豬O型口蹄疫病毒抗原表位/VP1蛋白的融合表達及免疫原性研究

劉家勐，宋 丹，羅朝唯，吳珂珂，易 琳，趙明秋，陳金頂，丁紅星

(華南農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642)

口蹄疫 (Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)感染引起的一種急性、烈性傳染病，家養(yǎng)和野生型的豬、牛、羊等偶蹄動物是該病常見的易感動物[1]。該病被國際動物衛(wèi)生組織(OIE)列為世界上最重要的動物疾病之一[2]。FMD典型的臨床癥狀包括發(fā)燒和口腔黏膜、乳部皮膚、蹄叉蹄踵等部位出現(xiàn)不同程度的水泡及爛斑[3]。自Loeffler等[4]在1897年發(fā)現(xiàn)FMD以來，全球養(yǎng)殖業(yè)便不斷受到其影響。該病流行范圍廣、發(fā)病率高、破壞力強，已成為目前世界動物產(chǎn)品貿(mào)易最重要的障礙之一[5]。

FMDV屬于小RNA病毒科Picornaviridae口瘡病毒屬Aphthovirus，小而無囊膜，分為7個不同的血清型，即 O、A、C、SAT 1、SAT 2、SAT 3 和 Asia 1[6]，其中，O型是目前全球流行范圍最廣的血清型[7]。FMDV顆粒由1個二十面體的外殼組成，該外殼包含4個結(jié)構蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)和8個非結(jié)構蛋白[8-9]。其中，結(jié)構蛋白VP1的第140～160位氨基酸處具有1個突出的環(huán)結(jié)構，稱為G-H環(huán)[10]，該環(huán)具有的RGD結(jié)合位點可與易感細胞表面的整合素受體分子相結(jié)合，已被鑒定為是引發(fā)機體產(chǎn)生中和抗體的主要免疫原性位點[11-12]。VP1還具有一個天然的優(yōu)勢是其同時存在T細胞表位(第16～44位氨基酸)和B細胞表位(第141～160位氨基酸和第200～213位氨基酸)，這些表位已被證實可被動物機體識別并誘導機體產(chǎn)生良好的免疫反應[13-15]。

近十年來，我國流行的FMDV以A型和O型為主，預防監(jiān)測和免疫撲殺是我國目前防控FMD的主要手段[16]。疫苗免疫是防控FMD的常見手段，當前預防FMD最有效的商業(yè)疫苗是用二乙烯亞胺(Binary ethylenimine，BEI)滅活的疫苗[17]。然而，傳統(tǒng)的滅活疫苗存在一些不可避免的缺點，如熱穩(wěn)定性較差、需要冷鏈運輸、免疫持續(xù)期短等[18]。隨著現(xiàn)代分子生物學和免疫學技術的不斷進展，以及全球豬肉貿(mào)易的日趨頻繁，F(xiàn)MD疫苗已逐漸從滅活疫苗、弱毒疫苗等傳統(tǒng)疫苗向合成肽疫苗、核酸疫苗、亞單位疫苗、活載體疫苗和可飼疫苗等新型疫苗的方向發(fā)展，研制新型FMD疫苗逐漸成為當前研究的熱點[19]。信號肽對蛋白的分泌有著積極的作用，Stern等[20]研究發(fā)現(xiàn)高斯熒光素酶(Gaussia luciferase)信號肽有很強的外源蛋白分泌能力。本研究以豬O型FMDVVP1基因序列為基礎，重復串聯(lián)該片段中的T、B細胞表位基因，并引入高斯熒光素酶信號肽序列，設計合成重組基因RP1，表達包含F(xiàn)MDV抗原表位與結(jié)構蛋白VP1的融合蛋白，并將表達后的融合蛋白與佐劑等體積混合制成亞單位疫苗。疫苗免疫小鼠后能有效刺激小鼠機體產(chǎn)生免疫應答反應，為FMD的防控提供了參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體與試驗動物

