析，確定并選擇 BTVNS3、EHDVNS1和 PALVVP7基因保守區(qū)序列，利用 Primer Express 6.0 軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物，分別用FAM、VIC和TAMRA熒光基團(tuán)標(biāo)記TaqMan探針，使用BHQ1作為淬滅基團(tuán)(表2)。引物和探針均由寶生物工程(大連)有限公司合成，并用 RNase-free 水稀釋至 20 μmol/L。

表 2 藍(lán)舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亞姆血清群病毒三重RT-qPCR的引物與探針Table 2 Primers and probes used for detecting bluetongue virus, epizootic hemorrhagic disease virus and Palyam serogroup virus by triplex RT-qPCR

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

提取 pLB-BTV-NS3-T7、pLB-EHDV-NS1-T7和pLB-CHUV-VP7-T7基因序列重組質(zhì)粒，使用XbaⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行質(zhì)粒的酶切線性化。取1 μg純化后的DNA作為模板，使用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行 BTV Seg-10 (822 bp)、EHDV Seg-5 (533 bp)和PALV Seg-7 (950 bp) ssRNA 的體外轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為：DNA 模板 5 μL、RiboMAXTMExpress T7 2×Buffer 10 μL、T7 Express Enzyme Mix 2 μL，加入RNase-free 水補(bǔ)齊至 20 μL；37 ℃ 反應(yīng) 30 min。使用RNA純化試劑盒純化轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，Nanodrop ND-2000測(cè)定核酸濃度后，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量計(jì)算純化后ssRNA的拷貝數(shù)。

1.5 三重RT-qPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

以體外轉(zhuǎn)錄的 BTV Seg-10、EHDV Seg-5 和PALV Seg-7的ssRNA為模板，采用方陣法分別對(duì)三重 RT-qPCR 方法的引物濃度 (0.1～0.5 μmol·L?1)、探針濃度 (0.1～0.8 μmol·L?1)、退火溫度 (50～60 ℃)和模板體積(2～8 μL)進(jìn)行篩選，確定最佳反應(yīng)條件。

1.6 特異性試驗(yàn)

以制備好的 BTV Seg-10、EHDV Seg-5 和PALV Seg-7的ssRNA模板作為陽(yáng)性對(duì)照，與AKAV、PPRV、FMDV和BEFV核酸一同進(jìn)行三重RT-qPCR檢測(cè)，設(shè)立陰性牛羊血液總RNA及DEPC水分別作為陰性和空白對(duì)照，重復(fù)3次。

1.7 敏感性試驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別將3種病毒的體外轉(zhuǎn)錄ssRNA以10倍梯度稀釋獲得拷貝數(shù)為1×1010～1×10?1μL?1的 12 個(gè)梯度，分別以陰性牛羊血液總RNA及DEPC水作為陰性和空白對(duì)照。所有樣品及對(duì)照均設(shè)2個(gè)復(fù)孔，同時(shí)進(jìn)行單重和三重RT-qPCR檢測(cè)，并以RNA濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、三重RT-qPCR結(jié)果Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

以BTV、EHDV和PALV體外轉(zhuǎn)錄的ssRNA的 3 個(gè)稀釋度 (拷貝數(shù)分別為1×103、1×105和 1×107μL?1)為模板，每個(gè)稀釋度各取 10 份樣本分別在不同的時(shí)間重復(fù)檢測(cè)3次，同時(shí)設(shè)立陰性牛羊血液總RNA及DEPC水分別作為陰性和空白對(duì)照，并通過(guò)計(jì)算Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，驗(yàn)證三重RT-qPCR的批內(nèi)和批間重復(fù)性。

1.9 混合病毒核酸樣品的檢測(cè)試驗(yàn)

將 BTV、EHDV 和 PALV 3種病毒高、中、低濃度 (拷貝數(shù)分別為1×106、1×104和 1×102μL?1)的ssRNA分別按體積比1∶1混合，同時(shí)進(jìn)行單重和三重RT-qPCR檢測(cè)，并設(shè)立陰性牛羊血液總RNA及DEPC水分別作為陰性和空白對(duì)照。在3種病毒核酸混合的情況下分析高濃度的核酸模板是否會(huì)影響三重RT-qPCR對(duì)低濃度核酸模板的檢測(cè)結(jié)果。

1.10 毒株與臨床血液樣本的檢測(cè)

