響應(yīng)面法優(yōu)化南沙參多糖類成分提取工藝*

嚴(yán)福林，穆巧巧，楊川力，李聰利，覃春葉，孫慶文，魏升華

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

南沙參為我國常用大宗藥材，藥用歷史悠久，其應(yīng)用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，名沙參，列為上品，具有養(yǎng)陰清肺、生津益胃、益氣化痰等功效，用于治療肺熱燥咳、陰虛勞嗽、食少嘔吐等疾病[1]。2015版《中國藥典》一部收載南沙參(Adenophorae Radix)來源于桔?？?Campanulaceae)植物沙參AdenophorastrictaMiq或輪葉沙參Adenophoratetraphylla(Thunb.)Fisch.的干燥根[2]。杏葉沙參、無柄沙參、石沙參等其余種類在其產(chǎn)地亦作藥用[3]。

現(xiàn)代研究表明，南沙參含有豐富的多糖、香豆素、甾醇、揮發(fā)油、萜類、酚酸類等化學(xué)成分，具有顯著的抗衰老、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗輻射、鎮(zhèn)咳祛痰等藥理作用[4-6]。其中，南沙參多糖對(duì)老齡小鼠的肝和腦組織中脂褐素的形成、血清中MDA的產(chǎn)生具有一定的抑制作用；可提高小鼠單胺氧化酶、全血GSH-PX和紅細(xì)胞中SOD的活性，增加血清中的睪酮含量，從而表現(xiàn)出一定的抗衰老作用；南沙參多糖對(duì)小鼠超氧自由基和羥自由基具有清除作用，具有肺癌抑制作用；改善和調(diào)節(jié)小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙；南沙參多糖還具有一定的保肝功效及抗真菌藥理作用[7-11]。因此，南沙參多糖是南沙參藥材中的最為重要藥效成分，其在應(yīng)用中的提取率直接影響著南沙參藥材的利用率與有效性。目前，南沙參多糖的研究主要集中在藥理作用方面，提取方法與含量測定方面的研究鮮有報(bào)道。據(jù)查閱，在南沙參多糖分離工藝與回流提取方法及降解方面有了初步研究[12-13]。

本研究在單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)法基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對(duì)南沙參多糖進(jìn)行提取方法、料液比、提取時(shí)間、提取溫度、提取功率等因素進(jìn)行優(yōu)化，以提高南沙參多糖的提取率，以豐富南沙參藥材的研究資料，為南沙參的開發(fā)利用與進(jìn)一步研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料均為野生，采自貴州境內(nèi)，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院魏升華教授鑒定為桔?？浦参镙喨~沙參Adenophoratetraphylla(Thunb.)Fisch.的干燥根，切片，60 ℃烘干，粉粹，過60目篩，備用。收集的種源種植于貴陽中醫(yī)學(xué)院中藥民族藥種質(zhì)資源圃，憑證標(biāo)本保存于貴陽中醫(yī)學(xué)院中藥材種植(養(yǎng)殖)與加工研究所，具體信息見表1。

表1 藥材的采集信息Tab.1 Collection information of the medicinal materials

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

儀器：紫外可見分光光度計(jì)(UV-7200，日本島津公司)，恒溫水浴鍋(HH-4，常州國華電器有限公司)，粉碎機(jī)(FW135，天津市泰斯特儀器有限公司)，離心機(jī)，電熱鼓風(fēng)干燥箱，萬分之一分析天平(METTLER TOLEDO)，微波爐(格蘭仕)，超聲提取儀(Scientz-250c，寧波新藝)。試劑：無水葡萄糖(20170321，成都金山化學(xué)試劑有限公司)，濃硫酸(20160822，重慶川東化工集團(tuán)有限公司)，苯酚、乙醇、正丁醇、丙酮(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，蒸餾水等，實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試液配制

苯酚溶液配制：精密稱取苯酚4.00 g于100 mL的容量瓶中，加入蒸餾水定容后搖勻，配制成濃度為4 mg/mL的苯酚溶液。葡萄糖溶液(標(biāo)準(zhǔn)品)配制：精密稱取恒重(105 ℃)后的無水葡萄糖100 mg于1000 mL容量瓶中加入蒸餾水定容搖勻，配制成濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖溶液。Sevag試劑：精密量取正丁醇與氯仿，配制成體積比為1∶4的混合液，混勻，備用。