人胚腎上皮細胞(HEK-293T)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO-K1細胞)、大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞、表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro和輔助質(zhì)粒PLP1、PLP2、PLP3均由華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院微生 物學與免疫學教研室保存。

1.2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、F-12K培養(yǎng)基、0.25%(w)胰酶消化液購自美國Thermo Fisher公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I、BamH I購自寶生物工程 (大連)有限公司；T4 DNA連接酶、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3 000 購自美國 Thermo Fisher公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒等購自美國Omega Bio-Tek公司；鼠源His標簽單克隆抗體(MAb)、鼠源GAPDH MAb、HRP標記山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)、FITC標記山羊抗小鼠IgG等購自上海碧云天生物技術有限公司；FMDV VPI Mab由華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室保存；甘氨酸、甲醇、Tris base、NaCl和 KCl等化學試劑購自廣州豪凱生物技術有限公司；FMDV滅活疫苗Re-O/MYA98/JSCZ/2013株購自金宇保靈生物藥品有限公司；FMDV O型IgG抗體檢測試劑盒購自深圳芬德生物技術有限公司。

1.3 重組基因RP1的設計與合成

參照GenBank中登錄的豬O型FMDV全基因核苷酸序列(JN998085.1)，篩選獲得VP1基因序列；以-GG-、-GGSSGG-作為linker將該片段中的T細胞表位和B細胞表位(表1)串聯(lián)在VP1片段的首尾兩端，同時在N端引入高斯熒光素酶信號肽序列，在C端引入His標簽序列，設計合成重組基因RP1(圖1)。根據(jù)合成的RP1基因全序列設計1對引物RP1-F1/RP1-R1，分別在該引物中引入EcoR I和BamH I酶切位點，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為RP1-F1：5′-CGGAATTC GCTACCATGGGAGTGAAGGTGCT-3′，RP1-R1：5′-CGGGATCCTCAGTGGTGGTGATGGTGGTGAG GGGTCA-3′(下劃線處為酶切位點)。

表 1 表位肽序列及位置Table 1 Sequence and position of epitope peptides

圖 1 重組基因RP1多表位串聯(lián)模式圖Fig.1 Multi-epitope tandem pattern map of recombinant gene RP1

1.4 重組質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1的構建與鑒定

以人工合成的RP1全基因序列為模板，利用引物RP1-F1/RP1-R1擴增含有酶切位點的目的基因。擴增參數(shù)為98 ℃ 2 min；98 ℃ 30 s，65 ℃ 20 s，72 ℃30 s，共 30 個循環(huán)；72 ℃ 7 min。對 PCR 產(chǎn)物回收純化后通過雙酶切將RP1基因克隆到表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro中，將經(jīng)PCR及雙酶切鑒定后的重組質(zhì)粒命名為pCDH-CMV-MCSEF1-Puro-RP1。

1.5 重組慢病毒的制備

按照 Lipofectamine 3 000試劑盒說明書操作，將轉(zhuǎn)染試劑與1 000 ng的重組質(zhì)粒pCDH-CMVMCS-EF1-Puro-RP1和適量的輔助質(zhì)粒PLP1、PLP2、PLP3完全混勻，室溫孵育15 min后轉(zhuǎn)染6孔細胞板中的HEK-293T細胞，6 h后更換成含2%(φ)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)48 h即獲得重組慢病毒HIV-RPI。

1.6 重組細胞CHO-K1-RP1的構建與鑒定

當CHO-K1細胞在直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中貼壁生長至占60%皿底面積左右的數(shù)量時，加入收獲的重組慢病毒，并添加24 μg聚凝胺促進病毒吸附。待細胞長滿后添加32 μg嘌呤霉素篩選慢病毒是否感染成功。提取篩選后生長狀態(tài)良好的細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后作為模板，利用引物RP1-F1/RP1-R1 進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。另將篩選的重組細胞鋪滿96孔細胞板，用預冷的PBS緩沖液洗滌后固定細胞。向各孔中加入鼠源His標簽MAb(用PBST緩沖液按照體積比1∶200稀釋)為一抗，F(xiàn)ITC標記的山羊抗小鼠IgG(用PBST緩沖液按照體積比1∶300稀釋)為二抗，進行間接免疫熒光試驗(Indirect immunofluorescence assay，IFA)鑒定，觀察融合蛋白的表達情況。將鑒定正確的重組細胞命名為CHO-K1-RP1。