提取2012—2016年在我國(guó)分離的BTV、EHDV和PALV不同血清型毒株及已分離毒株對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性血液樣本核酸，與24個(gè)BTV血清型及6個(gè)EHDV血清型參考毒株的核酸同時(shí)進(jìn)行單重和三重RT-qPCR檢測(cè)。比較試驗(yàn)結(jié)果，分析和評(píng)價(jià)該方法的臨床實(shí)用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以構(gòu)建好的3種重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得 BTV Seg-10 (822 bp)、EHDV Seg-5 (533 bp)和 PALV Seg-7 (950 bp)的 ssRNA，經(jīng)純化后測(cè)定質(zhì)量濃度分別為656.5、408.6 和 785.7 ng·μL?1，計(jì)算獲得拷貝數(shù)分別為1.41×1012、1.36×1012和 1.46×1012μL?1。將獲得的 ssRNA 樣品作為三重 RT-qPCR靈敏性評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)品。

2.2 三重RT-qPCR方法的建立與優(yōu)化

通過(guò)引物和探針濃度的不同配比試驗(yàn)及反應(yīng)條件的優(yōu)化試驗(yàn)，最終確定反應(yīng)體系?？偡磻?yīng)體積為20 μL，其中 2× One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL，ExTaqHS (5 U·μL?1) 0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL，Rox Reference Dye Ⅱ (50×)0.4 μL，BTV 上、下游引物各 0.2 μL 及探針 0.4 μL，EHDV 的上、下游引物各 0.3 μL 及探針 0.6 μL，PALV 上、下游引物各 0.2 μL 及探針 0.4 μL，變性模板RNA 4 μL，雙蒸水補(bǔ)充至 20 μL。反應(yīng)條件：42 ℃5 min；92 ℃ 10 s；92 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 個(gè)循環(huán)。

2.3 特異性試驗(yàn)

將3種病毒體外轉(zhuǎn)錄ssRNA作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)對(duì)AKAV、PPRV、FMDV和BEFV的核酸及陰性對(duì)照進(jìn)行三重RT-qPCR檢測(cè)。結(jié)果(圖1)顯示，本研究建立的三重RT-qPCR具有高度特異性，僅與對(duì)應(yīng)的BTV、EHDV和PALV核酸產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，其他病原(AKAV、PPRV、FMDV、BEFV)和陰性對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增曲線，判定為陰性。

圖 1 三重RT-qPCR特異性試驗(yàn)Fig.1 Specificity test of triplex RT-qPCR

2.4 敏感性試驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以拷貝數(shù)為1×1010～1×10?1μL?1的 12 個(gè)梯度ssRNA作為模板，根據(jù)已優(yōu)化的條件同時(shí)進(jìn)行三重和單重RT-qPCR反應(yīng)。結(jié)果顯示，所有陰性對(duì)照及空白對(duì)照均無(wú)陽(yáng)性擴(kuò)增(圖2a、2b、2c)；在核酸拷貝數(shù)為1×1010～1×101μL?1的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線均具有良好的線性，相關(guān)系數(shù)(R)均在0.998以上，引物擴(kuò)增效率 (E)為91.99%～103.42%(圖 2d、2e、2f)。各濃度體外轉(zhuǎn)錄ssRNA單重與三重RT-qPCR檢測(cè)的Ct均值(表3)表明本研究建立的三重 RT-qPCR最低可檢測(cè)到拷貝數(shù)為1×101μL?1的 BTV、EHDV 和PALV核酸，與單重檢測(cè)結(jié)果一致。

圖 2 藍(lán)舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亞姆血清群病毒體外轉(zhuǎn)錄ssRNA對(duì)三重RT-qPCR靈敏性評(píng)價(jià)Fig.2 Sensitivity evaluation of bluetongue virus, epizootic hemorrhagic disease virus and Palyam serogroup virus in vitro transcribed ssRNA to triplex RT-qPCR

表 3 單重和三重RT-qPCR方法Ct值比較1)Table 3 Ct value comparison between monoplex and triplex RT-qPCR

2.5 混合病毒核酸樣品的檢測(cè)

將BTV、EHDV和PALV 3種病毒的ssRNA分別按高、中、低3個(gè)濃度等體積混合，同時(shí)進(jìn)行單重和三重RT-qPCR檢測(cè)。結(jié)果(表4)顯示，一種病毒核酸模板濃度較高(拷貝數(shù)為106μL?1)而另一種病毒核酸模板濃度較低 (拷貝數(shù)為102μL?1)時(shí)，三重RT-qPCR依然可以同時(shí)檢測(cè)到3種病毒，并且與單重RT-qPCR結(jié)果無(wú)明顯差異。

