靶向共價(jià)閉合環(huán)狀DNA抗HBV治療的研究進(jìn)展

王藝穎，劉熙稱，樸榮利，秦俊杰

吉林大學(xué)第一醫(yī)院 肝病科，長春 130000

HBV感染已成為全球嚴(yán)重衛(wèi)生問題，全球慢性乙型肝炎(CHB)患者已達(dá)2.57億，其顯著增加肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌的罹患風(fēng)險(xiǎn)。2017年全球肝炎報(bào)告顯示，每年約有65萬人死于HBV感染，給人們乃至社會帶來了沉重負(fù)擔(dān)[1]。1965年由Blumberg等[2]發(fā)現(xiàn)的HBV，隨后被證實(shí)為一種具有內(nèi)源性DNA聚合酶活性的DNA病毒。1982年，Summers等[3]研究發(fā)現(xiàn)HBV聚合酶將RNA中間體逆轉(zhuǎn)錄為不完整且松弛的環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)，這一環(huán)狀DNA隨后轉(zhuǎn)化為共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，形成病毒轉(zhuǎn)錄的模板，并居于宿主細(xì)胞核中。這些突破性的發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了HBV分子生物學(xué)時(shí)代，重組HBV疫苗的開發(fā)隨之拉開序幕。據(jù)報(bào)道[1,4]，世界范圍內(nèi)的預(yù)防性疫苗接種計(jì)劃已明顯降低5歲以下兒童的HBV患病率。當(dāng)前用于HBV感染的標(biāo)準(zhǔn)療法包括聚乙二醇化干擾素α和核苷酸類藥物(NAs)[5]。自1998年以來，已經(jīng)批準(zhǔn)了6種NAs應(yīng)用于臨床實(shí)踐中，包括拉米夫定、恩替卡韋、替比夫定、阿德福韋酯及替諾福韋[6],但所面臨的巨大考驗(yàn)也不容忽視：首先，IFNα對cccDNA轉(zhuǎn)錄的長期和可持續(xù)抑制具有重要作用，但干擾素的應(yīng)答率欠佳；其次，NAs可以通過靶向病毒RNA依賴性DNA聚合酶來抑制HBV復(fù)制，但對現(xiàn)有的cccDNA微染色體沒有直接影響，NAs終止后常見病毒復(fù)發(fā)，甚至在達(dá)到治療終點(diǎn)的患者中亦如此[7]。盡管使用IFNα和NAs已觀察到有效的抗病毒應(yīng)答，但目前仍無法完全清除cccDNA，為徹底治愈HBV感染，迫切需要根除肝內(nèi)cccDNA的新治療策略[8-10]。本文對關(guān)于cccDNA的當(dāng)前知識及其作為治療靶標(biāo)的潛在作用作一綜述,旨在探索消除病毒cccDNA潛在治療策略的前景及曙光。

1 HBV的身世之謎

1.1 HBV的生命周期——cccDNA的持續(xù)性 肝細(xì)胞是HBV易感染的靶細(xì)胞之一，HBV通過血液到達(dá)肝臟感染肝細(xì)胞。HBV與位于宿主肝細(xì)胞上的硫酸肝素蛋白聚糖相互作用，?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)與之結(jié)合進(jìn)入肝細(xì)胞[6](圖1步驟-1),隨后帶有rcDNA的核衣殼(圖1步驟-2)被釋放到細(xì)胞質(zhì)中并進(jìn)入細(xì)胞核,進(jìn)入核內(nèi)的rcDNA利用宿主DNA修復(fù)機(jī)制轉(zhuǎn)化為高度穩(wěn)定的游離DNA，即cccDNA[11-12](圖1步驟-3)。cccDNA被轉(zhuǎn)錄為HBV前基因組RNA(pregenomicRNA，pgRNA)和幾個(gè)亞基因組RNA[13](圖1步驟-4)。HBV DNA整合感染肝細(xì)胞后立即進(jìn)入宿主基因組[14]。完成轉(zhuǎn)錄和翻譯后(圖1步驟-5)，pgRNA被包裝并組裝在核衣殼中(圖1步驟-6)，并被轉(zhuǎn)錄成松弛的環(huán)狀DNA(圖1步驟-7)，最后成熟的衣殼，即含有rcDNA的衣殼，可以通過細(xì)胞分泌途徑，并以包膜和感染性病毒體的形式釋放[15]。重要的是，細(xì)胞內(nèi)成熟衣殼中新形成的后代rcDNA(圖1步驟-8)，如來自傳入病毒體的rcDNA，也可以被遞送至宿主細(xì)胞核并啟動額外cccDNA分子的形成，從而有助于病毒的持久性[7,16]。

