脊柱后縱韌帶骨化癥病因?qū)W研究進展

王瓏清，許晨輝，葉 程，朱 奇，劉 威，楊立利

海軍軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院骨科，上海 200003

后縱韌帶骨化癥（OPLL）是脊柱外科常見病之一。附著于椎體后緣的后縱韌帶在多因素作用下形成骨化物，骨化物持續(xù)生長造成脊髓和神經(jīng)根受壓，平時可無癥狀或癥狀不典型，一旦遇到外傷，即使是輕微外力也可導(dǎo)致嚴(yán)重的四肢感覺、運動、反射及二便功能障礙，甚至癱瘓，嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量，給家庭及社會帶來沉重負擔(dān)。OPLL 在東亞地區(qū)高發(fā)，發(fā)生率為0.4% ～ 3.0%［1］，而經(jīng)CT 三維重建檢查發(fā)現(xiàn)，存在頸脊髓壓迫癥狀的人群中OPLL 檢出率高達18.22%［2］。目前，手術(shù)是OPLL 最佳的治療方案［3］，但手術(shù)并不能完全解決骨化物繼續(xù)生長或其他部位新發(fā)骨化的問題。因此，臨床上需要有效的手段從發(fā)病環(huán)節(jié)阻斷疾病的發(fā)生與發(fā)展。有研究［4-5］表明，遺傳因素與環(huán)境因素共同參與了OPLL 的發(fā)生與發(fā)展，但仍沒有研究明確揭示OPLL 發(fā)生與發(fā)展的原因及針對病因的藥物治療方案。本文通過查閱近年國內(nèi)外OPLL 病因?qū)W研究文獻并對其進行梳理，從遺傳因素、機械應(yīng)力、生物標(biāo)志物及生活方式對OPLL 發(fā)生、發(fā)展的影響展開分析，并簡要介紹目前研究的不足及最新研究趨勢，綜述如下。

1 遺傳因素

1.1 編碼蛋白基因

1984 年，Tsuyama 等［6］發(fā) 現(xiàn)OPLL 有 高 遺 傳率的特征。20 世紀(jì)90 年代開始，人類基因組計劃（HGP）的提出與興起吸引了學(xué)界對OPLL 患者進行大量測序研究，發(fā)現(xiàn)諸多易感基因位點與OPLL的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。核苷酸焦磷酸酶（NPPS）基因多態(tài)性即是較早期發(fā)現(xiàn)之一［7］。此外，雙生子連鎖分析、候選基因關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，與OPLL 發(fā)生相關(guān)的易感基因位點多態(tài)性包括編碼ⅩⅦ型膠原α1 鏈（COL17A1）、Ⅵ型膠原α1 鏈（COL6A1）、Ⅺ型膠原蛋白α2鏈（COL11A2）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）、BMP-4、BMP-9、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）、BH3 相互作用結(jié)構(gòu)域死亡激動劑（BID）、runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）、轉(zhuǎn)化生長因子β 受體2（TGFBR2）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFB1）、維生素K 環(huán)氧還原酶復(fù)合物亞基1（VKORC1）、γ 干擾素（IFN-γ）、成纖維細胞生長因子受體1（FGFR1）、白介素15 受體α 亞基（IL15RA）、雌激素受體（ER）等的基因［8-10］，其中編碼BMP 和膠原基因相關(guān)報道較多。但上述易感基因多是研究者選擇目標(biāo)基因進行PCR 擴增并分析結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，存在可研究的基因種類及數(shù)量有限、樣本量較小且研究效率較低的問題，臨床轉(zhuǎn)化價值較低。

近年來，測序技術(shù)的進步和生物信息學(xué)的飛速發(fā)展為OPLL 病因?qū)W研究帶來新思路和新成果。全基因組測序研究發(fā)現(xiàn)了一批潛在的引起OPLL 的基因及位點。Nakajima 等［4，11］對15 000 余例日本OPLL 患者進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)6 個相關(guān)性最高的OPLL易感位點，并通過離體和在體實驗證實了rs374810位點突變，通過影響啟動子功能使RSPO2表達降低，進而激活經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路，引起OPLL。Chen 等［12］應(yīng)用高通量測序技術(shù)對55 例OPLL 患者進行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)COL6A1、COL11A2、FGFR1、BMP-2 與OPLL 發(fā)生相關(guān)。Wang等［13-16］對30例胸椎OPLL患者進行基因組測序及其相關(guān)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，分別位于COL6A1基因c.1534G＞ A（p.Gly512Ser）和白介素17 受體C（IL17RC）c.2275C ＞ A（p.Leu759Ile）的有害突變與OPLL 發(fā)生相關(guān)，突變亦導(dǎo)致其外周血中濃度顯著增高。Liang等［17］對25 例OPLL 患者全基因組測序并分析后發(fā)現(xiàn)，3 個基因上的4 個有害突變與OPLL 發(fā)生相關(guān)，分 別 位 于COL6A6 基 因c.2716C＞T（p.Arg906Cys）、COL9A1基因c.1946G＞C（p.Gly649Ala）及TLR1基因c.301T＞C（p.Ser101Pro）和c.171A＞G（p.Ile57Met）。