表 4 混合病毒核酸樣品單重和三重RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果Table 4 Results of mixed virus nucleic acid samples detected by monoplex and triplex RT-qPCR

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

以高、中、低3個(gè)稀釋度的BTV、EHDV和PALV的ssRNA作為模板，分3個(gè)批次進(jìn)行檢測(cè)，每批次每個(gè)稀釋度各10份樣本，通過(guò)計(jì)算批內(nèi)、批間變異系數(shù)評(píng)價(jià)多重體系的穩(wěn)定性。結(jié)果(表5)顯示，BTV、EHDV和PALV病毒核酸高中低3個(gè)濃度所對(duì)應(yīng)的批內(nèi)和批間Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差均在0.5以內(nèi)，變異系數(shù)均在2%以下，可見三重體系對(duì)于3種病毒核酸的檢測(cè)均具有良好的穩(wěn)定性。

表 5 三重RT-qPCR重復(fù)性試驗(yàn)中Ct值與變異系數(shù)Table 5 Means and coefficients of variation in repeatability tests of triplex RT-qPCR

2.7 毒株與臨床血液樣本的檢測(cè)

對(duì)2012—2016年在我國(guó)分離的BTV、EHDV和PALV不同血清型毒株及分離出病毒的陽(yáng)性血液樣本和BTV、EHDV參考毒株核酸同時(shí)進(jìn)行單重和三重RT-qPCR檢測(cè)。結(jié)果(表6和表7)顯示，本研究建立的三重RT-qPCR方法對(duì)參考毒株和在我國(guó)分離培養(yǎng)的毒株核酸檢測(cè)Ct值為14.67～27.62，對(duì)血液樣本檢測(cè)Ct值為27.69～35.24；單重RT-qPCR檢測(cè)病毒毒株Ct值為15.08～26.04，對(duì)血液樣品檢測(cè)Ct值為28.03～34.67。對(duì)2種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，P>0.05，無(wú)顯著差異。本研究建立的三重RT-qPCR方法可準(zhǔn)確檢測(cè)出國(guó)內(nèi)外BTV、EHDV和PALV不同血清型毒株及臨床血液樣本中對(duì)應(yīng)的不同血清型病毒核酸，具有較好的群特異性，與單重檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異。

表 6 單重和三重RT-qPCR檢測(cè)中國(guó)分離的藍(lán)舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亞姆血清群病毒毒株及對(duì)應(yīng)陽(yáng)性血液樣本的驗(yàn)證試驗(yàn)Table 6 Demonstration tests of bluetongue virus, epizootic hemorrhagic disease and Palyam serogroup virus strains isolated in China and corresponding blood samples by monoplex and triplex RT-qPCR

表 7 單重和三重RT-qPCR檢測(cè)藍(lán)舌病病毒和流行性出血病病毒參考毒株的驗(yàn)證試驗(yàn)Table 7 Demonstration test of reference strains of bluetongue virus and epizootic hemorrhagic disease virus by monoplex and triplex RT-qPCR

3 討論與結(jié)論

作為蟲媒病毒的BTV、EHDV和PALV血清型多樣，傳播途徑相同，流行地域重疊，并且在動(dòng)物感染早期存在部分相似的臨床癥狀。國(guó)外研究曾報(bào)道3種病毒交叉感染的情況[17]。2013—2016年在公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)的資助下，云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在我國(guó)多個(gè)蟲媒病毒監(jiān)控點(diǎn)的不同哨兵牛上同時(shí)分離出了BTV、EHDV和PALV，對(duì)這3種病原的早期診斷是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)，往往僅能檢測(cè)出其中1種病毒核酸陽(yáng)性忽略另外2種病毒，增加病毒檢測(cè)的漏檢率，不利于動(dòng)物疫病的防控。基于此，本試驗(yàn)在原有RT-qPCR對(duì)蟲媒病毒的檢測(cè)基礎(chǔ)上，建立了針對(duì)BTV、EHDV和PALV的三重RT-qPCR檢測(cè)方法。

