分散微固相萃取/超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法測定茶葉中高氯酸鹽

韋 昱，方從容，趙云峰，陳達(dá)煒，李敬光

(國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估中心/衛(wèi)生部食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

高氯酸鹽作為一類新型環(huán)境污染物普遍存在于環(huán)境和食品中，人類活動(dòng)排放是其主要來源，如航天燃料、煙花爆竹，以及含氯消毒劑、化肥、除草劑的生產(chǎn)使用。高氯酸鹽對人體的危害主要是引起甲狀腺功能減退而導(dǎo)致一系列疾病[1-5]。環(huán)境中的高氯酸鹽以不同形式進(jìn)入水和土壤后，可被茶樹吸收富集，導(dǎo)致茶葉中高氯酸鹽含量增加。近年來，中國超90%的茶葉檢出高氯酸鹽，平均含量為100～200 μg/kg，最高可達(dá)1 600 μg/kg[6]。目前，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)尚未對茶葉中高氯酸鹽的限量進(jìn)行規(guī)定，但2020年5月歐盟委員會(huì)規(guī)定茶葉中高氯酸鹽的最大殘留量為750 μg/kg[7]。建立有效、簡便的茶葉中高氯酸鹽檢測方法對于安全飲茶至關(guān)重要。

茶葉中高氯酸鹽的檢測方法主要包括離子色譜法[8]、離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(IC-MS/MS)[9-10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[11-13]等。由于茶葉中高氯酸鹽的含量多為痕量級(jí)別，且考慮到儀器的普適性，LC-MS/MS成為一種較優(yōu)選擇。茶葉富含茶多酚、生物堿、氨基酸等多種生物活性物質(zhì)，在質(zhì)譜檢測分析中易對高氯酸鹽產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)影響，因此對樣品有效凈化是關(guān)鍵步驟[14-16]。目前，茶葉中高氯酸鹽的樣品前處理多采用分散固相萃取法(DSPE)和固相萃取法(SPE)。其中，DSPE法是應(yīng)用固體吸附劑吸附茶葉提取液中的干擾物質(zhì)，如石墨化碳黑(GCB)被應(yīng)用于茶葉樣品前處理以檢測高氯酸鹽[17]，但該方法凈化效果不佳；吸附型SPE法是應(yīng)用固體吸附劑吸附茶葉中的高氯酸鹽進(jìn)而獲取較優(yōu)的凈化效果，然而尋找一種合適的有效吸附劑存在困難，十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、TPT、親水親脂平衡聚合物(HLB)等類型的SPE柱對純化水、牛奶、水果、蔬菜等樣品中的高氯酸鹽提取效果良好，但不適用于基質(zhì)復(fù)雜的茶葉樣品[18]。因此，文獻(xiàn)報(bào)道多采用通過型SPE法，即通過固體吸附劑完成對干擾物的吸附，這在一定程度上降低了凈化效果。此外，SPE法的成本較高，需要淋洗、平衡和濃縮等程序，操作不夠簡便。

分散微固相萃取(DMSPE)是基于DSPE和SPE技術(shù)，將固體吸附劑分散于提取液中吸附目標(biāo)分析物，進(jìn)而再洗脫的原理，提高了復(fù)雜基質(zhì)樣品的凈化效果[19-20]。Zhang等[19]采用DMSPE技術(shù)，將混合吸附劑(強(qiáng)陽離子交換吸附劑PCX和強(qiáng)陰離子交換吸附劑PAX)成功應(yīng)用于海水中脂溶性海洋毒素的富集和凈化。該技術(shù)操作簡便，各吸附劑之間可混合使用，是優(yōu)化茶葉樣品前處理的潛在方法之一，但其應(yīng)用鮮有報(bào)道?；诓枞~中高氯酸鹽檢測的現(xiàn)狀與難點(diǎn)，本研究采用DMSPE技術(shù)對茶葉樣品進(jìn)行前處理，優(yōu)化了吸附劑及前處理?xiàng)l件，并結(jié)合超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(UHPLC-HRMS)技術(shù)，建立了茶葉中高氯酸鹽的測定方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜儀(U3000/Q Exactive，美國Thermo-Fisher公司)；渦旋混合器(美國Scientific Industries公司)，高速離心機(jī)(美國Sigma公司)。

