胚胎培養(yǎng)液用于染色體篩查的初步研究

韓瑞鈺 王雪瑩 鄧佩佩 和 偉 姚冠峰 郭 薇

河北省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，國家衛(wèi)計委計劃生育與優(yōu)生重點實驗室(石家莊，050071)

胚胎染色體異常是反復(fù)著床失敗以及自然流產(chǎn)的重要原因之一，其中20%～80%的人類胚胎是染色體非整倍體[1]。通過體外受精—胚胎移植(IVF-ET)方法獲得的胚胎有40%～60%存在染色體異常，篩選染色體正常胚胎進行移植，可以提高臨床妊娠率。胚胎植入前遺傳學(xué)檢查(PGT-A)目前已廣泛應(yīng)用于IVF的胚胎篩選，很多臨床實驗已證明PGT-A的臨床有效性[2-3]，但PGT-A的安全性備受爭議，卵裂期活檢會降低胚胎質(zhì)量，探索無創(chuàng)胚胎染色體篩查(NICS)技術(shù)尤為重要。目前人類胚胎已被證明可以釋放DNA片段進入外部培養(yǎng)環(huán)境，從囊胚腔液和廢棄培養(yǎng)基中可以提取DNA，為無創(chuàng)胚胎染色體篩查技術(shù)提供了關(guān)鍵信息。已有很多研究表明利用胚胎培養(yǎng)液中游離DNA對胚胎染色體進行篩選的有效性[4-6]。本研究采集胚胎培養(yǎng)液進行胚胎染色體檢查，觀察胚胎培養(yǎng)液用于胚胎染色體篩查的檢出成功率及準確率，為無創(chuàng)胚胎染色體篩查技術(shù)的研究及應(yīng)用提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

經(jīng)患者同意后采集河北省生殖醫(yī)學(xué)中心接受輔助生殖技術(shù)受孕者的廢棄囊胚及培養(yǎng)液，胚胎培養(yǎng)液標(biāo)本86例、囊胚36枚；其中56例為卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)的胚胎培養(yǎng)液，30例為IVF-ET的胚胎培養(yǎng)液。

1.2 采集方法

經(jīng)患者同意后收集胚胎培養(yǎng)3～5d的培養(yǎng)液，為防止介質(zhì)交叉污染，每個胚胎使用不同的巴斯德吸管。前期胚胎培養(yǎng)時培養(yǎng)液加入量為20～25μl，改進方法后胚胎培養(yǎng)的培養(yǎng)液加入量10～15μl，相對提高了培養(yǎng)液中游離DNA的濃度。將來自每個胚胎的胚胎培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到含有5μl細胞裂解緩沖液的無RNase-DNase的PCR管中，-20℃保存。空白培養(yǎng)基與囊胚同條件培養(yǎng)，同樣方式收集保存。收集36例培養(yǎng)液對應(yīng)的囊胚放入含有5μl細胞裂解緩沖液的無RNase-DNase的PCR管中，-20℃保存。

1.3 胚胎培養(yǎng)液游離DNA(NICS)及囊胚(PGS)染色體檢測

采用基因測序通用文庫試劑盒ChromInstTM對囊胚進行MALBAC單細胞全基因組擴增及文庫構(gòu)建；采用基因測序通用文庫試劑盒NICSinstTM對胚胎培養(yǎng)液游離DNA進行MALBAC單細胞全基因組擴增及文庫構(gòu)建，構(gòu)建文庫在Ion Chef進行樣本的全自動處理，最終在Ion GenestudioTMS5高通量測序平臺進行測序，運用ChromGoTM2.0數(shù)據(jù)分析平臺檢測染色體非整倍體及>10M片段缺失和(或)重復(fù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

計算胚胎培養(yǎng)液染色體檢出率，運用χ2檢驗比較改進方法前后培養(yǎng)液染色體檢出率的差異；兩種受精方式收集的培養(yǎng)液檢測結(jié)果一致性及假陽性、假陰性的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NICS染色體檢出情況