上述文獻大多僅報道測序發(fā)現(xiàn)，缺乏對突變位點引發(fā)OPLL 機制的深入研究。即使部分基因在不同研究間得到多次證實，提升了結(jié)論的可信度，但亦有研究得出不同結(jié)論。Horikoshi 等［18］的研究發(fā)現(xiàn)，TGFB3 單核苷酸多態(tài)性（SNP）與OPLL 顯著相關(guān)，而與NPPS，TGFB1，COL11A2 基因SNP 無相關(guān)性。上述測序研究結(jié)果間的矛盾之處表明，OPLL具有高度遺傳異質(zhì)性和復(fù)雜的形成機制。未來還需通過多中心、大樣本量的研究及多途徑、多手段證實相關(guān)基因功能，以得到其與OPLL 發(fā)生、發(fā)展的因果關(guān)系，經(jīng)此才能真正闡明相關(guān)基因在OPLL 病程中所起的作用，為今后對OPLL 預(yù)防與精準(zhǔn)化干預(yù)提供更堅實的基礎(chǔ)。

1.2 非編碼RNA（ncRNA）

對OPLL 患者轉(zhuǎn)錄本中ncRNA 與OPLL 發(fā)生關(guān)系的研究是近幾年來OPLL 病因?qū)W研究領(lǐng)域新出現(xiàn)的研究內(nèi)容。目前，引發(fā)OPLL 的基因中，研究最廣泛的是編碼蛋白基因，然而，這些基因僅占基因組的1.5%。ncRNA 數(shù)量龐大且同樣對細胞生長發(fā)育的調(diào)控及疾病的發(fā)生、發(fā)展起關(guān)鍵作用，但是，其潛在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與具體機制尚待進一步闡述。高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)及生物信息分析方法的應(yīng)用使對數(shù)量龐大的ncRNA 研究成為可能。近年有學(xué)者對微小RNA（miRNA）和長鏈非編碼RNA（lncRNA）與OPLL 之間的關(guān)系進行研究，推動了OPLL 病因?qū)W研究的進展及對疾病的理解。

Xu 等［19-20］在對骨化及無骨化患者韌帶組織的原代細胞高通量測序后分析發(fā)現(xiàn)，在記錄到的1 520個有效miRNA中，218個miRNA表達2倍上調(diào)或下調(diào)。作者利用生物信息學(xué)方法，通過比對RNA數(shù)據(jù)庫預(yù)測可能的miRNA/mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。為了驗證所構(gòu)建的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的正確性，作者通過RT-PCR分析4例OPLL和4例無骨化患者的后縱韌帶細胞的RNA表達情況，檢測結(jié)果與測序結(jié)果高度相似。其后，作者合成上調(diào)最顯著的5個miRNA并將其轉(zhuǎn)染入后縱韌帶細胞中，以驗證相關(guān)miRNA的功能，與對照組相比，轉(zhuǎn)染組成骨相關(guān)基因表達上調(diào)，礦化結(jié)節(jié)顯著增多，尤其是miR-10a-5p促進成骨效果最為顯著。在此基礎(chǔ)上，作者還發(fā)現(xiàn)高表達的miR-10a通過抑制ID3 促進RUNX2 表達，使成骨分化增強，在OPLL 發(fā)生中起一定作用。Lim 等［21］在一項納入207 例頸椎OPLL 患者和200 例對照者的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-146aC ＞ G 等4 個位點多態(tài)性的不同組合與OPLL 發(fā)生風(fēng)險顯著相關(guān)。Yuan 等［22］的研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄子（MALAT）lncRNA 在OPLL 細胞內(nèi)表達增高，其可能通過發(fā)揮miR-1 的海綿作用，降低miR-1 對縫隙連接蛋白43（Cx43）的抑制作用引起成骨相關(guān)基因的高表達，最終導(dǎo)致OPLL 的發(fā)生。亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR218［23］、miR-563［19，24］及X染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄因子（XIST）lncRNA［25］與OPLL 發(fā)生相關(guān)，并通過系列實驗證實其促進成骨及在OPLL發(fā)生中的機制。