高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg/L，上海Sigma公司)，18O4-高氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)溶液(200 mg/L，加拿大TRC公司)；質(zhì)譜級(jí)乙腈和甲醇(美國Fisher Scientific 公司)，HPLC級(jí)甲酸、乙酸和氨水(美國Tedia公司和上海安譜公司)；實(shí)驗(yàn)用水由純水儀(美國Millipore公司)制備。陰離子交換吸附劑乙二胺基-N-丙基(PSA，平均粒徑40～60 μm，比表面積480 m2/g)、PAX(平均粒徑40～60 μm，比表面積600 m2/g)、PWAX(平均粒徑40～60 μm，比表面積600 m2/g)、SAX(平均粒徑50 μm，比表面積550 m2/g)、NH2(平均粒徑40～60 μm,比表面積550 m2/g)以及陽離子交換吸附劑PCX(平均粒徑30 μm,比表面積600 m2/g)、SCX(平均粒徑50 μm，比表面積600 m2/g)購自天津博納艾杰爾科技有限公司；GCB(美國Agilent公司)。5種微孔濾膜(混合纖維素膜、尼龍膜、聚四氟乙烯膜、聚醚砜膜和聚酯膜)購自上海Sigma和安譜公司。本研究于2017年至2018年間，從中國福建、安徽、云南、湖北和浙江省的當(dāng)?shù)爻惺占?6份茶葉樣品，經(jīng)粉碎均質(zhì)成粉末并密封，于-20 ℃下儲(chǔ)存。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確移取適量高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg/L)，用乙腈稀釋配制高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(10、1 mg/L)。準(zhǔn)確移取適量18O4-高氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)溶液(200 mg/L)，用乙腈稀釋配制18O4-高氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)中間溶液(1 mg/L)。吸取適量標(biāo)準(zhǔn)中間溶液和內(nèi)標(biāo)中間溶液，用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為0.05～50 μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為2 μg/L。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1.0 g茶葉樣品于15 mL離心管中，加入40 μL內(nèi)標(biāo)中間溶液(1 mg/L)靜置30 min。加入3 mL水，渦旋混合30 s，加入7 mL乙腈混勻后，超聲提取20 min。以8 000 r/min離心5 min后，移取1.0 mL上清液于裝有吸附填料(50 mg PSA和50 mg PCX)的2 mL離心管中，渦旋混勻30 s，使高氯酸鹽吸附于填料上，棄去上清液，而后用2.0 mL 5%氨水溶液進(jìn)行洗脫，并將洗脫液以13 000 r/min離心5 min后，待分析。

1.4 儀器分析條件

本研究儀器分析條件的優(yōu)化參見前期工作[11]，獲取的最優(yōu)儀器參數(shù)條件如下：

色譜條件：Poroshell 120 PFP色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.9 μm)，柱溫：40 ℃，流速：0.6 mL/min，流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為1.0%乙酸水溶液。梯度洗脫程序：0～0.8 min，10% A；0.8～2.2 min，10%～100% A；2.2～2.5 min，100% A；2.5～4.0 min，100%～10% A。進(jìn)樣量：5 μL。

質(zhì)譜參數(shù)：采用加熱電噴霧離子化方式(HESI)；噴霧電壓為2 800 V；毛細(xì)管溫度為325 ℃；加熱溫度為400 ℃；鞘氣壓力為45 arb(465.3 kPa)，輔助氣壓力為10 arb(104.3 kPa)；負(fù)離子采集模式，靶向單一離子監(jiān)測(TSIM)/數(shù)據(jù)依賴質(zhì)譜(ddMS2)掃描模式；TSIM采集分辨率為70 000 FWHM，自動(dòng)增益控制為2e5，最大注射時(shí)間為100 ms，分離寬度為5 Da；ddMS2采集分辨率為17 500 FWHM，Loop Count為1，TopN為2，碰撞裂解能量為150%。高氯酸鹽的定量離子為m/z98.948 5，定性離子為m/z82.953 4和84.950 4；18O4-高氯酸鹽同位素內(nèi)標(biāo)的定量離子為m/z106.968 0。

