豬肌內(nèi)脂肪沉積關(guān)鍵基因的表達分析

劉 娟，馬藝珈，王 舒，路 暢，楊 陽，蔡春波，趙 燕，郭曉紅，曹果清，李步高，高鵬飛

(山西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，山西 太谷 030801)

隨著生活和消費水平的提高，營養(yǎng)、綠色的肉品成為人們新的追求[1]。這對養(yǎng)殖業(yè)提出新的挑戰(zhàn)，風味獨特、瘦肉率高、脂肪含量低、嫩度高等成為肉質(zhì)研究的主題。肌內(nèi)脂肪是形成肉質(zhì)風味的重要物質(zhì)，其脂肪酸組成影響著肉類營養(yǎng)和感官品質(zhì)指標[2]。單不飽和脂肪酸的氧化穩(wěn)定性比多不飽和脂肪酸強，能使肉的口感和色澤更好[3]，而多不飽和脂肪酸可以降低人們患心血管疾病的風險[4]。因此，為了提高豬肉品質(zhì)，研究出人們追求的綠色豬肉，了解脂肪酸代謝機制非常必要。

脂肪酸代謝機制一直是國內(nèi)外科學家的研究熱點。研究表明過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome Proliferatorsactivated Receptors γ，PPARγ) 和核 呼 吸 因 子-1(Nuclear Respiratory Factor-1，NRF-1)或核呼吸因子-2(Nuclear Respiratory Factor-2，NRF-2) 能 夠 提高骨骼肌中脂肪酸引起的解偶聯(lián)蛋白1(Uncoupling Protein 1，UCP1)的轉(zhuǎn)錄[5]。研究發(fā)現(xiàn)長鏈?；o酶A 合成酶1(Acyl-CoA Synthetase 1，ACSL1) 作為線粒體內(nèi)脂肪酸氧化代謝的關(guān)鍵酶，能分解棕色脂肪細胞中的甘油三酯，產(chǎn)生的脂肪酸在?；o酶A 的作用下進入線粒體內(nèi)氧化，激活細胞內(nèi)的脂肪酸代謝，同時調(diào)節(jié)脂肪酸攝取[6]，增加油酸的攝入，提高不飽和脂肪酸的沉積量[7-8]。Lourdes 等發(fā)現(xiàn)胰島素生長因子2(Insulin Growth Factor 2，IGF2)在不同豬品種間存在g.3072G ＞A 突變，突變后該基因表達增加，導致多不飽和脂肪酸升高，單不飽和脂肪酸降低，從而影響脂肪酸組成[9]。Dragos 等以硬脂酰輔酶A 去飽和酶1 (Stearoyl-CoA Desaturase 1，SCD1)基因敲除小鼠為研究對象，分析SCD1 在脂肪酸代謝過程中的作用，發(fā)現(xiàn)SCD1 能夠減少小鼠白色脂肪組織中脂肪酸再酯化，影響甘油生成和脂肪分解[10]。肝臟型肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1(Carnitine Palmitoyl Transferase 1，CPT1A)是長鏈脂肪酸β 氧化的限速酶，可以催化長鏈脂肪酸從?；o酶A轉(zhuǎn)化為酰基肉毒堿，使長鏈脂肪酸進入線粒體內(nèi)氧化[11]，加速脂肪酸分解，減少體內(nèi)脂肪含量[12]。

研究團隊前期分析發(fā)現(xiàn)ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7、NDUFV1 和PSTPIP2 在豬脂肪酸代謝中具有重要作用[13]。本研究以大白豬和馬身豬為研究對象，利用qRT-PCR 技術(shù)分析6 個基因在豬肌肉發(fā)育過程中的表達變化及組織表達譜，基于這6 個基因的氨基酸序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，初步分析這6 個基因在豬脂肪酸代謝過程中的表達規(guī)律和作用，為豬脂肪酸代謝的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

于1 日齡、30 日齡、60 日齡、90 日齡、120 日齡、150 日齡和180 日齡分別隨機選擇3 頭體重相近的馬身豬和大白豬，采集心、肝、脾、腎、脂肪、小腸、背最長肌和股二頭肌，于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑

TRIzol Reagent (Life Technologies公 司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green RT-PCR 試劑盒(TaKaRa 公司)；乙醇、氯仿、異丙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計和合成

參考GenBank數(shù)據(jù)庫中豬ATP5A1(N M _ 0 0 1 1 8 5 1 4 2 .1)、N D U F A B1(NM_001167652.1)、CPOX(NM_001243844.1)、N D U F B7(X M_0 0 3 4 8 0 7 7 5.4)、N D U F V1(X M _ 0 0 3 1 2 2 4 3 8 .5)、P S T P I P2(X M_0 2 1 0 9 2 5 3 3.1) 和 1 8 S r R N A(NW_018085108.1) 序 列，其 中18S rRNA 為內(nèi)參基因。使用Primer Premier 5.0 設(shè)計引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