2 機械應(yīng)力

機械應(yīng)力在骨的生長和發(fā)育中起到重要作用，力學(xué)的平衡與穩(wěn)定性是目前脊柱外科研究熱點之一。后縱韌帶位于椎體后緣，其參與維持脊柱的穩(wěn)定與平衡，長期受到應(yīng)力作用。因此，機械應(yīng)力是否與OPLL發(fā)生、發(fā)展相關(guān)吸引了諸多學(xué)者的興趣。1996年，Matsunaga等［26］報道OPLL的進展與椎間盤的異常應(yīng)力分布高度相關(guān)，韌帶骨化的進展最常分布于椎間盤拉伸扭曲區(qū)域。近年來，Sugita 等［27］對OPLL 患者術(shù)中標(biāo)本進行研究，發(fā)現(xiàn)Ihh 信號通路信號分子，如甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（PTHrP）和Y 染色體中性別決定區(qū)相關(guān)的高遷移率組框-9（SOX-9）等，在骨化組織及軟骨細胞中表達顯著增高。將骨化和無骨化患者后縱韌帶細胞置于應(yīng)力狀態(tài)下培養(yǎng)24 h 后進行微陣列分析，研究差異表達的基因，測序結(jié)果對比KEGG 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，和無骨化患者相比，骨化患者表達上調(diào)的24 個基因中有7 個（Ihh、SMO、PTCH1、PTCH2、Gli2、Gli3 及STK36）定位于Ihh 信號通路，且免疫組化染色結(jié)果顯示上述Ihh通路信號分子亦呈強陽性，佐證了生物信息分析結(jié)果。Zhang 等［28］將從OPLL 患者韌帶提取的細胞進行離體實驗發(fā)現(xiàn)，機械應(yīng)力同樣可以使OPLL 患者韌帶細胞內(nèi)波形蛋白表達顯著降低；siRNA 沉默波形蛋白亦導(dǎo)致骨鈣素（OCN）、堿性磷酸酶（ALP）和COL Ⅰ表達水平升高，因此，作者提出機械應(yīng)力刺激可降低波形蛋白的表達水平，進而促進細胞成骨分化引發(fā)OPLL。Chen等［29］和Shi等［30］的研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)Cx43 是機械應(yīng)力引起OPLL 的核心因子（圖1）。與非OPLL 人群相比，OPLL 患者韌帶Cx43 和磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（p-ERK）表達水平顯著上升，機械應(yīng)力通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)感受應(yīng)力變化并改變Cx43的表達水平，該蛋白通過p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、核因子-κB（NF-κB）和ERK 等信號通路誘導(dǎo)OPLL的發(fā)生。

圖1 機械應(yīng)力通過Cx43引起OPLL

亦有研究發(fā)現(xiàn)，機械應(yīng)力通過刺激ATP 產(chǎn)生和嘌呤受體高表達核結(jié)合因子α1（Cbfa1）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、結(jié)締組織生長因子、前列腺素I2（PGI2）、內(nèi)皮素-1（ET-1）和甲狀旁腺激素等引起OPLL或加速其進展［31-32］。

3 生物標(biāo)志物

Tsuji 等［33］對10 例OPLL 患者與10 例健康志愿者進行血漿代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，即使排除了糖尿病與高脂血癥患者，OPLL組血漿酰基肉堿、棕櫚酰肉堿、脂肪酸、甲狀腺素、硫脯氨酸、血磷濃度顯著高于對照組。Xu等［34］在分析OPLL患者韌帶組織樣本中miRNA表達差異的基礎(chǔ)上，對比miRNA在骨化與無骨化患者血清中的濃度發(fā)現(xiàn)，循環(huán)中miR-10a-5p、miR-563 和miR-210-3p 濃度 升 高對OPLL 有 指導(dǎo)診斷的價值。Tsuru 等［35］對OPLL 患者和健康受試者進行了血清蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，血小板前堿性蛋白配體7（CXCL7）濃度顯著降低，且CXCL7 基因敲除鼠脊柱韌帶亦出現(xiàn)骨化表型。Cai等［36］和Kawaguchi等［37］對比OPLL 患者與健康志愿者以及進展和無進展OPLL 患者血漿生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，OPLL 患者血清成纖維細胞生長因子-23（FGF-23）和超敏C 反應(yīng)蛋白（hs-CRP）水平更高，血磷值顯著降低，且骨化進展組FGF-23 和hs-CRP 濃度高于無進展組，表明磷代謝、炎性反應(yīng)及FGF-23 在某種程度上也參與OPLL的發(fā)生、進展。