86例胚胎培養(yǎng)液中27例未檢出染色體核型，方法改進后收集的標(biāo)本與前期相比，檢出成功率明顯提高(P<0.05)。見表1。

表1 方法改進前后NICS染色體檢出情況比較

2.2 PGS與NICS檢測結(jié)果對比

對36例囊胚與其培養(yǎng)液的檢測結(jié)果進行對比，IVF-ET培養(yǎng)液和其胚胎共計18例，7例染色體倍性一致，一致率38.9%(7/18)，培養(yǎng)液共檢測出非整倍體15例，9例假陽性性結(jié)果，假陽性率50%，假陰性率0%，2例樣本雖然均為整倍體結(jié)果，但是與對應(yīng)囊胚結(jié)果性別不一致，考慮顆粒細胞污染，故不計入分析結(jié)果。ICSI-ET培養(yǎng)液及其胚胎共計18例，14例染色體倍性一致，一致率77.8%(14/18)， 培養(yǎng)液共檢測出非整倍體10例，3例假陽性結(jié)果，假陽性率16.7%，1例假陰性結(jié)果，假陰性率5.6%。兩種受精方式培養(yǎng)液檢出的染色體倍性一致率(χ2=5.6，P<0.05)、非整倍體的假陽性率有統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=4.5，P<0.05)，非整倍體的假陰性率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

3 討論

自MALBAC單細胞全基因組擴增技術(shù)發(fā)現(xiàn)以后，胚胎培養(yǎng)游離DNA檢測獲得很大突破，使NICS技術(shù)成為可能。Xu等[4]對42例囊胚檢測顯示囊胚培養(yǎng)基與對應(yīng)胚胎染色體異常結(jié)果高度一致，靈敏度達0.882，特異性達0.840。Huang等[7]對無創(chuàng)植入前非整倍體檢測(niPGT)與滋養(yǎng)外胚層(TE)活檢結(jié)果進行對比，靈敏度達100%，特異性為80%，胚胎倍性和染色體拷貝數(shù)一致性均高于TE活檢。在NICS臨床應(yīng)用有效性上，Rui等[5]運用NICS技術(shù)篩選出52枚整倍體胚胎進行移植，臨床妊娠率達58%，27個出生孩子染色體均正常，證明NICS可以在一定程度上反映胚胎染色體情況。

本研究中前期收集胚胎培養(yǎng)液中染色體檢出率僅有41.7%，經(jīng)過對胚胎培養(yǎng)時培養(yǎng)液加入量進行調(diào)整，增加了培養(yǎng)液中游離DNA的濃度，后期樣本擴增率高達88.0%。說明胚胎培養(yǎng)液體積對檢測結(jié)果有很大影響，目前較多研究均對胚胎培養(yǎng)液與囊胚染色體檢測結(jié)果染色體倍體一致率進行了對比研究，Xu等[8]的研究中胚胎培養(yǎng)液與整胚染色體檢測結(jié)果染色體倍體一致率達87.7%；Liu等[9]的研究中胚胎培養(yǎng)液與胚胎卵裂球活檢檢測結(jié)果染色體倍體一致率達64.5%；Li等[10]的研究中胚胎培養(yǎng)液與整胚染色體檢測結(jié)果染色體倍體一致率50.0%。本研究顯示ICSI-ET和IVF-ET兩種方式培養(yǎng)染色體倍體一致率分別為77.8%和38.9%，可能與這兩種體外受精方式也有一定的關(guān)系。，胚胎培養(yǎng)液中游離DNA來源于胚胎發(fā)育過程中凋亡細胞，由于含量極微，檢測過程中很可能會受到污染，比如卵丘細胞的污染，以及未消除精子的污染，這要求在胚胎受精過程中必須采用一些措施避免污染。胚胎培養(yǎng)液游離DNA檢測另外一個難點是DNA含量太低導(dǎo)致擴增失敗或者染色體嵌合增多而出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，這就要求對培養(yǎng)的階段和時間進行摸索，這一過程仍然需要大量樣本的測試和收集。

本研究結(jié)果顯示ICSI-ET培養(yǎng)倍體一致率明顯高于IVF-ET，說明ICSI-ET方式培養(yǎng)的胚胎培養(yǎng)液用于游離DNA檢測優(yōu)于IVF-ET；IVF-ET培養(yǎng)液檢測假陽性率高達50%，可能是受精方式導(dǎo)致培養(yǎng)液受精子及卵丘細胞的污染可能性較高。因此，認為ICSI-ET胚胎培養(yǎng)液更適用于胚胎染色體篩查。目前少見ICSI-ET和IVF-ET 培養(yǎng)液檢測胚胎染色體倍體一致率對比文章。

綜上所述，收集的胚胎培養(yǎng)液用于胚胎染色體檢測ICSI-ET優(yōu)于IVF-ET，對培養(yǎng)液量進行調(diào)整，增加游離DNA濃度明顯提高了擴增成功率。之后研究中應(yīng)該更加關(guān)注增加培養(yǎng)液中游離DNA的濃度、消除卵丘細胞污染等方面，建立更加完善的培養(yǎng)流程，保證培養(yǎng)液用于胚胎染色體檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和準確性。