2 結(jié)果與討論

2.1 DMSPE吸附劑的優(yōu)化

DMSPE技術(shù)結(jié)合了SPE和DSPE技術(shù)的優(yōu)勢，但仍基于固液吸附原理，因此選擇合適的吸附劑是DMSPE技術(shù)的研究重點(diǎn)。GCB常被用作SPE和DSPE吸附劑對高氯酸鹽進(jìn)行凈化，但由于其對不同復(fù)雜基質(zhì)中高氯酸鹽及18O4-高氯酸鹽內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的吸附存在一定差異，從而影響檢測的準(zhǔn)確度[21]。本研究考察了GCB對茶葉提取液中高氯酸鹽及18O4-高氯酸鹽內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的吸附行為，結(jié)果顯示GCB對加標(biāo)茶葉提取液中高氯酸鹽及18O4-高氯酸鹽內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的吸附率分別為45%(圖1A)和56%，說明GCB不適合作為茶葉中高氯酸鹽的DMSPE吸附劑。

高氯酸鹽是一種陰離子化合物，帶陽離子基團(tuán)的吸附劑對其具有較好的吸附效果，因而，本研究分別考察了50 mg的PSA、PAX、PWAX、SAX和NH2作為離子交換吸附劑對加標(biāo)茶葉提取液中高氯酸鹽(100 μg/L)的吸附效果(見圖1A)。結(jié)果顯示，PSA對高氯酸鹽的吸附效果較差，吸附率僅為38%，而其它4種吸附劑由于具有相對較高的比表面積，對高氯酸鹽的吸附效果較優(yōu)(85%～96%)。進(jìn)一步考察了PSA對無基質(zhì)的純?nèi)軇└呗人猁}標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸附效果，發(fā)現(xiàn)高氯酸鹽的吸附效果有所提高(62%)，這說明PSA更易吸附茶葉中的干擾物，使得吸附位點(diǎn)被占據(jù)而導(dǎo)致對茶葉基質(zhì)中高氯酸鹽的吸附效果較差。

圖1 不同吸附劑對茶葉提取液中高氯酸鹽(100 μg/L)的吸附率(A)與解吸附率(B)(n=3)Fig.1 Adsorption rate(A) and desorption rate(B) of different adsorbents on perchlorate in tea extract(100 μg/L)(n=3)

本研究選擇2.0 mL的5%甲酸水溶液和5%氨水溶液分別對已吸附高氯酸鹽的PSA、PAX、PWAX、SAX和NH2吸附劑進(jìn)行洗脫，結(jié)果表明，2種洗脫劑均無法將目標(biāo)分析物從PAX、PWAX、SAX和NH2吸附劑上較好的洗脫，解吸附率均低于50%(圖1B)?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，單獨(dú)使用這5種吸附劑均無法獲取較佳的吸附或解吸附效果。值得注意的是，PSA與其它4種吸附劑有所不同，雖對高氯酸鹽的吸附效果不佳，但所吸附的高氯酸鹽可得到較好洗脫(98%)。

本研究嘗試將PSA與其它類型吸附劑聯(lián)用，以更好地獲得高氯酸鹽的吸附和解吸附效果。首先，將PSA與其它4種相同類型的陰離子交換吸附劑(PAX、SAX、PWAX和NH2)聯(lián)用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些聯(lián)合吸附劑同樣對高氯酸鹽具有較好的吸附效果，但無法獲取較佳的解吸附效果。其次，選擇2種陽離子交換吸附劑(PCX和SCX)與PSA聯(lián)用，并采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液對其進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用PCX或SCX對高氯酸鹽幾乎無吸附作用，但與PSA聯(lián)用后，均能改善單獨(dú)使用PSA對高氯酸鹽的吸附效果，吸附率升至90%，說明PCX或SCX的作用可能是通過吸附茶葉中的干擾物，從而釋放更多的PSA吸附位點(diǎn)，進(jìn)而提高吸附率。在解吸附率考察中，采用2 mL的5% 氨水溶液洗脫能使高氯酸鹽在PSA和PCX聯(lián)合吸附劑上的解吸附率達(dá)到95%。然而，SCX與PSA聯(lián)用的解吸附率相較于PCX有所下降(87%)，分析其原因可能是PCX具有更細(xì)的平均粒徑，對于茶葉中干擾物的吸附較SCX更佳，從而獲取的基質(zhì)效應(yīng)更低。綜上，本研究以PSA與PCX聯(lián)用作為DMSPE吸附劑。

