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    HBV相關(guān)慢性肝病患者血清原卟啉Ⅸ檢測的臨床意義

    2021-05-17 09:56:00成若晨劉凱歌
    臨床肝膽病雜志 2021年5期
    關(guān)鍵詞:血紅素肝病肝細(xì)胞

    張 瓔,成若晨,郭 蕊,王 霞,劉凱歌

    1 西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 康復(fù)醫(yī)學(xué)科,西安 710038; 2 西安醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院1625班,西安 710068;3 咸陽市中心醫(yī)院 老年病科,陜西 咸陽 712000; 4 西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科,西安 710077

    慢性乙型肝炎(CHB)是常見的慢性、進(jìn)行性肝病,其發(fā)病率高,CHB可進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化(LC)甚至肝細(xì)胞癌(HCC)。我國LC和HCC 患者由HBV所致者分別為77%和84%[1],死亡率高。因此,延緩及阻斷肝病進(jìn)展對改善預(yù)后至關(guān)重要,其關(guān)鍵是肝損傷的早期預(yù)警、評估及治療。目前各臨床檢測指標(biāo)均有一定的局限性,進(jìn)一步尋找新的指標(biāo)具有重要意義。原卟啉Ⅸ(protoporphyrins Ⅸ,PPⅨ)是血紅素生物合成途徑的最終中間體,其水平變化與肝臟疾病關(guān)系密切[2]。本研究擬通過探討PPⅨ檢測在HBV相關(guān)慢性肝病患者肝損傷中的價(jià)值,以期為HBV相關(guān)慢性肝病的診治提供借鑒。

    1 資料與方法

    1.1 研究對象 本研究病例組為2018年10月—2019年10月就診于西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院診斷為HBV相關(guān)慢性肝病患者110例,其中CHB患者50例,LC患者40例,HCC患者20例。CHB患者根據(jù)轉(zhuǎn)氨酶是否升高進(jìn)一步分為靜止期(轉(zhuǎn)氨酶正常)與活動(dòng)期(轉(zhuǎn)氨酶升高),LC患者根據(jù)Child-Pugh評分分為代償期(Child-Pugh A級)與失代償期(Child-Pugh B、C級)。納入標(biāo)準(zhǔn):參照《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[3]。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)原發(fā)性卟啉病、繼發(fā)性卟啉病非肝臟因素(如鉛中毒、巴比妥、磺胺、卡馬西平及其他非甾體類抗炎藥、雌激素等導(dǎo)致者;(2)合并嚴(yán)重心、腦、腎、肺、血液、內(nèi)分泌等原發(fā)疾病者;(3)非HBV感染的慢性肝病,如非酒精性脂肪肝、酒精性肝病、藥物性肝炎、丙型肝炎、自身免疫性肝病、血吸蟲性肝病等;(4)系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征等自身免疫性疾病。對照組為同一時(shí)期在本院健康體檢人群40例,經(jīng)檢查均無HBV感染,肝功能均在正常范圍,也無其他疾病。

    1.2 檢測項(xiàng)目及方法

    1.2.1 常規(guī)檢查 常規(guī)檢查均在本院完成,包括HBV血清標(biāo)志物(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc)、HBV DNA定量、AFP、血常規(guī)、肝功能、凝血功能等指標(biāo)。肝膽胰脾彩超、FibroScan、腹部CT、胃十二指腸鏡等檢查均由操作熟練、經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師完成。

    1.2.2 血清PPⅨ檢測 血清樣品來自于西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,禁食、禁水12 h后,清晨空腹采集5 ml外周靜脈血避光離心,取上清液分裝于1.5 ml避光EP管中-80 ℃凍存。采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測血清PPⅨ,在西安醫(yī)學(xué)院藥物分析測試中心完成。

    (1)主要儀器及試劑:安捷倫1260 HPLC儀、配套二元泵、熒光檢測器以及數(shù)據(jù)處理軟件工作站(Agilent,美國)。PPⅨ標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司)。

    (2)色譜條件:美國Agilent 5 TC-C18色譜柱(250×4.6 mm,5 μm),柱溫30 ℃;流動(dòng)相 A純凈水(含0.5%冰乙酸),B甲醇∶乙腈∶DMF=45∶45∶10,以B∶A=95∶5等度洗脫。流速1 ml/min,激發(fā)波長400 nm,發(fā)射波長630 nm,增益16。