1.2.2 總RNA 提取和cDNA 合成

TRIzol Reagent 提 取 總RNA 后，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用核酸蛋白測定儀(ND-2000，Nanodrop，USA) 測 定 總RNA 的 純度和濃度。將得到的RNA 通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，－20 ℃保存。

1.2.3 qRT-PCR 檢測基因表達

采用qRT-PCR 檢測6 個基因表達，每個樣本設(shè)3 個重復，反應(yīng)程序如下：預變性階段，95 ℃ 30 s；循環(huán)階段，95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，45 個循環(huán)；溶解階段，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI 數(shù) 據(jù) 庫(http：//plants.ensembl.org/index.html)獲取9 個物種(豬、山羊、牛、人、獼猴、雞、綠頭鴨、大鼠、小鼠)ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7、NDUFV1和PSTPIP2 的氨基酸序列。使用Clustal W 2.0(http://www.clustal.org/clustal2/)[14]將6 個基因的氨基酸序列進行比對。利用MEGA 7.0(https://www.megasoftware.net/) 的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，使用Bootstrap 法進行1 000 次可信度檢測。

1.2.5 統(tǒng)計分析

運用SPSS 22.0 軟件進行基因表達差異分析，采用t檢驗分析基因在不同日齡間的表達差異，單因素方差分析基因在不同組織中的表達差異，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 基因在不同日齡的表達分析

在馬身豬中，ATP5A1、NDUFAB1、CPOX和NDUFB7 在1 日齡表達量最高，90 日齡表達量逐漸降低；NDUFV1 和PSTPIP2 在1 日齡表達量最低，NDUFV1 在180 日齡表達量最高，PSTPIP2在120 日齡表達量最高，180 日齡有降低的趨勢。在大白豬中，ATP5A1 和NDUFV1 在1 日齡時表達量最高，然后逐漸降低，180 日齡表達量最低；NDUFAB1、CPOX和NDUFB7 在1 日齡表達量最高，90 日齡表達量最低，180 日齡表達量有升高趨勢；PSTPIP2 在1 日齡表達量最低，隨著日齡增長表達量逐漸升高，180 日齡表達量最高。見圖1。

兩品種間比較發(fā)現(xiàn)，大白豬ATP5A1 的表達量在30 日齡和60 日齡顯著高于馬身豬，在120 日齡、150 日齡和180 日齡極顯著低于馬身豬；馬身豬NDUFAB1 的表達量在30 日齡顯著高于大白豬，在120 日齡、150 日齡和180 日齡極顯著低于大白豬；大白豬CPOX和NDUFB7 的表達量在120 日齡、150 日齡和180 日齡極顯著高于馬身豬；NDUFV1 的表達量在各個日齡(不包括90 日齡) 均有差異，大白豬在1 日齡、30 日齡和60 日齡較高，馬身豬在120 日齡、150 日齡和180 日齡較高；大白豬PSTPIP2 的表達量在60 日齡、120 日齡和180 日齡顯著高于馬身豬，在150 日齡極顯著高于馬身豬。

2.2 基因在不同組織的表達分析

6 個基因在馬身豬不同組織中均有表達，在脂肪中的表達量均極顯著高于其他組織。ATP5A1、NDUFV1、NDUFAB1 和NDUFB7 在肝和脾中的表達量僅次于脂肪，接下來是小腸、腎和肌肉，在心臟中的表達量最低；CPOX在肌肉中的表達量僅次于脂肪，接下來是脾、心、小腸和腎，在肝中的表達量最低；PSTPIP2 在肝、腎、心臟中的表達量極顯著低于脂肪，脾臟中的表達量極顯著低于肌肉。見圖2。

2.3 豬與其他物種進化樹的構(gòu)建

將豬6 個基因的氨基酸序列與其他物種比較發(fā)現(xiàn)(表2)，6 個基因均較保守，豬與山羊、牛的同源性最高，為99.95%，與人的同源性為99.94%，與獼猴的同源性為99.93%，與雞和綠頭鴨的同源性最低，為99.8%。

根據(jù)6 個基因氨基酸序列在不同物種之間的同源性比較結(jié)果構(gòu)建進化樹。如圖3 顯示，聚類數(shù)主要分為4 個分支，其中山羊和牛組成反芻動物分支，再和豬聚在一起，人和獼猴組成靈長類分支，大鼠和小鼠組成嚙齒類動物分支，最后雞和綠頭鴨組成禽類分支。禽類分支與其他分支距離最遠。豬6 個基因的氨基酸序列與牛和山羊的親緣關(guān)系較近，其次是人和獼猴，親緣關(guān)系最遠的是綠頭鴨和雞。