1.7 CHO-K1-RP1單克隆細胞株的篩選與鑒定

取適量篩選的重組細胞CHO-K1-RP1計數(shù)，采用有限稀釋法并按照每孔0.5個細胞的量鋪滿96孔板，篩選單克隆細胞株。觀察各孔細胞的生長狀況，棄去沒有細胞的孔和存在多個單克隆細胞團的孔，并做好標記。將篩選的單克隆細胞株擴大培養(yǎng)后以鼠源His標簽MAb(用PBST緩沖液按照體積比1∶200稀釋)為一抗，F(xiàn)ITC標記的山羊抗小鼠IgG(用PBST緩沖液按照體積比1∶300稀釋)為二抗進行IFA檢測融合蛋白的表達。將表達量較高的單克隆細胞株傳至30代，每隔5代收獲相同數(shù)量的細胞樣品，以 FMDV VP1 MAb(用 PBST 緩沖液按照體積比 1∶1 000 稀釋)、鼠源 GAPDH MAb(用PBST緩沖液按照體積比1∶1 000稀釋)為一抗，再以HRP標記的山羊抗小鼠IgG(用PBST緩沖液按照體積比1∶1 000稀釋)為二抗對收集到的細胞樣品進行Western blot檢測，分析篩選的單克隆細胞株中融合蛋白RP1的穩(wěn)定表達情況。

1.8 融合蛋白的制備與鑒定

將篩選的單克隆細胞株懸浮馴化培養(yǎng)，取適量懸浮培養(yǎng)的細胞，低速離心后棄上清液，細胞沉淀經(jīng)PBS緩沖液重新懸浮后通過超聲波裂解，4 ℃條件下以最大轉(zhuǎn)速離心，收集上清液，即為獲得的融合蛋白樣品，將樣品置于?80 ℃保存。以鼠源His標簽MAb(用PBST緩沖液按照體積比1∶1 000稀釋)、鼠源GAPDH MAb(用PBST緩沖液按照體積比1∶1 000稀釋)為一抗，再以HRP標記的山羊抗小鼠IgG(用PBST緩沖液按照體積比1∶1 000稀釋)為二抗，將制備的蛋白樣品及已知濃度的His標簽蛋白按照預定順序進行SDS-PAGE凝膠電泳及Western blot檢測，并通過ImageJ軟件進行灰度值分析，計算融合蛋白的質(zhì)量濃度。

1.9 重組亞單位疫苗的制備

根據(jù)“1.8”計算所得的重組蛋白質(zhì)量濃度，將表達的重組蛋白稀釋為80 μg/mL，并將其與ISA 201 VG佐劑按1∶1的體積比混合乳化，制備終質(zhì)量濃度為40 μg/mL的重組亞單位疫苗，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 小鼠免疫及抗體效價的測定

將30只4～6周齡的SPF級BALB/c小鼠隨機分為3組(I～III組)，每組10只。第I組接種制備的重組亞單位疫苗，第II組接種FMD商品化滅活疫苗，第III組接種PBS緩沖液作為對照，每只小鼠的免疫劑量均為200 μL。每次免疫間隔2周，共免疫3次，均采用皮下多點注射方式接種。分別在一次、二次和三次免疫后7 d經(jīng)尾靜脈采血，分離血清，利用ELISA抗體檢測試劑盒檢測小鼠血清特異性抗體。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒 pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1的構建與鑒定