2.2 南沙參藥材多糖提取與提取率測定

精密稱取南沙參藥材粉末15份，每份5.0 g，于15個(gè)250 mL的燒杯中，各加入150 mL乙醇(90%)于室溫下靜置浸泡12 h，進(jìn)行脫脂處理。過濾，棄上清液，濾渣進(jìn)行提取處理(詳見表2)。

表2 南沙參藥材多糖提取方法Tab.2 Extraction methods of polysaccharide from Adenophorae Radix

提取完成后，減壓抽濾，收集濾液，60 ℃蒸發(fā)濃縮至10 mL體積(體積少于10 mL免濃縮)后4000 r/min離心10 min，取上清液加1/5體積的Sevag試劑(正丁醇∶氯仿=1∶4)搖勻，4000 r/min離心10 min，去除中間蛋白層，反復(fù)操作2次，取上清液加入4倍體積乙醇(95%)，封口膠封口后于5 ℃的冰箱中靜置24 h后減壓抽濾，得白色或乳白色的沉淀物，最后依次用95%乙醇、無水乙醇、丙酮洗滌，60 ℃干燥，精密稱定即得南沙參粗多糖質(zhì)量(MX)，待用。

精密稱取南沙參粗多糖5.00 mg，置于50 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容搖勻，用移液管取該溶液0.6 mL于10 mL具刻度的比色試管用蒸餾水補(bǔ)足2.0 mL搖勻，即得樣品溶液，測定其多糖濃度(c)。按照公式(1)計(jì)算多糖得率。

多糖得率=c×MX/300×100%

(1)

式中：c-樣品稀釋液對(duì)應(yīng)的多糖質(zhì)量濃度(mg/mL)；MX-中藥材中南沙參粗多糖質(zhì)量(mg)。

2.3 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以南沙參多糖提取率為響應(yīng)值，利用Minitab 16軟件，采取中心復(fù)合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)微波提取下3因素(時(shí)間、火力、料液比)、3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，確定中心試驗(yàn)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)因素、水平及中心復(fù)合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案見表3。

表3 中心復(fù)合設(shè)計(jì)Tab.3 Central composite design

應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，詳見表4。

表4 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.4 Response surface experiment design

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用苯酚-濃硫酸法，精密量取2.1下葡萄糖溶液0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL，分別加入10 mL有刻度的比色試管中，用蒸餾水補(bǔ)足2 mL，依次加入現(xiàn)配的4%苯酚1.0 mL、濃硫酸5.0 mL，搖勻，室溫放置30 min。以苯酚和濃硫酸同上操作為空白對(duì)照，于490 nm波長下測定其吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好，回歸方程為：Y=55.817X+0.0164，R2=0.9983，r=0.999。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve

2.5 批次驗(yàn)證試驗(yàn)

依據(jù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果，采用優(yōu)選的提取方法對(duì)不同產(chǎn)地6個(gè)批次的南沙參藥材樣品進(jìn)行多糖提取，以驗(yàn)證該提取方法的穩(wěn)定性與可靠性。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行分析與作圖，應(yīng)用SPSS19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較分析，P<0.05具有顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同提取方法對(duì)南沙參多糖提取率的影響

取同一批次南沙參藥材，按照2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行提取測定，每組進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，提取次數(shù)均為1次，計(jì)算各方法下南沙參多糖提取率。結(jié)果顯示，微波提取法南沙參多糖提取率最高，為8.85%，顯著高于其他的提取方法，比較具有顯著性差異(P<0.05)，且相對(duì)平均標(biāo)準(zhǔn)差最低，RSD=0.150%；其次為微波輔助回流提取法，提取率為7.72%，RSD=0.155%；回流提取法對(duì)南沙參多糖的提取率最低，提取率=5.60%，相對(duì)平均標(biāo)準(zhǔn)差最高，RSD=0.210%?？梢?，在相應(yīng)的條件下微波提取法對(duì)南沙參多糖的提取效果最優(yōu)(表5)。

表5 不同提取方法南沙參多糖提取率Tab.5 Extraction rates of polysaccharid from Adenophorae Radix by different extraction