    (3)PPⅨ標(biāo)準(zhǔn)品混合液配置:精密稱取PPⅨ標(biāo)準(zhǔn)品1 mg溶于1 ml DMF溶液中配置濃度為1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液,再逐級稀釋至濃度分別為100、70、30、10、7、3、1 ng/dl,作為實(shí)驗(yàn)中測定血清中PPⅨ的校正集。

    (4)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:按上述色譜條件及稀釋濃度進(jìn)行分析,每次進(jìn)樣20 μl,連續(xù)進(jìn)樣3次取平均峰面積為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(ng/dl),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.246 4X+0.308 6,R2=0.999 8,最低檢測濃度0.1 ng/dl,標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測范圍:1~100 ng/dl。

    (5)血樣處理及檢測:解凍血漿樣品300 μl加700 μl甲醇定容至1 ml,震蕩,高速冷凍離心后取上清液進(jìn)行含量測定,每份樣品進(jìn)樣3次取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算被檢者血清PPⅨ。HPLC法檢測PPⅨ標(biāo)品、血樣出峰圖像如下(圖1)。

    注:a,原卟啉Ⅸ標(biāo)準(zhǔn)品;b,對照組;c,病例組。

    1.3 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批,批號:XYYFY2021LSK-002,所有研究對象均簽署知情同意書。

    2 結(jié)果

    2.1 基本資料的比較 CHB組、LC組、HCC組與對照組在性別、年齡上比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表1)。

    表1 患者基本資料的比較

    2.2 各組血清PPⅨ檢測結(jié)果 (1)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)顯示,CHB、LC、HCC 3組肝病患者血清PPⅨ顯著高于對照組[44.29(25.99~85.36)ng/dl、72.73(48.28~90.43)ng/dl、91.79(68.34~121.52)ng/dl vs 15.43(10.87~20.16)ng/dl],差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。HCC組較CHB、LC組PPⅨ顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(圖2)。(2)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)顯示,與代償期LC患者相比較,失代償期LC患者PPⅨ顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而CHB患者活動(dòng)期與靜止期PPⅨ比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

    圖2 對照組與病例組血清PPⅨ水平

    表2 CHB與LC患者組內(nèi)PPⅨ水平

    2.3 PPⅨ診斷HBV相關(guān)慢性肝病的效能 ROC曲線顯示,PPⅨ診斷CHB的曲線下面積(AUC)為0.873,95%CI:0.797~0.949,利用約登指數(shù)確定臨界值為20.325ng/dl,其敏感度為86%,特異度為77.5%;診斷LC的AUC為0.748,95%CI:0.659~0.838,臨界值為33.695 ng/dl,其敏感度為90%,特異度為61.1%;診斷HCC的AUC為0.812,95%CI:0.729~0.896,臨界值為65.26 ng/dl,其敏感度為85%,特異度為69.2%(圖3)。

    注:a,PPⅨ診斷CHB的ROC曲線;b,PPⅨ診斷LC的ROC曲線;c,PPⅨ診斷HCC的ROC曲線。

    2.4 CHB靜止期與對照組PPⅨ及肝功能比較 靜止期CHB患者肝功能指標(biāo)除ChE較健康對照組升高外(P=0.032),其余指標(biāo)與對照組相比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05);而CHB患者的PPⅨ顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

    表3 CHB患者靜止期與對照組PPⅨ及肝功能指標(biāo)比較

    2.5 PPⅨ與各肝功能評估指標(biāo)的相關(guān)性分析 CHB患者PPⅨ與各指標(biāo)均不存在相關(guān)性(P值均>0.05);LC患者PPⅨ與TBil呈中等正相關(guān)(rs=0.587,P<0.05),與Alb呈中等負(fù)相關(guān)(rs=-0.408,P<0.05);HCC患者PPⅨ與TBil呈中等正相關(guān)(rs=0.470,P<0.05),與ChE呈中等負(fù)相關(guān)(rs=-0.459,P<0.05)(表4)。