Feng等［38］和Ikeda等［39］的研究發(fā)現(xiàn)，女性O(shè)PLL患者體內(nèi)瘦素濃度、瘦素/體質(zhì)量指數(shù)比值均高于無骨化組，且瘦素可直接促進間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化。Chen 等［40］也報道與對照組相比，OPLL患者瘦素在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均增高，并通過實驗論證了瘦素和機械應(yīng)力共同通過MAPK、JAK2-STAT3和PI3K/Akt 信號通路誘導(dǎo)韌帶細胞向成骨細胞分化，引起OPLL。關(guān)于血糖及胰島素水平與OPLL的發(fā)生是否相關(guān)尚無一致結(jié)論［36，41］，高濃度胰島素（1 000 mmol/L）可顯著提升BMP-2介導(dǎo)的ALP表達和激活，可能通過該途徑參與OPLL的發(fā)生、發(fā)展［42］。

有研究發(fā)現(xiàn)，OPLL患者腦脊液中IL-8［43］，透明質(zhì)酸（HA）［44］濃度顯著增高。亦有文獻報道OPLL患者LIM 礦化蛋白-1（LMP-1）［45］、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、伴肌動蛋白相關(guān)錨定蛋白、膽綠素還原酶B、COL6A1、骨硬化蛋白（SOST）、Dickkopf 相關(guān)蛋白1（DKK1）、衰老星形膠質(zhì)細胞特異性誘導(dǎo)物質(zhì)（OASIS）等含量改變［46-48］（表1）。

表1 OPLL 發(fā)病及進展相關(guān)生物標(biāo)志物

4 生活方式

除了上述因素，生活方式同樣與OPLL 發(fā)生相關(guān)。Chaput 等［49］對患者性別、年齡、血壓、臟器及皮下脂肪等進行評估發(fā)現(xiàn)，OPLL 與年齡和高血壓相關(guān)。Wang 等［50］的一項病例對照研究發(fā)現(xiàn)，高鹽飲食（OR=2.62）是OPLL 的危險因素，每日肉類攝入是OPLL 保護因素（OR=0.39），人群流行病學(xué)調(diào)查也有類似發(fā)現(xiàn)［50］。Washio 等［5］的研究發(fā)現(xiàn)，每天6 ～ 8 h 睡眠（OR=0.18）、按時就寢和起床等良好的睡眠習(xí)慣（OR=0.44）是OPLL 的保護因素；適量鍛煉、吸煙、飲酒等與OPLL的發(fā)生無相關(guān)性。

綜上，生活方式一定程度上參與了OPLL 的發(fā)生。但上述對OPLL患者生活方式的研究主要在日本進行，國內(nèi)也很有必要對國人生活方式與OPLL發(fā)生及進展之間的關(guān)系進行多中心、大樣本的研究。

5 總結(jié)與展望

OPLL 是一種以后縱韌帶進行性骨化壓迫脊髓和神經(jīng)根引起感覺、運動等功能障礙為特征的退行性疾病，其發(fā)病隱匿，病程后期輕微外力即可導(dǎo)致癱瘓等嚴(yán)重后果。OPLL形成原因尚無定論，其可能機制為在遺傳和非遺傳因素共同作用下，韌帶內(nèi)細胞成分成骨分化增強，啟動成骨相關(guān)過程，導(dǎo)致后縱韌帶骨化物形成。目前研究已發(fā)現(xiàn)大量OPLL 易感基因，并對其潛在的骨化形成機制進行了初步探究，同時對OPLL 非遺傳因素，如機械應(yīng)力及生物標(biāo)志物等的研究亦有長足的進展。

近年來，測序技術(shù)的進步及生物信息學(xué)的興起和普及為OPLL 病因?qū)W研究帶來了一系列新成果，該領(lǐng)域結(jié)合了測序、計算機、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等多學(xué)科，共同參與對OPLL 發(fā)生機制的探索。其通過計算機算法將高通量測序技術(shù)產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫進行比對挖掘OPLL 可能的發(fā)生機制，后續(xù)輔以實驗數(shù)據(jù)分析證實結(jié)果的可靠性，這一趨勢與國內(nèi)外生物信息學(xué)的飛速發(fā)展密切相關(guān)，為將來深入探究OPLL 發(fā)生機制及干預(yù)靶點提供了新思路與新方向。