由圖2可知，以構建的重組質(zhì)粒pCDH-CMVMCS-EF1-Puro-RP1為模板，利用引物RP1-F1/RP1-R1擴增出約1 500 bp的目的條帶，與目的基因片段大小相符；雙酶切重組質(zhì)粒后，在約1 500 bp處有一特異性條帶，與目的基因大小一致，表明正確構建了重組質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1。

圖 2 重組質(zhì)粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1的鑒定結(jié)果Fig.2 Identification result of recombinant plasmid pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-RP1

2.2 重組細胞CHO-K1-RP1的鑒定

提取重組細胞CHO-K1-RP1的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用特異性引物RP1-F1/RP1-R1進行擴增，結(jié)果顯示在約 1 500 bp處有目的條帶(圖3)，與預期相符。表明在轉(zhuǎn)錄水平上檢測到重組細胞CHO-K1-RP1中RP1基因的表達。

圖 3 重組細胞CHO-K1-RP1的RT-PCR鑒定結(jié)果Fig.3 Identification result of recombinant cell CHO-K1-RP1 by RT-PCR

2.3 CHO-K1-RP1單克隆細胞株的鑒定

將篩選的CHO-K1-RP1單克隆細胞擴大培養(yǎng)，通過IFA及Western blot鑒定重組基因RP1的表達。IFA結(jié)果顯示，部分單克隆細胞株可發(fā)出綠色熒光，而對照細胞無綠色熒光(圖4)；Western blot結(jié)果顯示，不同代次細胞樣品均能在55 kU處觀察到特異性條帶(圖5)。表明篩選獲得的部分CHOK1-RP1單克隆細胞株可穩(wěn)定表達融合蛋白RP1。

圖 4 單克隆細胞株的間接免疫熒光試驗鑒定Fig.4 Indirect immunofluorescence assay identification of monoclonal cell line

圖 5 融合蛋白在不同代次細胞中表達的鑒定Fig.5 Identification of the expression of fusion protein in different generations of cells

2.4 融合蛋白的Western blot鑒定及半定量結(jié)果

收集擴大培養(yǎng)的單克隆細胞株樣品，通過Western blot進行鑒定，使用ImageJ軟件對所得條帶進行灰度值分析。結(jié)果顯示，部分細胞樣品在約55 kU處出現(xiàn)特異性條帶(圖6)，與預期蛋白分子量大小相符；與空白對照細胞相比，不同細胞株融合蛋白的表達量有顯著差異(圖7)；表明該單克隆細胞株可成功表達融合蛋白RP1。挑選表達量最高的樣品，使用ImageJ軟件對其條帶(圖8)進行灰度值分析后測得融合蛋白的質(zhì)量濃度最高可達 110 μg/mL。

圖 6 單克隆細胞株的Western blot 鑒定Fig.6 Western blot identification of monoclonal cell line

圖 7 不同單克隆細胞株融合蛋白的相對表達量Fig.7 Relative expression levels of fusion protein in different monoclonal cell lines

圖 8 融合蛋白的半定量結(jié)果Fig.8 Semi-quantitative results of fusion protein

2.5 免疫后小鼠血清中特異性抗體的檢測

采用ELISA試劑盒檢測免疫后小鼠血清中特異性抗體水平。結(jié)果顯示，一次免疫后，所有小鼠血清中的特異性抗體水平均較低；二次免疫后，除對照組外，其余各試驗組小鼠血清中特異性抗體均出現(xiàn)不同程度的升高(P<0.05)；三次免疫后，除對照組外，其余各試驗組小鼠血清中特異性抗體水平均較高(P<0.05)，其中FMD亞單位疫苗組與FMD商品化滅活疫苗組小鼠抗體水平無顯著差異(P>0.05)(圖9)。表明本研究制備的FMD亞單位疫苗能夠有效刺激小鼠機體產(chǎn)生免疫應答反應。