3.2 提取功率對(duì)南沙參多糖提取率的影響

以提取時(shí)間為90 min、料液比=1∶30(g/mL)、提取次數(shù)為1次，按照2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行提取，考察微波提取方法下提取功率100 W、300 W、500 W、700 W、900 W對(duì)南沙參多糖提取率的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)微波提取功率在100～700 W范圍內(nèi)，南沙參多糖提取率從(6.08±0.198)%升高至(8.85±0.150)%，700 W功率下的南沙參多糖提取率顯著高于其他功率，比較具有顯著性差異(P<0.05)；當(dāng)提取功率>700 W時(shí)，南沙參多糖提取率呈下降趨勢，到900 W時(shí)，提取率降低為(8.04±0.221)%，與500 W功率下的提取率相當(dāng)。結(jié)果表明，當(dāng)提取功率為700 W時(shí)，南沙參多糖的提取率較高(圖2)。

圖2 微波提取功率對(duì)南沙參多糖提取率的影響Fig.2 Influence of microwave extraction power on extraction rate of polysaccharide from Adenophorae Radix

3.3 提取時(shí)間對(duì)南沙參多糖提取率的影響

以提取功率為700 W，料液比=1∶30(g/mL)，提取次數(shù)為1次，按照2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行提取，考察微波提取方法下提取時(shí)間30 min、60 min、90 min、120 min、150 min對(duì)南沙參多糖提取率的影響。結(jié)果顯示，提取時(shí)間在30～90 min范圍內(nèi)，南沙參多糖提取率呈現(xiàn)的是上升趨勢，從(5.48±0.141)%上升到(8.85±0.150)%；90～120 min階段，南沙參多糖提取率比較無顯著性差異(P>0.05)。當(dāng)提取時(shí)間超過120 min時(shí)多糖提取率呈下降趨勢，因此，從節(jié)約高效方面考慮，提取時(shí)間為90 min時(shí)即可獲得較高的南沙參多糖提取率(圖3)。

圖3 微波提取時(shí)間長度對(duì)南沙參多糖提取率的影響Fig.3 Influence of microwave extraction time on extraction rate of polysaccharide from Adenophorae Radix

3.4 料液比對(duì)南沙參多糖提取率的影響

以提取功率為700 W，提取時(shí)間為 90 min，提取次數(shù)為1次，按照2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行提取，考察微波提取方法下料液比變量1∶10(g/mL)、1∶20(g/mL)、1∶30(g/mL)、1∶40(g/mL)、1∶50(g/mL)對(duì)南沙參多糖提取率的影響。結(jié)果顯示，料液比在1∶10～1∶40(g/mL)范圍內(nèi)，南沙參多糖提取率呈上升趨勢，從(4.15±0.342)%上升到(9.13±0.334)%；料液比1∶40～1∶50(g/mL)階段，南沙參多糖提取率呈下降趨勢，但料液比1∶30(g/mL)、1∶40(g/mL)、1∶50(g/mL)三組多糖提取率相互比較，均無顯著性差異(P>0.05)。因此，從節(jié)約高效方面考慮，料液比為1∶30(g/mL)時(shí)即可獲得較高的南沙參多糖提取率(圖4)。

圖4 提取料液比對(duì)南沙參多糖提取率的影響Fig.4 Influence of material/liquid ratio on extraction rate of polysaccharide from Adenophorae Radix

3.5 提取次數(shù)對(duì)南沙參多糖提取率的影響

以提取功率為700 W，提取時(shí)間為90 min，料液比為1∶30(g/mL)，按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行提取，考察微波提取方法下提取次數(shù)1次、2次、3次對(duì)南沙參多糖提取率的影響。結(jié)果顯示，提取次數(shù)1～3次范圍內(nèi)，南沙參多糖提取率呈上升趨勢，提取率分別為(8.85±0.150)%、(9.06±0.106)%、(9.11±0.119)%，三組多糖提取率相互比較，1次組與2次組比較，2次組與3次組比較，均無顯著性差異(P>0.05)，提取1次組與2次組比較具有顯著性差異(P<0.05)。因此，從節(jié)約、高效、便捷方面考慮，提取次數(shù)選擇1次提取，即可獲得較高的南沙參多糖提取率(圖5)。

圖5 提取次數(shù)對(duì)南沙參多糖提取率的影響Fig.5 Influence of extraction times on extraction rate of polysaccharide from Adenophorae Radix

3.6 響應(yīng)模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn)

依據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)方案，南沙參多糖提取率情況詳見表6。使用Design Expert 8.0.5對(duì)提取結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸擬合，得回歸方程為：

Y=7.52-0.11A+0.77B-0.27C+0.095AB+0.025AC-0.18BC-0.089A2+1.40B2+0.41C2(A-時(shí)間，min；B-火力，W；C-料液比，g∶mL)。