2.2 DMSPE條件的選擇

本研究考察了聯(lián)用吸附劑PSA和PCX的不同質(zhì)量比(1∶0.5、1∶1和1∶2)對基質(zhì)溶液中高氯酸鹽吸附和解吸附效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這3種質(zhì)量比例下，高氯酸鹽均能獲取較佳的吸附效果，但比例為1∶1和1∶2的解吸附效果(>93%)均優(yōu)于1∶0.5(82%)的解吸附效果。因此，考慮到價(jià)格成本和解吸附效果，確定選擇PSA和PCX的質(zhì)量比為1∶1。

此外，通過對茶葉提取液中100 μg/L高氯酸鹽的分析，優(yōu)化了吸附劑用量、洗脫溶劑體積和氨水比例(見圖2)。圖2A結(jié)果顯示，高氯酸鹽的提取回收率隨著吸附劑用量的增加而逐漸提高，當(dāng)用量≥50 mg時(shí)，提取回收率達(dá)到88%以上并趨于平衡。圖2B結(jié)果顯示，2.0 mL的5%氨水溶液足以將吸附劑上的目標(biāo)分析物洗脫完全。圖2C結(jié)果表明，隨著洗脫液中氨水的比例逐步提高，高氯酸鹽的提取回收率有所提高，5%的氨水溶液即可獲取最佳的洗脫效果。因此，本研究最終選擇50 mg PCX和50 mg PSA為混合吸附劑，以2.0 mL的5%氨水溶液進(jìn)行解吸附。

圖2 不同DMSPE條件下高氯酸鹽的回收率(n=3)Fig.2 Recoveries of perchlorate at different DMSPE conditions(n=3)A：amount of adsorbent;B：volume of eluent;C：proportion of ammonium hydroxide

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

茶葉樣品中的復(fù)雜基質(zhì)可能增強(qiáng)或抑制高氯酸鹽的離子強(qiáng)度，進(jìn)而影響定量分析的準(zhǔn)確性。將空白茶葉樣品按“1.3”方法進(jìn)行前處理，制得茶葉空白基質(zhì)溶液。分別用5% 氨水溶液和茶葉空白基質(zhì)溶液配制質(zhì)量濃度為0.05～50 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，作為純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，并采用本方法進(jìn)行分析。依據(jù)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，即斜率比值接近1.0時(shí)，表明基質(zhì)效應(yīng)較弱，斜率比值在0.8～1.2之間為可接受的基質(zhì)效應(yīng)。上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值為0.93，說明該方法的基質(zhì)效應(yīng)可忽略不計(jì)。因此，本研究采用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線完成對茶葉中高氯酸鹽的分析。

2.4 方法選擇性

本研究通過分析不同空白樣品中測定目標(biāo)物的特異性(n=6)來考察方法選擇性。圖3顯示，高氯酸鹽的保留時(shí)間附近未發(fā)現(xiàn)基質(zhì)干擾峰，說明本方法具有較好的選擇性。值得注意的是，在質(zhì)譜儀器檢測前，往往需用微孔濾膜去除樣品分析液中可能存在的細(xì)小微粒，以避免色譜柱堵塞?？紤]到高氯酸鹽作為普遍存在的環(huán)境污染物，可能通過污染的微孔濾膜進(jìn)而引入樣品分析液中，導(dǎo)致對樣品中高氯酸鹽含量的假陽性檢測或高估結(jié)果。為此，比較了5種不同品牌或類型的微孔濾膜(混合纖維素膜、尼龍膜、聚四氟乙烯膜、聚醚砜膜和聚酯膜)，分別用1 mL的5%氨水溶液洗脫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3份分析液(混合纖維素膜、尼龍膜和聚酯膜)中分別檢出質(zhì)量濃度為2.7、8.3、14.1 μg/L的高氯酸鹽。因此，樣品分析液不采用微孔濾膜過濾，而是采用13 000 r/min高速離心5 min，以避免高氯酸鹽或其它離子的背景干擾。