    表4 PPⅨ與各指標(biāo)的相關(guān)性分析

    3 討論

    HBV感染是全球最重大公共衛(wèi)生安全問題之一,可進(jìn)展為CHB甚至LC、HCC等終末期肝病,給患者和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān),同時(shí)擠占大量的醫(yī)療資源。而早期預(yù)防及治療,對于阻止疾病進(jìn)展及改善預(yù)后具有重要意義。CHB的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,迄今尚未完全闡明,目前認(rèn)為肝細(xì)胞損害主要是由HBV引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)所導(dǎo)致[1]。此外,HBV誘導(dǎo)線粒體氧化應(yīng)激、線粒體自噬以及釋放炎性因子可能是肝病進(jìn)展的重要原因[4]。PPⅨ是血紅素生物合成途徑的最終中間體,起始和終末兩個(gè)關(guān)鍵步驟均在肝細(xì)胞線粒體進(jìn)行[2],遺傳性和后天性疾病以及某些外源生物可能干擾血紅素的合成和PPⅨ的體內(nèi)平衡,導(dǎo)致PPⅨ的蓄積[5]。大量的PPⅨ具有肝毒性,損害肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞,肝細(xì)胞損傷后肝臟對PPⅨ的清除作用進(jìn)一步減弱,血漿和紅細(xì)胞中PPⅨ水平可逐漸升高[5]。研究[6]表明,HBV或許影響肝細(xì)胞內(nèi)PPⅨ代謝和血紅素合成,而PPⅨ與HBV相關(guān)慢性肝病進(jìn)展的關(guān)系及其能否用于肝損傷的早期預(yù)警及病情評估鮮有報(bào)道。

    本研究利用HPLC法,高效、高靈敏的檢測了對照組和慢性肝病患者的血清PPⅨ。結(jié)果顯示,在HBV感染者疾病進(jìn)程的不同階段均存在PPⅨ表達(dá)異常。與對照組相比,肝病患者的PPⅨ顯著升高,這與以往的研究結(jié)果一致[7-9],也驗(yàn)證了該方法的有效性。Nakano等[10]研究發(fā)現(xiàn),HCV核心蛋白可以增加貓白血病病毒C亞類受體1(feline leukemia virus subgroup C receptor 1, FLVCR1)和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體ATP結(jié)合盒G家族成員2(ATP-binding cassette subfamily G member 2, ABCG2)的mRNA表達(dá),降低ATP結(jié)合盒B家族成員6(ATP-binding cassette subfamily B member 6, ABCB6)的mRNA表達(dá),HBV核心蛋白同樣如此[6]。FLVCR1是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白促進(jìn)因子超家族成員,可以輸出血紅素和PPⅨ[11];ABCG2主要定位于細(xì)胞外膜和線粒體膜,負(fù)責(zé)PPⅨ的外排;而ABCB6是線粒體卟啉攝取所必需的[12],其表達(dá)水平直接影響細(xì)胞內(nèi)的PPⅨ濃度[13]。HBV感染者血清中PPⅨ升高可能是HBV核心蛋白通過增加卟啉轉(zhuǎn)運(yùn)體FLVCR1和 ABCG2的表達(dá),降低ABCB6的表達(dá),使PPⅨ從肝細(xì)胞輸出增加,輸入減少,導(dǎo)致血漿中PPⅨ水平升高。同時(shí),HBV可引起線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激[6,14],導(dǎo)致血紅素合成障礙和PPⅨ的蓄積,造成肝細(xì)胞損害。血紅素合成減少負(fù)反饋引起卟啉合成限速酶氨基 γ 酮戊酸合成酶1的增加,又加速了PPⅨ的合成。肝細(xì)胞損害也使PPⅨ的清除能力下降,肝腸循環(huán)增加,導(dǎo)致血清中PPⅨ水平進(jìn)一步升高。

    PPⅨ增減與肝病輕重,特別是肝損傷程度密切相關(guān)[7],血清PPⅨ還可能與慢性肝病進(jìn)展呈活動(dòng)度依賴性,CHB患者活動(dòng)期與靜止期PPⅨ相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能與納入CHB患者肝損傷普遍較輕及樣本量較小有關(guān)。與代償期LC患者相比,失代償期患者肝功能嚴(yán)重受損,PPⅨ水平也顯著升高,說明PPⅨ檢測不但能反映肝損傷,還能幫助判斷病情進(jìn)展情況。本研究發(fā)現(xiàn)HCC患者PPⅨ較CHB、LC患者均顯著增加,說明HCC時(shí)卟啉代謝紊亂較慢性肝病更為突出。線粒體功能障礙已被認(rèn)為是癌癥的標(biāo)志[15],肝癌患者PPⅨ顯著升高可能是因?yàn)榫€粒體功能障礙引起氧化應(yīng)激從而干擾卟啉代謝和血紅素的生成。也有學(xué)者[9]認(rèn)為可能是惡性腫瘤刺激機(jī)體卟啉代謝的某個(gè)限速酶,使其活性增強(qiáng),產(chǎn)生大量PPⅨ超過了機(jī)體對其的利用,導(dǎo)致血中PPⅨ水平顯著升高。

