食藥用菌茯苓對(duì)藤茶的生物轉(zhuǎn)化效應(yīng)

馮彥勇，陳雪梅，匡鳳軍，郭 燾，楊玉娟，周 強(qiáng)， 湯 丹，龍玉平

（1. 湖南口味王集團(tuán)有限責(zé)任公司，湖南 益陽(yáng) 413001；2. 湖南中益食品化工檢測(cè)院，湖南 益陽(yáng) 413001）

藤茶系葡萄科蛇葡萄屬的一種野生藤本植物，因其性涼、味甘淡，有消暑止渴、去癖消腫、止血止痛、消炎解毒、通經(jīng)絡(luò)等保健功效以及治療感冒發(fā)熱、口腔潰瘍、南喉奚徒、肝炎等藥用價(jià)值，作為藥食同源的中藥材使用已有一千多年的歷史。但關(guān)于藤茶的系統(tǒng)研究?jī)H有二三十年的歷史，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)該屬的8個(gè)品種進(jìn)行化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)其主要含有黃酮、鞣質(zhì)、低聚芪、蒽醌、甾體、萜類等成分，其中黃酮類成分是藤茶中最主要的活性物質(zhì)，包括二氫楊梅素、楊梅素、藤茶素和藤茶苷等[1-6]。食藥用擔(dān)子菌包括野生的冬蟲夏草、蟬花等以及人工栽培的靈芝、茯苓、豬苓等。這些食藥用擔(dān)子菌的共同點(diǎn)就是無明顯毒副作用。近代醫(yī)學(xué)研究表明，它們不僅具有傳統(tǒng)的益氣、強(qiáng)身、祛病、通經(jīng)、益壽等功能，還具有很好的藥用保健價(jià)值[7-12]。

長(zhǎng)期以來，藤茶加工主要產(chǎn)品為沖泡型的藤茶。在加工過程中因工藝的不同藤茶產(chǎn)品質(zhì)量不一，但不管使用哪種加工工藝，藤茶固有的澀味均難以去除，導(dǎo)致藤茶的推廣應(yīng)用受到限制。

基于藤茶的活性成分以及食藥用真菌的轉(zhuǎn)化作用，采用食藥用菌茯苓對(duì)藤茶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，分析發(fā)酵前后藤茶主要活性物質(zhì)及特征香氣成分的變化，以期為藤茶資源的開發(fā)利用開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試樣品為來鳳藤茶，市場(chǎng)購(gòu)買；主要試驗(yàn)試劑有甲醇（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、甲酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（Sigma-Aldrich 公司）、二氯甲烷（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；主要儀器設(shè)備有LC-20A 高效液相色譜儀（日本島津公司）、7890A/5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司）、SHZ-D 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、FZ102 型粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）、FA2004 型電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茯苓藤茶發(fā)酵工藝 取實(shí)驗(yàn)室保藏的茯苓菌種，在土豆瓊脂斜面上活化，于25℃培養(yǎng)7 d 后接種到土豆液體培養(yǎng)基，至于恒溫?fù)u床（150 r/min，25℃）培養(yǎng)7 d 后得到液體菌種。分別稱取一定量的藤茶于250 mL 的三角瓶中，按1 ∶20 的固液比加入水，封口后121℃滅菌20 min，冷卻后接入茯苓液體菌種，在25℃條件下發(fā)酵，并分別在發(fā)酵0、6、9、12、15 d 取樣進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.2 樣品中活性成分及DPPH 自由基清除能力的測(cè)定 茶多酚含量依據(jù)GB/T 8313—2008 茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法測(cè)定，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[13]，根據(jù)李曉芬[14]的方法測(cè)定樣品的DPPH 自由基清除能力。

1.2.3 藤茶黃酮類物質(zhì)樣品制備 藤茶樣品粉碎后過80 目篩，用80%乙醇以1 ∶20 的料液比回流提取1 h，離心過濾后定容到一定的體積，用0.22 μm 微孔濾膜過濾即得。

1.2.4 高效液相色譜分析黃酮類物質(zhì)條件 色譜柱為Hypersil C-18 反相柱（100 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A 為甲醇、流動(dòng)相B 為0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0～17 min（5%～20% B）、17～47 min（20%～40% B）、47～62 min（40%～60% B）、62～80 min（60%～80% B）、80～85 min（80%～5% B）、85～95 min（5%～5% B）；進(jìn)樣量10 μL；流速1.0 mL/min；柱溫室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)292 nm。

1.2.5 藤茶香氣精油的制備 取樣品80 g，置于5 L

圓底燒瓶中，加入1 L 蒸餾水，用40 mL 的二氯甲烷在同時(shí)蒸餾萃取（SDE）裝置中提取5 h，二氯甲烷提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至2 mL，再用無水硫酸鈉除水得到藤茶香氣精油[15]。

1.2.6 氣相色譜-質(zhì)譜分析香氣精油條件 GC 條件 ：Agilent 7890A/5975C 氣質(zhì)聯(lián)用儀，色譜柱為HP-5 毛細(xì)管柱（30 m × 250 μm × 0.25 μm），進(jìn)樣口溫度為220℃，檢測(cè)器溫度為200℃，分流比為20 ∶1，檢測(cè)器為FID。程序升溫條件：初始溫度50℃，保持2 min，5℃/min 升至190℃，之后以10℃/min 升至250℃保持4 min。MS 條件：接口溫度為190℃，離子源溫度230℃，電離方式為EI，掃描范圍（m/z）為20～500 amu。檢索譜庫(kù)為NIST05。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮類物質(zhì)含量的變化

黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、抗腫瘤、清除自由基等功效，茶葉中的黃酮類物質(zhì)對(duì)其感官品質(zhì)影響顯著[16]。對(duì)來鳳藤茶主要黃酮類物質(zhì)（二氫楊梅素和楊梅素）含量在食藥用菌茯苓發(fā)酵前后的變化進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖1 所示，二氫楊梅素和楊梅素的含量在生物轉(zhuǎn)化前后沒有發(fā)生明顯變化。這表明采用食藥用菌茯苓對(duì)藤茶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化不會(huì)對(duì)藤茶的主要黃酮類活性物質(zhì)造成破壞。

2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)樣品中活性成分及DPPH 自由基清除能力的影響

2.2.1 茶多酚 茶多酚是存在于茶葉中的一類多元酚混合物，是茶葉中主要的活性物質(zhì)之一，在茶湯中呈苦澀味，其含量是衡量茶葉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[17]。如圖2 所示，在食藥用菌茯苓發(fā)酵藤茶的過程中，茶多酚含量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)，發(fā)酵至第12 d，茶多酚含量達(dá)到最高（14.62 μg/mL），比初始含量增加了5.04%，進(jìn)一步延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，茶多酚含量呈下降趨勢(shì)，茶多酚含量在發(fā)酵第15 d 下降至14.18 μg/mL。在藤茶的整個(gè)生物轉(zhuǎn)化過程中，茶多酚含量變化幅度在5%以內(nèi)，表明利用食藥用菌茯苓發(fā)酵藤茶對(duì)茶多酚含量產(chǎn)生的影響很小。

2.2.2 多 糖 多糖具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂分化、降血脂和增強(qiáng)免疫力等，是藤茶具有保健藥用功效的主要活性物質(zhì)之一[18]。由圖3 可知，食藥用菌茯苓對(duì)藤茶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的整個(gè)過程中，多糖的含量一直處于不斷增加的趨勢(shì)，發(fā)酵至第15 d 時(shí)，多糖含量由初始的10.25 μg/mL 增至37.63 μg/mL，增幅達(dá)218%。由于食藥用菌茯苓亦可合成多糖，因此，初步推測(cè)生物轉(zhuǎn)化過程中多糖的大幅增加是由茯苓菌發(fā)酵引起的。

2.2.3 DPPH 自由基清除能力 抗氧化作用是藤茶保健藥用功效之一。食藥用菌茯苓對(duì)藤茶進(jìn)行發(fā)酵的過程中，藤茶粗提物清除DPPH 自由基的能力隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈大幅增長(zhǎng)趨勢(shì)（圖4），增長(zhǎng)幅度高達(dá)246%，且與多糖含量的變化呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性。這可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中，茯苓產(chǎn)生了大量的抗氧化活性物質(zhì)（如多糖類），使藤茶的DPPH 自由基清除能力大幅提升。

2.3 藤茶香氣成分的變化

藤茶的香氣精油經(jīng)GC-MS 分析和譜庫(kù)NIST05檢索匹配，共定性27 種化合物（圖5，圖6）。如表1 所示，其中主要成分為糠醛、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、2-甲基戊酸甲酯等香氣成分及棕櫚酸、亞油酸、亞麻酸等酸類物質(zhì)。藤茶在發(fā)酵過程中β-紫羅蘭酮等特征香氣成分并未消失，只是相對(duì)百分含量有所改變。藤茶經(jīng)茯苓發(fā)酵產(chǎn)生了濃郁的水果香味，其主要成分為酯類，發(fā)酵9 d 時(shí)其相對(duì)含量達(dá)到22.74%（圖7）。隨著藤茶發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酸類物質(zhì)的含量大幅增加，其總含量從發(fā)酵初的12.92%上升到發(fā)酵15 d 的46.59%（圖8），這將對(duì)藤茶的口感產(chǎn)生一定影響。

圖1 發(fā)酵過程中黃酮類物質(zhì)含量變化

圖2 茶多酚含量的變化

圖3 多糖含量的變化

圖4 DPPH 自由基清除能力變化

3 結(jié)論與討論

茯苓對(duì)藤茶的生物轉(zhuǎn)化比較溫和，能較好地保留藤茶原有的形態(tài)和主要的活性物質(zhì)，同時(shí)在發(fā)酵過程中積累了大量的茯苓多糖等活性代謝產(chǎn)物，由于茯苓多糖等活性物質(zhì)具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒及增強(qiáng)免疫功能的作用[18-20]，故通過茯苓發(fā)酵，藤茶的保健功效將得到很大提升。

表1 發(fā)酵過程中藤茶主要香氣成分相對(duì)含量變化

圖5 藤茶原料香氣成分GC-MS 總離子流

圖6 發(fā)酵藤茶香氣成分GC-MS 總離子流圖

圖7 2-甲基戊酸甲酯含量變化

圖8 酸類物質(zhì)含量變化

在藤茶發(fā)酵過程中，保留了藤茶的特征性香氣成分，并產(chǎn)生新的香氣成分2-甲基戊酸甲酯，使藤茶帶有濃郁的水果香味，藤茶原有的苦澀味得到改善；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酸類物質(zhì)的總含量大幅增加，總酸含量的升高將對(duì)藤茶的口感產(chǎn)生一定影響，但總酸含量可通過調(diào)節(jié)發(fā)酵時(shí)間、水分含量等發(fā)酵參數(shù)得到一定程度的控制。