圖3 高氯酸鹽的提取離子色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms of perchlorateA：blank tea extract;B：1.0 μg/L of matrix-matched standard solution;C：spiked extract at LOQ level

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

配制質(zhì)量濃度為0.05～50 μg/L的高氯酸鹽系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)18O4-高氯酸鹽的質(zhì)量濃度為2 μg/L。采用本方法進(jìn)行分析，以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，高氯酸鹽與其同位素內(nèi)標(biāo)的提取離子色譜峰峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示高氯酸鹽在0.05～50 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 7。

對茶葉空白基質(zhì)溶液進(jìn)行低水平加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，分別以3倍和10倍信噪比(S/N)對應(yīng)的加標(biāo)水平為檢出限(LOD)與定量下限(LOQ)。高氯酸鹽在茶葉中的LOD為0.4 μg/kg，LOQ為1.2 μg/kg，遠(yuǎn)低于歐盟對茶葉中高氯酸鹽750 μg/kg的限量值，該方法可滿足茶葉中高氯酸鹽的檢測要求，適用于茶葉中痕量高氯酸鹽的風(fēng)險(xiǎn)評估。

2.6 準(zhǔn)確度與精密度

本研究選擇空白茶葉進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，以考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。選定加標(biāo)水平分別為1.2、12、120 μg/kg，按照“1.3”和“1.4”方法處理后上機(jī)測定，每個(gè)加標(biāo)水平每日平行測定6次，連續(xù)測定3日。結(jié)果顯示，高氯酸鹽在3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率為87.4%～105%，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDr)為0.30%～6.1%，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDR)為4.2%～9.2%(見表1)，說明本方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

表1 茶葉中高氯酸鹽的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Recoveries and relative standard deviations for perchlorate in tea

2.7 方法比較

目前，茶葉中高氯酸鹽的檢測主要采用IC-MS/MS和LC-MS/MS法。與已報(bào)道的分析方法相比，如鄧家軍等[6]所綜述的茶葉中高氯酸鹽的方法LOQ在2～3 000 μg/kg之間，Liu等[18]報(bào)道的方法LOQ為10 μg/kg，Wang等[17]報(bào)道的方法LOQ為5 μg/kg，本研究所建立的方法具有更低的LOQ(1.2 μg/kg)。盡管Zhao等[12]報(bào)道的方法具有更低的LOQ(8.21 ng/kg)，但樣品前處理使用的QA-Mag-CCNTs吸附劑需要自制。本研究所用的吸附劑均已商品化，較易獲取。此外，本研究采用DMSPE凈化技術(shù)，可較大程度去除茶葉中的復(fù)雜干擾物，獲得更低的基質(zhì)效應(yīng)。同時(shí)，由于DMSPE技術(shù)是采用分散式吸附型凈化，吸附填料可自行組合，相較于商業(yè)化的SPE柱，操作更簡捷，且成本更低[21]。

2.8 實(shí)際樣品的測定

采用已建立的方法對86份茶葉樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2。茶葉中高氯酸鹽的檢出率為91.9%，檢出含量為3.8～1 073 μg/kg，平均含量為163 μg/kg。此外，在一些茶葉樣品中檢測到高含量的高氯酸鹽，根據(jù)歐盟規(guī)定的限量值(750 μg/kg)，8份茶葉樣品中高氯酸鹽超過限量，檢測含量為841～1 073 μg/kg。

表2 茶葉樣品中高氯酸鹽的檢測結(jié)果數(shù)據(jù)分析(n=86，μg/kg)Table 2 Data statistics of perchlorate in real samples(n=86,μg/kg)

3 結(jié) 論

本文以PSA和PCX作為聯(lián)合吸附劑開展分散微固相萃取技術(shù)研究，結(jié)合超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜，建立了茶葉中高氯酸鹽的檢測方法。該方法基質(zhì)效應(yīng)較小，凈化效果好，前處理操作簡單、成本低，靈敏度高，準(zhǔn)確度和精密度均可滿足茶葉中高氯酸鹽的檢測要求，為我國茶葉的監(jiān)測和風(fēng)險(xiǎn)評估提供了可靠的技術(shù)手段。