    研究[7,16]證實(shí)HBV感染者PPⅨ水平與肝病進(jìn)展相關(guān),但目前僅有一項(xiàng)研究[9]調(diào)查了PPⅨ在HCC患者中的診斷價(jià)值,PPⅨ能否作為CHB、LC和HCC鑒別診斷的潛在標(biāo)志物,目前尚未闡明。本研究通過ROC曲線分析顯示,當(dāng)PPⅨ取最佳臨界值20.325、33.695、65.26 ng/dl時(shí),采用PPⅨ診斷CHB、LC和HCC的敏感度均在85%以上,特異度均在60%以上,說明PPⅨ對HBV相關(guān)慢性肝病診斷的敏感度較高,但特異度特差,因此PPⅨ不具備診斷價(jià)值。進(jìn)一步對靜止期CHB患者和對照組的PPⅨ水平和肝功能指標(biāo)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),靜止期CHB患者肝功能指標(biāo)與對照組相比,無明顯變化,而PPⅨ水平顯著高于健康對照組,提示PPⅨ是肝損傷的早期事件。在慢性HBV感染時(shí),HBV最早損傷肝細(xì)胞線粒體,作為PPⅨ代謝的主要細(xì)胞器,線粒體的損傷影響了PPⅨ的正常代謝,此時(shí)肝細(xì)胞的其他亞細(xì)胞器未損傷,表現(xiàn)為膽紅素、轉(zhuǎn)氨酶等反映肝損傷的指標(biāo)均正常,而血清PPⅨ異常。因此PPⅨ是反映肝臟早期輕微損傷的敏感指標(biāo),具有作為HBV肝損傷的早期預(yù)警潛質(zhì),可能用于急性、活動(dòng)性、慢加急性肝損傷或肝衰竭等的預(yù)警、轉(zhuǎn)歸及預(yù)后評估。

    Spearman相關(guān)性分析表明PPⅨ水平可能與肝功能障礙和膽汁淤積的程度有關(guān),這與國外學(xué)者的報(bào)道相一致[8,17]。HBV損傷肝細(xì)胞,使膽紅素和PPⅨ攝取、代謝和排泄能力降低,血清中膽紅素和PPⅨ水平升高。血清中的PPⅨ既有游離態(tài)的,又存在和蛋白質(zhì)結(jié)合形式的,血清白蛋白能夠作為PPⅨ的載體參與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)[18]。卟啉轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白FLVCR1輸出血紅素受到細(xì)胞外血紅素結(jié)合蛋白和Alb的嚴(yán)格控制,在缺乏載體蛋白的情況下FLVCR不能輸出血紅素[11]。本研究LC和HCC組PPⅨ顯著升高,可能與患者Alb合成減少,輸出血紅素亦減少導(dǎo)致PPⅨ的蓄積有關(guān),也說明PPⅨ可作為肝損傷的評估指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)HBV感染者PPⅨ不與ALT、AST呈顯著的相關(guān)性,這可能與ALT、AST僅在肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯炎癥及壞死時(shí)才升高有關(guān),也可能是反映肝損傷的不同發(fā)病機(jī)理或不同分子通路。

    綜上所述,HBV相關(guān)慢性肝病患者血清PPⅨ顯著升高,且與慢性肝病進(jìn)展呈活動(dòng)度依賴性,可作為肝損傷的早期預(yù)警和病情評估的潛在臨床指標(biāo),對評價(jià)肝損傷程度、判斷肝臟儲(chǔ)備功能、協(xié)助慢性肝病診治具有一定的臨床意義。同時(shí),由于本研究樣本量較小和樣本的局限性,其結(jié)果推廣應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。

    利益沖突聲明:本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

    作者貢獻(xiàn)聲明:張瓔、成若晨負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì),資料分析,撰寫論文;郭蕊、王霞參與收集數(shù)據(jù)與樣本檢測;劉凱歌負(fù)責(zé)擬定寫作思路,指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

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