3 討論

肌內(nèi)脂肪含量和脂肪酸組成可直接影響豬肉品質(zhì)，尤其是肉的風味、嫩度、多汁性和營養(yǎng)價值。脂肪酸是肌內(nèi)脂肪的物質(zhì)前提，肉質(zhì)是脂肪酸和肌內(nèi)脂肪的體現(xiàn)。在脂肪酸中，飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸有較好的感官特性和工藝特性，主要影響肉質(zhì)風味，而多不飽和脂肪酸具有較好的營養(yǎng)特性，影響肉質(zhì)的營養(yǎng)價值[15]。油酸(C18 ∶1) 是豬肉中含量最豐富的脂肪酸，可以作為改善豬肉感官和營養(yǎng)特性的重要指標[16]。

研究團隊根據(jù)前期的轉(zhuǎn)錄組測序分析獲得了一系列影響肌肉中脂肪酸代謝的基因，其中ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7、NDUFV1和PSTPIP2 在不同類型豬肌內(nèi)脂肪中的表達量差異最顯著[13]。ATP5A1 是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，經(jīng)常用作線粒體復合物的標記。線粒體中的二肽重復蛋白Poly(GR) 通過泛素-蛋白酶體途徑增加了ATP5A1 的泛素化及其降解[17]。楊素麗等利用免疫組化方法檢測發(fā)現(xiàn)大腸癌中的ATP5A1 比相應(yīng)癌旁組織的明顯上調(diào)[18]。其他研究還驗證了ATP5A1 在腫瘤發(fā)病機制中起重要作用，可能通過調(diào)節(jié)腫瘤磷酸化與人類透明細胞腎細胞癌的發(fā)展相關(guān)聯(lián)[19]。NDUFAB1作為線粒體代謝的新型增強劑，通過協(xié)同增強線粒體脂肪酸合成途徑介導脂酰化和丙酮酸脫氫酶的活化，增加呼吸復合體和超復合體的組裝，防止脂肪沉積過高而導致肥胖和胰島素抵抗[20]。CPOX蛋白包含許多還原的硫醇殘基，可催化血紅素生物合成途徑中的卟啉原-Ⅲ向原卟啉原-Ⅸ的兩步脫羧反應(yīng)，CPOX4 缺失可導致血紅素生物合成受損[21]。NDUFB7 位于泛醌氧化還原酶復合物Ⅰ的膜間表面[22]，在線粒體活動供能方面起重要作用。NDUFV1 和NDUFV2 是涉及氧化應(yīng)激和ATP 產(chǎn)生的兩個重要亞基[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，NDUFV1 可為母豬腹中胎兒發(fā)育提供能量[24]。PSTPIP2 是一種與自身炎性疾病相關(guān)的蛋白，它參與巨噬細胞的活化、嗜中性粒細胞的運動和破骨細胞的分化等[25]。

Linn 等對來自95 個人的27 個不同組織樣本進行RNA 測序發(fā)現(xiàn)，ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7 在心臟、腎、脂肪等組織中均有表達，其中ATP5A1、NDUFAB1 在心臟中的表達量最高，CPOX在骨髓中的表達量最高，NDUFB7 在脂肪中的表達量最高[26]。本研究中，ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7 在兩個品種豬的不同日齡均有表達，且隨著日齡增長表達量逐漸降低，在發(fā)育初期表達量較高。ATP5A1、NDUFAB1、CPOX、NDUFB7 在 脂 肪 中的相對表達量極顯著高于其他組織，表明4 個基因可能在豬發(fā)育初期的脂肪酸代謝過程中有重要作用，可為仔豬生長發(fā)育提供能量。Linn 等發(fā)現(xiàn)，NDUFV1 在人類25 個組織中均有表達，在心臟中表達量最高[26]。本研究中，NDUFV1 在脂肪中的相對表達量極顯著高于其他組織，表明在豬的發(fā)育過程中NDUFV1 能夠促進脂肪沉積。PSTPIP2 在人類17 個組織中均有表達，其中在骨髓中的表達量最高[26]。本研究也發(fā)現(xiàn)PSTPIP2 在脂肪中的相對表達量最高，提示PSTPIP2 可能在豬的發(fā)育后期對脂肪沉積起作用。

本研究對影響豬肌內(nèi)脂肪沉積與脂肪酸組成關(guān)鍵基因的表達特征進行分析，初步證明這些基因通過影響肌肉中脂肪酸的合成代謝可為機體提供能量，進而影響豬肉品質(zhì)。本研究結(jié)果可為深入研究豬脂肪酸代謝機制提供理論依據(jù)，為探索豬脂肪酸對肉質(zhì)性狀影響提供參考。

參考文獻：(26 篇，略)