對(duì)回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，詳見表7。結(jié)果顯示，F(xiàn)=8.56，P>F，表明該模型顯著。由模型擬合的回歸方程R2=0.998，表明此回歸方程成立。模型驗(yàn)證顯著，失擬性檢驗(yàn)不顯著，表明該方程對(duì)試驗(yàn)擬合程度較好，可以用于微波提取南沙參多糖的優(yōu)化。

表6 響應(yīng)面法試驗(yàn)?zāi)仙硡⒍嗵翘崛÷蔜ab.6 Extraction rate of polysaccharide from Adenophorae Radix by response surface method

表7 方差分析結(jié)果Tab.7 Results of variance analysis

3.7 交互作用分析與提取工藝確定

根據(jù)二次模型分析兩因素交互作用對(duì)南沙參多糖提取率的影響，結(jié)果見圖6。如圖所示，AC交互作用對(duì)南沙參多糖提取率的影響無顯著性，而AB、BC的交互作用對(duì)南沙參多糖提取率影響呈極顯著性。由多元回歸方程模型得微波提取法的最佳工藝條件為：提取時(shí)間85 min，提取火力700 W檔，提取料液比1∶35 g/mL，南沙參多糖提取率為10.50%。

圖6 兩因素交互作用對(duì)南沙參多糖提取率的影響Fig.6 Effects of interaction between two factors on extraction rate of polysaccharides from Adenophorae Radix

3.8 最佳條件驗(yàn)證試驗(yàn)

上述數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知最優(yōu)提取工藝的條件，進(jìn)行6組平行試驗(yàn)，南沙參多糖提取率為(10.486±0.791)%，實(shí)測值與預(yù)測值相差0.80%，實(shí)測值與預(yù)測值的偏差1.44%，結(jié)果較為理想(表8)。

4 討論

南沙參多糖是南沙參藥材中的主要藥效成分，現(xiàn)代研究表明，南沙參多糖具有顯著的抗衰老、抗癌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保肝及抗真菌等藥理作用[4-6]，南沙參多糖的提取效率直接影響著南沙參藥材的有效性與利用率。目前，對(duì)多糖的提取研究主要有水提醇沉、微波提取、超聲、煎煮法、回流提取與膜分離技術(shù)等方法[14-15]。

表8 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.8 Results of verification tests

據(jù)文獻(xiàn)資料查閱，王淑萍等應(yīng)用正交試驗(yàn)法對(duì)南沙參多糖分離工藝進(jìn)行了研究，張小倩等對(duì)應(yīng)用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)對(duì)南沙參多糖進(jìn)行回流提取方法及降解方法進(jìn)行了優(yōu)化研究[7-11]?！吨袊幍洹?015版中南沙參的質(zhì)量控制未涉及多糖含量檢測[2]。本研究在前期工作基礎(chǔ)上，應(yīng)用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)南沙參多糖進(jìn)行回流法、煎煮法、超聲提取法、微波提取法、超聲輔助回流提取法和微波輔助回流提取法等提取方法、料液比、提取時(shí)間、提取溫度、提取功率等因素進(jìn)行優(yōu)化，以提高南沙參多糖的提取得率。

結(jié)果顯示，在提取功率為700 W，提取時(shí)間為85 min，料液比為1∶35(g/mL)，提取次數(shù)為1次時(shí)微波提取法對(duì)南沙參多糖的提取率顯著高于其他提取方法與提取條件。當(dāng)提取功率700～900 W、提取時(shí)間超過120 min時(shí)南沙參多糖提取率均呈下降趨勢，這與張小倩等[13]的研究結(jié)果相似?？赡苁且?yàn)樘崛」β逝c提取時(shí)間的增加，較高溫度條件下，提取時(shí)間過長，南沙參多糖發(fā)生降解，而導(dǎo)致多糖提取率下降造成。

本研究豐富了南沙參藥材的研究資料，為南沙參藥材與資源的充分利用與深入研究提供了一定參考。但在本研究中未對(duì)其他提取方法開展試驗(yàn)，下一步還需應(yīng)用更先進(jìn)科學(xué)的試驗(yàn)方法，對(duì)南沙參藥材應(yīng)用現(xiàn)代HPLC法、氣相色譜法，結(jié)合藥理藥效學(xué)試驗(yàn)對(duì)南沙參進(jìn)行進(jìn)一步研究，為南沙參藥材的開發(fā)應(yīng)用提供更為全面、準(zhǔn)確、科學(xué)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。