圖 9 免疫后小鼠血清特異性抗體檢測結(jié)果Fig.9 Results of the serum specific antibody titer identification in immunized mice

3 討論與結(jié)論

FMD是一種極具傳染性的偶蹄類動物病毒病，雖然大多數(shù)易感動物可以在感染后幸存下來，但病灶常造成動物群體的生產(chǎn)率低下，嚴重制約全球養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展[21]。隨著國際貿(mào)易的日益密切，F(xiàn)MD的防治日趨困難。英國于1892年率先制定了控制FMD的基本程序，包括殺死并銷毀所有受感染和接觸病原的易感動物，對受影響的場所進行徹底清潔和消毒等[22]。直到19世紀50年代，法國學者Frenkel[23]從在屠宰場收集的牛舌上皮中分離出FMDV并對其進行了體外培養(yǎng)，才使得大規(guī)模生產(chǎn)疫苗成為可能。目前，接種疫苗仍然是多數(shù)國家和地區(qū)防控該病的常見方法，滅活疫苗因免疫程序簡單被廣泛使用，但我們也要正確認識滅活疫苗存在的一些缺點。因此，研究者們需要開拓創(chuàng)新，研制出安全且高效的FMD新型疫苗，為在世界范圍內(nèi)控制甚至消滅FMD提供新的解決途徑。

結(jié)構蛋白VP1不僅是病毒粒子識別受體細胞的關鍵蛋白，還包含多個重要的抗原表位，是研制FMD新型疫苗時的首選蛋白[24]。Cao等[25]研制出不同亞型的含有VP1 G-H環(huán)和Th表位的B4疫苗，并將其與Ploy(I∶C)聯(lián)合免疫動物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該疫苗可使動物機體獲得抵抗多個亞型毒株的交叉保護。高明等[26]設計并合成了FMDV VP1上的優(yōu)勢抗原表位基因串聯(lián)表達盒，與豬IgG重鏈恒定區(qū)基因在大腸埃希菌中實現(xiàn)共表達，純化后的蛋白與佐劑混合制成亞單位疫苗，免疫小鼠后能檢測到高水平中和抗體。本研究根據(jù)近年來我國豬FMD的流行特點，以豬O型FMDV的結(jié)構蛋白VP1為基礎，重復串聯(lián)該片段上的優(yōu)勢抗原表位(第16～44、141～160和200～213位氨基酸)基因，以linker進行連接后，人工合成重組基因RP1，以期通過CHOK1細胞表達獲得高免疫原性抗原蛋白。

截至2012年，哺乳動物蛋白表達系統(tǒng)已經(jīng)成為臨床應用上的主要重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)，生產(chǎn)了市場上將近一半份額的生物制藥產(chǎn)品[27]。該系統(tǒng)首選的CHO細胞具有高效的翻譯后修飾能力，其產(chǎn)生的糖基化蛋白與人體相容并具有顯著的生物活性[28]。另外，CHO細胞具有在生物反應器中生長至高密度的能力，且對病毒的傳播具有較低的風險[29]。由疏水性氨基酸構成的信號肽序列具有很強的外源蛋白分泌能力，在蛋白分泌表達中扮演著重要角色[30]。根據(jù)已有的報道[20]，我們在設計重組基因RP1序列時引入了高斯熒光素酶信號肽，以期獲得高分泌型融合蛋白。但是，只有極少量的RP1蛋白能分泌到細胞上清液中，以至于需要對上清液進行多倍濃縮才能檢測到微量的目的蛋白。我們推測信號肽要與目的蛋白相適應才有助于提高外源蛋白的分泌表達水平，因此在進行蛋白分泌表達研究時要綜合考慮目的蛋白的理化特性，選擇與之適應的信號肽來提高蛋白的分泌水平。本研究表達的融合蛋白RP1可作為FMD亞單位疫苗研制的候選蛋白，在后續(xù)的工作中，我們還需進一步優(yōu)化表達條件以提高蛋白的表達水平和分泌水平。