圖1 HBV復(fù)制周期示意圖[4,17-18]

1.2 HBV的基因組信息 HBV基因組呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，含內(nèi)部核衣殼核心的外部脂蛋白包裹部分雙鏈的DNA[16]。 HBV DNA長度僅為3.2 kb，包含4個(gè)重疊的開放閱讀框，分別為S、C、P和X。cccDNA纏繞在組蛋白上形成病毒微染色體，是所有病毒RNA轉(zhuǎn)錄物(pg、preS、S和X)編碼七種蛋白質(zhì)的獨(dú)特模板(圖1步驟-5)：pgRNA充當(dāng)病毒聚合酶介導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄和rcDNA后續(xù)合成的模板；HBcAg是另一種基因產(chǎn)物核心蛋白，它參與病毒核衣殼的構(gòu)成；此外前核心蛋白(HBeAg)是一種蛋白水解加工的病毒蛋白。HBsAg是所有不同長度的表面蛋白的統(tǒng)稱,其中包括病毒表面蛋白S、M和L(其中S從S mRNA進(jìn)行翻譯,M從preS2+ S mRNA進(jìn)行翻譯,L從preS1+PreS2+S mRNA進(jìn)行翻譯)。最后,cccDNA還編碼一種非結(jié)構(gòu)蛋白即病毒蛋白X(HBV regulatory X，HBx)，可能起轉(zhuǎn)錄反式激活因子的作用，并在調(diào)節(jié)病毒基因表達(dá)中發(fā)揮作用。

據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，HBV DNA也可整合到宿主染色體中。病毒DNA的整合似乎在病毒復(fù)制的過程中并沒有發(fā)揮直接作用，但有報(bào)道[14]發(fā)現(xiàn),HBV DNA整合可能通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)使細(xì)胞環(huán)境更易于病毒復(fù)制，可能在肝細(xì)胞癌變中起重要作用。目前有關(guān)cccDNA的大多數(shù)知識都來自于鴨DHBV模型，cccDNA研究的主要障礙之一是缺乏可靠的、可量化的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)無法生成真正的HBV cccDNA。有研究[19]發(fā)現(xiàn)HepG2-HBV/loxP細(xì)胞系統(tǒng)在研究cccDNA相關(guān)生物學(xué)機(jī)制和開發(fā)新型cccDNA靶向藥物方面具有強(qiáng)大的潛力。

2 消除cccDNA的新策略

目前使用NAs的抗病毒療法靶向病毒聚合酶并抑制逆轉(zhuǎn)錄。它們阻止病毒基因組rcDNA的合成，以防止成熟衣殼的形成和傳染性子代病毒的釋放，從而通過細(xì)胞內(nèi)cccDNA擴(kuò)增來減少cccDNA的補(bǔ)充。但是，NAs不能靶向已建立的cccDNA，因此不能治愈慢性HBV感染。

2.1 基于DNA損傷修復(fù)機(jī)制的設(shè)想 宿主細(xì)胞DNA損傷修復(fù)機(jī)制將rcDNA識別為損傷的DNA，并介導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為cccDNA[20]。近年來有報(bào)道[21]稱,酪氨酰DNA磷酸二酯酶2(Tyrosyl DNA phosphodiesterase 2 )及FEN1(flap structure-specific endonuclease 1)，在cccDNA形成的過程中扮演重要角色，除了進(jìn)行實(shí)際的DNA修復(fù)反應(yīng)以從rcDNA形成HBV cccDNA的酶促機(jī)制外，其他包括調(diào)節(jié)HBc磷酸化狀態(tài)以及衣殼核導(dǎo)入和脫殼的宿主蛋白激酶與磷酸酶等宿主因素，可能也參與控制cccDNA的形成。但是，由于迄今確定的與cccDNA形成有關(guān)的宿主因子也與許多基本細(xì)胞過程有關(guān)，考慮到潛在的嚴(yán)重副作用，它們似乎不太可能作為治療靶標(biāo)[7]。