多重RT-qPCR方法易受引物、試劑和反應(yīng)條件等諸多因素影響[18]。因此本研究首先根據(jù)BTVNS3、EHDVNS1和 PALVVP7基因的高度保守性和較好群特異性等特點(diǎn)[19-21]，選擇作為引物和探針設(shè)計(jì)的靶基因，同時(shí)適當(dāng)引入簡(jiǎn)并堿基，并進(jìn)行BLAST序列對(duì)比分析確保引物和探針的保守性和特異性。隨后對(duì)反應(yīng)體系的退火溫度，模板體積、引物和探針濃度進(jìn)行了一系列優(yōu)化，確定了最優(yōu)反應(yīng)條件，將復(fù)合擴(kuò)增中引物間、模板間和引物與模板間可能存的競(jìng)爭(zhēng)抑制和相互干擾降到最低，從而實(shí)現(xiàn)從單種病毒檢測(cè)到同時(shí)進(jìn)行3種病毒的檢測(cè)，節(jié)省樣品用量、試驗(yàn)資源和操作時(shí)間。

本研究利用BTV、EHDV和PALV的體外轉(zhuǎn)錄ssRNA對(duì)三重RT-qPCR靈敏度進(jìn)行測(cè)試并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，三重反應(yīng)對(duì)病毒體外轉(zhuǎn)錄ssRNA拷貝數(shù)最低檢測(cè)限在10 μL?1級(jí)別，與單重反應(yīng)相比，靈敏度無(wú)明顯差異。龔雪蕊等[22]建立的寨卡病毒、登革病毒和基孔肯雅病毒三重RT-PCR檢測(cè)方法的最低拷貝數(shù)檢出限為10 μL?1，Nunes等[23]報(bào)道的用于南美洲漢坦4種流行病毒的RT-qPCR 檢測(cè)方法的拷貝數(shù)靈敏度為10 μL?1，二者均與本研究相近。本研究構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于等于0.998，擴(kuò)增效率基本相同且均大于90%，符合RT-qPCR擴(kuò)增效率在90%～110%的合理范圍。

前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，BTV、EHDV和PALV在臨床上出現(xiàn)混合感染時(shí)，3種病毒在動(dòng)物血液中的載量會(huì)存在較大差異；因此，本試驗(yàn)將3種病毒不同濃度的核酸模板進(jìn)行混合，分析高濃度核酸模板是否對(duì)低濃度核酸模板存在干擾。結(jié)果顯示，一種病毒核酸模板濃度較高而另一種病毒模板濃度較低時(shí)，所建立的三重RT-qPCR方法依然可以同時(shí)檢測(cè)到3種病毒，并且與單重法的結(jié)果無(wú)明顯差異，表明高濃度模板對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增檢測(cè)干擾不明顯。重復(fù)性試驗(yàn)中，對(duì)3種病毒高、中、低3個(gè)濃度的模板ssRNA進(jìn)行檢測(cè)，變異系數(shù)均小于2%，表明本研究建立的三重RT-qPCR檢測(cè)方法具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，有良好的檢測(cè)效果。

2017年劉佳佳等[24]建立了BTV和EHDV雙重RT-qPCR檢測(cè)方法，但僅進(jìn)行了1種BTV和EHDV血清型的特異性驗(yàn)證。本研究以單重RT-qPCR檢測(cè)方法作為參照，使用建立的三重RT-qPCR同時(shí)對(duì)不同BTV和EHDV血清型參考毒株和我國(guó)主要流行的不同BTV、EHDV和PALV血清型毒株及其陽(yáng)性血液樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，本研究建立的三重RT-qPCR方法具有較好的群特異性，可以檢測(cè)出不同血清型的參考毒株和在我國(guó)主要流行的毒株及其血液樣品中對(duì)應(yīng)病毒的核酸，與單重法的檢檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異。

綜上所述，本研究將在我國(guó)已經(jīng)存在、主要流行于南方熱帶亞熱帶地區(qū)的3種蟲媒病毒作為一個(gè)組合，首次建立了一套三重RT-qPCR檢測(cè)方法，填補(bǔ)了同時(shí)檢測(cè)BTV、EHDV和PALV 3種病毒核酸方法的空缺。該方法可應(yīng)用于疫區(qū)或出入境動(dòng)物帶毒狀況監(jiān)測(cè)，對(duì)早期臨床疫病鑒定和防疫指導(dǎo)具有參考價(jià)值。此外，多重RT-qPCR檢測(cè)方法試驗(yàn)步驟簡(jiǎn)化、樣本用量少、試驗(yàn)成本低，可為疫情防控爭(zhēng)取寶貴時(shí)間。