在細(xì)胞核中，與cccDNA微型染色體結(jié)合的HBx蛋白可在表觀遺傳上發(fā)揮其影響，同時(shí)啟動并維持cccDNA的轉(zhuǎn)錄。HBx參與DNA修復(fù)途徑，宿主蛋白損傷特異性DNA結(jié)合蛋白1(damage-specific DNA-binding protein 1,DDB1)與其結(jié)合,對于病毒復(fù)制尤為重要[22]，通過募集含有DDB1的E3泛素連接酶以降解宿主限制因子SMC5/6(structural maintenance of chromosomes 5/6)，以允許cccDNA進(jìn)行HBV轉(zhuǎn)錄，否則將被轉(zhuǎn)錄抑制[5]。鑒于其在HBV生命周期中的重要作用，除了影響表觀遺傳轉(zhuǎn)錄并刺激眾多細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑外，靶向HBx成為一種可行的治療策略。硝唑尼特[2-乙酰氧基-N-(5-硝基-2-噻唑基)苯甲酰胺]是一種口服的噻唑類抗感染藥。Sekiba等[23]通過化合物篩選用于藥物重新定位的方法發(fā)現(xiàn)硝唑尼特顯著抑制HBx-DDB1相互作用，從而抑制了病毒轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)表達(dá)和cccDNA水平，為HBV提供新的治療選擇。

2.2 通過基因編輯技術(shù)沉默cccDNA表達(dá) 鋅指核酸酶(zinc fingernucleases，ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)和成簇的規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列/CRISPR相關(guān)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated Cas9 nucleases，CRISPR/Cas9)系統(tǒng)等基因組編輯技術(shù)可以有效地破壞HBV cccDNA[24-27]。DNA將來自四種不同物種的CRISPR/Cas9系統(tǒng)與靶向HBV基因組保守區(qū)域的指導(dǎo)RNA在細(xì)胞系中共表達(dá)，發(fā)現(xiàn)源于化膿性鏈球菌(streptococcus pyogenes，Sp)和嗜熱鏈球菌(streptococcus thermophilus，St)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過靶向HBV基因組的保守區(qū)域，從而阻斷了HBV復(fù)制，同時(shí)超過90%的HBV cccDNA轉(zhuǎn)染6 d后被降解。研究發(fā)現(xiàn)HBV cccDNA甲基化影響CRISPR/Cas9的抗病毒活性，而單核苷酸HBV遺傳變異不會影響St CRISPR/Cas9的抗HBV活性，表明其可用于靶向許多HBV變異。而兩個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配會破壞或阻斷CRISPR/Cas9活性，使其宿主DNA不太可能成為靶向。最重要的是，深度測序表明Sp CRISPR/Cas9引起脫靶誘變，而St CRISPR/Cas9對宿主基因組沒有影響，St CRISPR/Cas9系統(tǒng)代表了具有高抗HBV活性的最安全的系統(tǒng)[28]。

ZFN作為一種DNA核酸內(nèi)切酶，具有基因組編輯潛能，可用于在特定的靶位點(diǎn)介導(dǎo)DNA雙鏈發(fā)生斷裂反應(yīng)，并在裂解位點(diǎn)處產(chǎn)生序列改變而發(fā)揮修復(fù)作用[24]。Weber等[29]設(shè)計(jì)了3種靶向HBV聚合酶，基因X和核心的ZFN，并分別通過自身互補(bǔ)的腺相關(guān)病毒載體將其分別導(dǎo)入HepAD38細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這些針對HBV的ZFN可以有效抑制HBV主動復(fù)制，并抑制HBV持久性的細(xì)胞模板。TALEN與ZFN相似，但TALEN的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是高度重復(fù)的，并且源自轉(zhuǎn)錄激活因子樣III效應(yīng)子。2013年發(fā)現(xiàn)TALEN可以降低細(xì)胞培養(yǎng)物中HBV產(chǎn)生的效率[30]。隨后研究人員使用TALEN介導(dǎo)的同源性定向重組將人工初級miRNA引入HBV基因組可以提高TALEN的抗病毒效力[31]。

2.3 通過表觀遺傳修飾沉默cccDNA轉(zhuǎn)錄 表觀遺傳學(xué)研究的重點(diǎn)是基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA干擾等。HBV cccDNA以組蛋白修飾的微染色體的多個(gè)拷貝形式存在于細(xì)胞核中，因此所有這些調(diào)節(jié)機(jī)制都會影響HBV復(fù)制和持續(xù)感染[6]。IFNα通過募集組蛋白脫乙?；?(histone deacetylase 1，HDAC1)減少與cccDNA結(jié)合的乙?；M蛋白H3來降低HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄活性[32]。shRNA(short hairpin RNA)可以誘導(dǎo)HBV cccDNA甲基化，從而抑制其在人肝癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄[33]。NIRF(Np95/ICBP90-like RING finger protei)一種新型的E3泛素連接酶，可使轉(zhuǎn)染了pAAV-HBV1.3的HepG2細(xì)胞中的HBV DNA復(fù)制，HBsAg和HBeAg的分泌受到抑制作用。此外，NIRF還能對表達(dá)HBV的小鼠模型中HBV的復(fù)制和分泌起到抑制作用。NIRF減少HBV cccDNA結(jié)合的H3組蛋白的乙酰化。這些結(jié)果表明，不僅可以通過與HBc直接相互作用抑制HBV復(fù)制，還能減少與H3組蛋白的乙酰化[34]。姜黃素可通過下調(diào)cccDNA結(jié)合的組蛋白乙酰化來抑制HBV復(fù)制[35]。沉默類視黃醇X受體α?xí)?dǎo)致cccDNA形成和病毒抗原產(chǎn)生升高，而它的激活會降低HBV感染效率[36]。DNA甲基化和組蛋白乙?；莄ccDNA形成所必需的，這些共同的發(fā)現(xiàn)表明，對其調(diào)控可使cccDNA轉(zhuǎn)錄失活，從而抑制HBV復(fù)制[6]。Yuan等[37]的研究進(jìn)一步表明組蛋白脫乙?；?1特異性降低了cccDNA結(jié)合的組蛋白H3的乙?；剑ㄟ^cccDNA轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳抑制作用來阻斷HBV復(fù)制，為抗HBV藥物的開發(fā)提供了重要參考。

3 未來展望

經(jīng)過幾代人的努力，在HBV的各個(gè)方面都取得了不容忽視的進(jìn)步，不僅發(fā)現(xiàn)了可以有效抑制病毒復(fù)制的預(yù)防性疫苗和抗病毒藥物，并且?guī)追N新穎的抗HBV治療藥物正在臨床前開發(fā)或早期臨床試驗(yàn)中[7,38](表1)。但完全消除核cccDNA仍遙遙無期，主要的努力仍然是致力于開發(fā)能夠清除或沉默HBV cccDNA的有限療法[39]?；蚓庉嫷倪M(jìn)展，特別是CRISPR-Cas9技術(shù)，這是唯一已知能破壞先前存在的cccDNA，但脫靶和體內(nèi)遞送方法等問題仍面臨著巨大考驗(yàn)。盡管基于基因編輯和基于表觀遺傳修飾的策略都需要克服挑戰(zhàn)，并且從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用還有很長的路要走，但卻已顯示出光明的前景。

表1 新研發(fā)的抗HBV感染的代表藥物

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王藝穎負(fù)責(zé)資料分析、撰寫論文；劉熙稱負(fù)責(zé)收集數(shù)據(jù)，修改論文；樸榮利負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)、擬定寫作思路；秦俊杰負(fù)責(zé)撰寫文章并最后定稿。